Sıçan Spinal Dorsal Boynuzunda Kardiyak Kilitli Nöronal Yanıtlar Üzerine Somatik Stimülasyonun Kodlama Profillerinin İncelenmesi

Özet

Kardiyak kilitli spinal dorsal boynuz nöronlarının kardiyak fonksiyon kaydı ve analizinin yanı sıra spinal çok kanallı hücre dışı kayıt için bir protokol tanımladık. Bu yöntem, akupunkturun neden olduğu torasik viseral fonksiyonel değişikliklerin altında yatan omurga mekanizmalarını incelemek için zamansal olarak senkronize bir çerçeve sunar.

Özet

Birçok çalışma, elektroakupunkturun kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde ve önlenmesinde faydalı olabileceğini öne sürmüştür. Bununla birlikte, mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Torasik spinal dorsal boynuz (SDH), somatik ve viseral girdileri entegre etmede ve modüle etmede önemli bir rol oynar ve bu da daha sonra kardiyak kontrolü etkileyebilir. Kapsamlı bir şekilde çalışılmış olan lomber SDH'nin aksine, torasik SDH, cerrahi maruziyet ve stereotaksik fiksasyondaki zorluk nedeniyle daha az araştırılmıştır. Bu çalışmada, elektrokardiyogramların ve mikroelektrot dizilerinin kaydını birleştirerek nöronal aktiviteyi ve kardiyak fonksiyonu aynı anda izlemek için genel bir yaklaşım sunuyoruz. Ayrıca, kalp atışlarıyla senkronize olarak nöronal aktivitenin ateşleme hızı dağılımını hesaplayarak kardiyak kilitli nöronların nasıl tanımlanacağını açıklıyoruz. Strateji, kardiyovasküler fonksiyon ve nöronal aktivite arasındaki korelasyonun incelenmesinin yanı sıra periferik sinir stimülasyonları tarafından tetiklenen somatokardiyak refleksin anlaşılması için büyük önem taşımaktadır.

Giriş

Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) çerçevesinde öne çıkan bir terapötik teknik olan akupunktur veya vücut yüzeyi stimülasyonu, vücut yüzeyindeki belirli alanları uyararak çalışır. Afferent yollar, merkezi entegrasyon ve otonom efferent sinir mekanizmaları aracılığıyla viseral fonksiyonların düzenlenmesi yoluyla organizmanın işlevlerinin çok seviyeli düzenlenmesini kolaylaştırır. Bu tedavinin merkezinde, anatomik olarak tanımlanmış akupunktur noktalarının hedefe yönelik stimülasyonunun sistemik fizyolojik regülasyonu indüklediği kavramı yer almaktadır. Artan klinik kanıtlar, akupunkturun kardiyovasküler bozuklukların yönetiminde tamamlayıcı bir modalite olarak rolünü desteklemektedir ve hem birincil önleme hem de yardımcı tedavi protokollerinde etkinliği gösterilmiştir ^1,2.

Duyusal nöronların primer afferentleri ağırlıklı olarak spinal dorsal boynuzda (SDH) sonlanır, buna bağlı olarak spinal dorsal boynuz nöronları (SDHN'ler) somatik girdilerin entegrasyonu ve modülasyonunda çok önemli bir rol oynar ^3,4,5. Ayrıca, SDHRN'ler ayrıca kardiyak afferentleri alır ve kardiyovasküler modülasyon⁶ için spinal sempatik preganglionik nöronlara (SPN'ler) viseral bilgi iletir. Kardiyak kilitli SPN'ler, omuriliğin torasik segmentinin (T1-T5) lateral köşesinde bulunur, aksonlar servikal veya torasik gangliyonlara çıkıntı yapar ve daha sonra kardiyak, orta ve alt sinirler yoluyla kalbi innerve eder. Sonuç olarak, torasik omurilik, somatik ve viseral girdilerin entegrasyonunda ve modülasyonunda çok önemli bir rol oynar ve bu da daha sonra kardiyak kontrolü etkileyebilir. Bu nedenle, somatik stimülasyonun, omuriliğin torasik segmentindeki SDHRN'lerin modülasyonu yoluyla kardiyak fonksiyonu nasıl düzenlediğini anlamak önemlidir.

Önceki çalışmalar, PC6'daki elektroakupunkturun (T3 spinal segmentinde homotopik bir yapı-fonksiyon birimi olarak düzenlenmiştir) otonom sinir sisteminin^modülasyonu yoluyla miyokard iskemisi semptomlarını hafifletebileceğini göstermiştir ^7,8,9. Bununla birlikte, akupunkturun kalp atış hızı üzerindeki etkilerinin sinir sistemi aktivitesi ile gerçek zamanlı kantitatif senkronizasyonu henüz gerçekleştirilmemiştir. Akupunkturu takiben sadece acil otonomik sinir aktivitesi ve elektrokardiyogram (EKG) göstergeleri belgelenmiştir. SDHN'leri viseral fizyolojik fonksiyonlarla ilişkilendiren araştırmalar kıttır. Torasik omurların fizyolojik eğriliği ve komşu torasik vertebral segmentler, özellikle T1-T5 arasındaki dar boşluk nedeniyle, bu alanlara erişim zordur ve bu da KVH tedavisinde kardiyak fonksiyonu düzenleyen T3 spinal homotopik akupunktur noktası PC6'da akupunkturun altında yatan spinal mekanizmaları aydınlatmak için yetersiz doğrudan kanıt ile sonuçlanır.

SDH ile akupunktur aracılı kardiyak fonksiyon regülasyonu arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için, kardiyak fonksiyon ve nöral aktivitelerin senkron kaydının yapılması gerekmektedir. Burada, kardiyak fonksiyon kaydının yanı sıra kardiyak kilitli SDHRN'leri analiz etmenin yanı sıra spinal çok kanallı hücre dışı kayıt için genel bir yaklaşım sunacağız. Bu yöntem, akupunkturun neden olduğu torasik viseral fonksiyonel değişikliklerin altında yatan omurga mekanizmalarını incelemek için zamansal olarak senkronize bir çerçeve sunar.

Protokol

Hayvan deneyi protokolü, "Laboratuvar Hayvanlarının Refahının Etik İncelemesi için Kılavuz" (GB/T 35892-2018) ulusal standardının gerekliliklerine sıkı sıkıya bağlı kaldı ve kurumun Etik Kurulu tarafından onaylandı. Bu çalışmada 6-8 haftalık ve yaklaşık 220 g ağırlığındaki erkek SPF dereceli Sprague-Dawley (SD) sıçanları kullanıldı. Tüm deneyler sırasında laboratuvar önlükleri, eldivenler ve maskeler giyildi. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Deneyin son noktasında, sıçanlara derin anestezi altında kardiyak perfüzyon yoluyla ötenazi yapıldı ve ardından servikal çıkık yapıldı.

1. Ameliyat öncesi kurulum

1. Ventilatör devresini Y şeklindeki endotrakeal tüpe bağlayarak güvenli ve hava geçirmez bir arayüz sağlayın.
2. Ventilatör ekranında sabit hava akışını, uygun tidal hacmi ve solunum hızı ayarlarını onaylayarak uygun ventilasyonu doğrulayın.
3. Tüm segmentleri parlak aydınlatma altında görsel olarak inceleyerek boru içinde yoğuşma veya partikül kirleticilerin bulunmadığından emin olun.
4. Güçlendirilmiş EKG sinyallerini üç bir BNC konektörü kullanarak hem elektrokardiyograf girişine hem de mikroelektrot dizisi kayıt sisteminin analog giriş portuna aynı anda besleyin.
5. Elektrokardiyograf analog girişini ve mikroelektrot dizisi kayıt sisteminin analog giriş portunu aynı anda bağlamak için güçlendirilmiş sinyalleri üç bir BNC ayırıcıdan geçirin.
6. Elektrokardiyografın TTL çıkışını mikroelektrot dizisi kayıt sisteminin dijital girişine bağlayarak senkronizasyon tetikleyicileri oluşturun. BNC'den Dupont'a arabirim kablosu kullanarak, zamansal hizalamayı doğrulayarak her iki sistemde de eşzamanlı alımı başlatın.

2. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Anestezi
   1. İnhalasyon yoluyla% 3-5 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve daha sonra anestezi uygulanmış sıçana intraperitoneal pentobarbital sodyum (50 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın. Elektrotları yerleştirmeden önce inhalasyon anestezisi için izofluran uygulayın ve ~% 1.2'lik bir konsantrasyonu koruyun. Sadece aşağıdaki durumlarda devam edin: Devam etmeden önce anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak değerlendirin.
   2. Sıçanların ön boynundan ve arka sırtından kılları çıkarın.
   3. Fareyi sıcak bir battaniyenin üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve kurumasını önlemek için farenin gözlerine merhem sürün. Solunum hızını gözlemleyin ve forseps ile ayak tabanına baskı uygulayarak geri çekilme tepkilerini kontrol edin.

3. Trakeal entübasyon

1. Fareleri sırtüstü pozisyona getirin ve boyun bölgesini iyot tentürü ile dezenfekte edin.
2. Boynun orta hattı boyunca yaklaşık 1 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve kas dokusunu künt bir şekilde inceleyin.
3. Tiroid bezi açığa çıktığında, tiroid dokusuna zarar vermemeye dikkat ederek iki tiroid lobu arasındaki ince zarı dikkatlice ayırın. Trakeayı ortaya çıkarmak için devam edin.
4. Tamamen kuru olduğunu doğrulamak için "Y şeklindeki kanülü inceleyin. Trakeada enine bir kesi yapmak için yaylı makas kullanın, ardından kanülü trakeal açıklığa yerleştirin. Hava sızıntısını ve kazara ekstübasyonu önlemek için trakeal kanülü 3-0 emilemeyen dikişlerle sabitleyin.
5. Boyun kaslarını ve cildi dikkatlice dikin ve fareyi bir vantilatöre bağlayın. Sıçanın vücut ağırlığına⁷ göre solunum hızını 85 nefes/dk'ya ve tidal hacmi 3,5 mL'ye ayarlayın (Şekil 1B).

4. EKG algılama

1. Sıçanın derisine üç elektrot yerleştirin: pozitif elektrot sol alt ekstremiteye, negatif elektrot sağ üst ekstremiteye ve toprak elektrodu sağ alt ekstremite¹⁰.
2. Bir elektrokardiyograf kullanarak veri alın (filtre ayarları: 100 Hz'de düşük geçiş, 1 kHz'de yüksek geçiş; örnekleme frekansı: 4 kHz/s). Verileri kaydetmek, kaydetmek ve analiz etmek için EKG kayıt yazılımını kullanın.

5. İlaç uygulaması için perikardiyal kateterizasyon bradikinin (BK)

1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve göğsün üzerindeki cildi iyotla dezenfekte edin.
2. Timusu ortaya çıkarmak için sol üst göğüste 1. ve 3. kostal kıkırdaklar arasında torakotomi yapın. Perikard'ı ortaya çıkarmak için timusu orta hat boyunca künt bir şekilde inceleyin (bkz. Şekil 1C,D).
3. Perikardda küçük bir açıklık açmak için bir cam diseksiyon iğnesinin ucunu (0,5 mm çapında) kullanın.
4. Perikarddaki kesiden distal ucunda birkaç küçük delik bulunan 10-15 cm uzunluğunda bir silikon kateter yerleştirin. Kateteri biyoyapıştırıcı kullanarak göğüs duvarı dokusuna sabitleyin.
5. Göğüs boşluğunu katman katman kapatın ve farenin solunumunun engellenmediğinden emin olun (bkz. Şekil 1D).

6. T3 omuriliğinin maruz kalması

1. Fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve iyotla rutin dezenfeksiyon yapın. T2 ila T6 omurlarından sırtın orta hattı boyunca yaklaşık 8 cm'lik bir kesi yapın.
2. Trapez kası da dahil olmak üzere cilt ve kas katmanlarını kesmek için yaylı makas kullanın. Cerrahi alanı daha fazla ortaya çıkarmak için kaslar arasına bir ekartör yerleştirin.
3. Sıçanın torasik omurlarının ön tarafındaki yağ ve kış uykusu bezlerini, bezlerin altındaki kan damarlarından kaçınarak dikkatlice ayırın (bkz. Şekil 1E).
4. Baş kelepçesine ve uzun boyun kaslarının düz kısmına bağlanan kasları çıkarın ve T2'nin dikenli süreçlerini açığa çıkarın.
5. Vertebra kemerini T2'den T6'ya çıkarmak için semispinalis ve spinalis kaslarını yerinden çıkarın (bkz. Şekil 1E). T3 omurunun dikenli sürecini çıkarmak için rongeurs kullanın, böylece T3 omuriliğini açığa çıkarın.
   NOT: Torasik omurların açığa çıkarılması sürecinde, T3 omuriliğinin daha sonra maruz kalması için birincil kuvvet uygulama noktası olarak hizmet ettiğinden, T2'nin spinöz sürecinin korunmasına özel dikkat gösterildiğinden emin olun.
6. Dura mater ve araknoid membranı çıkarın ve spinal nöronların canlılığını korumak için omuriliğin yüzeyine parafin yağı damlatın (bkz. Şekil 1F).
   NOT: Sıçanın kahverengi yağ dokusunun kan damarları T3, T4 veya T5 laminasından kaynaklanır ve venöz sinüs gibi dağıtılır. Onlara dokunmamaya dikkat edin, çünkü bu farede aşırı kan kaybına neden olabilir.

7. Torasik omur fiksasyonu ve ayarları

1. T2 ve T6'nın eklem süreçlerini sabitlemek için özel bir spinal kelepçe kullanın. Hidrasyonu korumak için çevredeki kasları tuzlu suyla nemlendirin.
2. Elektrot dizisini stereotaktik bir aletin mikromanipülatörüne takın ve orta hatta 500 μm yanal, 1.500 μm derinliğe kadar dorsal medyan sulkus boyunca T3 omurga segmentindeki omuriliğin dorsal boynuzuna dikey olarak yerleştirin.
3. Referans elektrodu sırt kasına yerleştirin (bkz. Şekil 1G).
4. Çok kanallı hücre dışı kayıt yazılımını başlatın ve Dosya | Donanım yapılandırması; Cihaz arayüzü listesinden 32 kanal dizisini seçin; Seçilen kanal grubuna sağ tıklayın; ve ardından bağlam menüsünden Özellikler'i seçin. Sinyal işleme parametrelerini yapılandırın: Filtre sekmesi altında, bant geçiren filtreyi (BP) 250 Hz - 5 kHz olarak ayarlayın; Örnekleme Hızı alanına 30 kHz/s girin; Gerçek zamanlı ani artış sıralamasını ve eşik tabanlı olay ayıklamayı etkinleştirmek için Ani Artış İşlemeyi Etkinleştir etiketli kutuyu işaretleyerek ani artış algılama algoritmalarını etkinleştirin.
   NOT: Sonraki deneyler sırasında yer değiştirmeyi önlemek için, özellikle omurga fiksasyonu için özel omurga kelepçesinin uygulandığı bölgede, T2 ve T6'nın eklem süreçlerini çevreleyen kasların ve dokuların tam olarak temizlendiğinden emin olun.

8. Somatik ve BK uyaranları

1. Kardiyak nosiseptif stimülasyonu indüklemek için BK (damıtılmış suda 1 μg/mL) kullanın. Birkaç küçük açıklığı¹¹ olan bir silikon katetere bağlı bir mikro şırınga ile 4 μL BK solüsyonu enjekte edin.
2. Torasik omurilik dorsal boynuz nöronları arasındaki dinamik etkileşimleri belirlemek için enjeksiyondan sonraki 30 dakika içinde T3 omurilik sırt boynuzundaki kalp atış hızı değişikliklerini (artar veya azalır) ve nöronal boşalmayı (artar veya azalır) gözlemleyin.
3. 1 Hz'lik stimülasyon parametresini kullanarak akupunktur noktası PC6'da (MAPC6) manuel akupunktur gerçekleştirin. PC6 (Neiguan akupunktur noktası), ventral önkoldaki karpal eklemin 2 mm proksimalinde, fleksör carpi radialis ile median sinir gövdesi arasında bulunur. İğneleri (0.25 mm x 25 mm) ~3 mm derinlikte PC6 akupunktur noktalarına yerleştirin. Somatik uyaranlardan önce ve sonra nöronal aktivite ve kardiyak fonksiyondaki değişiklikleri karşılaştırın.

9. Veri analizi ve işleme

1. Kaydedilen nöral verileri ns6 formatında aşağıdaki yazılıma aktarın:
   1. Dosya Dönüştürme: Dosya | ns6 dosyasını yüklemek için açın. Dosya Seç | Farklı Kaydet'i tıklayın ve standartlaştırılmış ani artış treni verileri oluşturmak için .nex5 biçimini seçin.
   2. Spike Sıralama: Dönüştürülen .nex5 dosyalarını nöronal sınıflandırma için sınıflandırma yazılımına aktarın. Ani dalga formlarını, dalga biçimi özelliklerine ve temel bileşen analizine (PCA) dayalı olarak, eşik parametreleri temel gürültüden ±3 SD olarak ayarlanmış şekilde sıralayın.
   3. Ardından, sinyalleri filtrelemek ve kategorilere ayırmak için ilgili kodu yürütün.
2. Kardiyak kilitli SDRN'leri analiz edin.
   1. R dalgasını referans olay olarak alarak, her R dalgasından önce ve sonra 0,2 s'lik bir pencere içindeki nöron ateşlemelerinin sayısını sayın.
   2. R dalgalarını 50 ms aralıklarla saydıktan sonra, bir halka olayı histogramı oluşturun. Kalp atışı sırasında her bir nöronun aktivitesinin deşarj hızı dağılımını elde etmek için histogramı normalleştirin (yani, R dalgası olayından önce ve sonra 0,2 saniye içinde ortalama deşarj oranını çıkarın).
   3. 1.000 karıştırılmış yineleme ile uygulanan Monte Carlo¹² permütasyon testi ile istatistiksel anlamlılığı değerlendirin. Her kalp atışı R dalgasından önceki ve sonraki zamanın 0,2 saniyesini randomize ederek (aralık ± 0,1 saniyedir) randomize kalp atışı sürecinde nöronun ateşleme hızı dağılımını ve güven aralığını elde edin. Bir nöronun kalp atışının ateşleme dağılımı, randomize kalp atışı işleminin ateşleme hızı dağılımının %95 güven aralığını aşarsa (daha büyük veya daha az), nöronu kardiyak kilitli bir nöron olarak tanımlayın (bkz. Ek Dosya 1).

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolü takiben, perikardiyal / akupunktur noktası bölgelerine uygulanan bradikinin (BK) veya somatik iğneleme ile T3 SDHN'ler ortaya çıkarıldı. Bu araştırma, nosiseptif viseral giriş, BK uygulaması ve somatosensoriyel modülasyon sırasında uyaranla uyarılan nöronal aktivasyon profillerini (tip/frekans) ve eşzamanlı elektrokardiyografik (EKG) değişiklikleri ölçtü.

Şekil 2A, sıçanın T3 omuri...

Tartışmalar

SDH nöronal kodlama profillerinin kodunun çözülmesi, viseral disfonksiyon üzerinde akupunkturun neden olduğu terapötik etkinin nöromodülatör mekanizmasını anlamak için gereklidir. Burada, T3 SDHN'lerin ve EKG'nin deşarj aktivitesini eş zamanlı olarak kaydetmek için MEA in vivo kayıt tekniğini EKG kayıt sistemi ile birleştirdik. Kardiyak ağrı stimülasyonu, kalbi innerve eden ve nosiseptif bilgileri iç organlar, DRG, T1-T5 omurilik ve supraspinal kord yolu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT