Untersuchung der kodierenden Profile der somatischen Stimulation auf kardio-gesperrte neuronale Reaktionen im Spinalhorn der Ratte

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die extrazelluläre Aufzeichnung der spinalen Mehrkanal neben der Aufzeichnung der Herzfunktion und der Analyse der kardialgesperrten Neuronen des Spinalhorns. Diese Methode bietet einen zeitlich synchronisierten Rahmen für die Untersuchung der Wirbelsäulenmechanismen, die den durch Akupunktur induzierten viszeralen Funktionsveränderungen des Brustkorbs zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Viele Studien haben gezeigt, dass Elektroakupunktur bei der Behandlung und Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen von Vorteil sein kann. Sein Mechanismus ist jedoch nach wie vor wenig verstanden. Das thorakale Spinalhorn (SDH) spielt eine wichtige Rolle bei der Integration und Modulation somatischer und viszeraler Inputs, die dann die Herzsteuerung beeinflussen können. Im Gegensatz zur lumbalen SDH, die ausführlich untersucht wurde, wurde die thorakale SDH aufgrund der Schwierigkeit der chirurgischen Exposition und der stereotaktischen Fixierung weniger erforscht. In dieser Studie bieten wir einen allgemeinen Ansatz zur gleichzeitigen Überwachung der neuronalen Aktivität und der Herzfunktion, indem wir die Aufzeichnung von Elektrokardiogrammen und Mikroelektrodenarrays kombinieren. Darüber hinaus beschreiben wir, wie kardialgesperrte Neuronen identifiziert werden können, indem wir die Verteilung der Feuerrate der neuronalen Aktivität synchron mit dem Herzschlag berechnen. Die Strategie ist von großer Bedeutung für die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen kardiovaskulärer Funktion und neuronaler Aktivität sowie für das Verständnis des somatokardialen Reflexes, der durch periphere Nervenstimulationen ausgelöst wird.

Einleitung

Die Akupunktur oder Körperoberflächenstimulation als prominente therapeutische Technik im Rahmen der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) funktioniert durch die Stimulation bestimmter Bereiche auf der Körperoberfläche. Es ermöglicht die mehrstufige Regulation der Funktionen des Organismus durch die Regulierung der viszeralen Funktionen über afferente Bahnen, die zentrale Integration und autonome efferente Nervenmechanismen. Im Zentrum dieser Therapie steht das Konzept, dass die gezielte Stimulation von anatomisch definierten Akupunkturpunkten eine systemische physiologische Regulation induziert. Wachsende klinische Evidenz unterstützt die Rolle der Akupunktur als ergänzende Modalität bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wobei die Wirksamkeit sowohl in der Primärprävention als auch in ergänzenden Behandlungsprotokollen nachgewiesen^{wurde 1,2}.

Primäre Afferenzen sensorischer Neuronen enden überwiegend im Spinal-Hinterhorn (SDH), entsprechend spielen die Spinal-Hinterhorn-Neuronen (SDHNs) eine entscheidende Rolle bei der Integration und Modulation somatischer Inputs ^3,4,5. Darüber hinaus erhalten die SDHRNs auch kardiale Afferenzen und übermitteln viszerale Informationen an spinale sympathische präganglionäre Neuronen (SPNs) zur kardiovaskulären Modulation⁶. Die kardial-gesperrten SPNs befinden sich an der lateralen Ecke des thorakalen Segments des Rückenmarks (T1-T5), wobei Axone in die zervikalen oder thorakalen Ganglien projizieren und anschließend das Herz über den Herz-, Mittel- und unteren Nerv innervieren. Infolgedessen spielt das thorakale Rückenmark eine entscheidende Rolle bei der Integration und Modulation von somatischen und viszeralen Inputs, die dann die Herzsteuerung beeinflussen können. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie die somatische Stimulation die Herzfunktion durch Modulation der SDHRNs im thorakalen Segment des Rückenmarks reguliert.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Elektroakupunktur am PC6 (organisiert im T3-Wirbelsäulensegment als homotope Struktur-Funktions-Einheit) die Symptome der myokardialen Ischämie durch Modulation des autonomen Nervensystems lindern kann ^7,8,9. Eine quantitative Echtzeit-Synchronisierung der Auswirkungen der Akupunktur auf die Herzfrequenz mit der Aktivität des Nervensystems wurde jedoch noch nicht realisiert. Es wurden nur unmittelbare Indikatoren für die autonome nervöse Aktivität und das Elektrokardiogramm (EKG) nach der Akupunktur dokumentiert. Forschung, die SDHNs mit viszeralen physiologischen Funktionen in Verbindung bringt, ist nach wie vor spärlich. Aufgrund der physiologischen Krümmung der Brustwirbel und des engen Raums zwischen benachbarten Brustwirbelsegmenten, insbesondere T1-T5, ist der Zugang zu diesen Bereichen schwierig, was dazu führt, dass es kaum direkte Beweise für die Aufklärung der spinalen Mechanismen gibt, die der Akupunktur am homotopen Akupunktur T3 PC6 zugrunde liegen und die Herzfunktion bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen regulieren.

Um den Zusammenhang zwischen SDH und akupunkturvermittelter Herzfunktionsregulation besser zu verstehen, muss eine synchrone Aufzeichnung der Herzfunktion und der neuronalen Aktivitäten implementiert werden. In dieser Arbeit werden wir einen allgemeinen Ansatz für die extrazelluläre Aufzeichnung der spinalen Mehrkanal-Aufzeichnung neben der Aufzeichnung der Herzfunktion sowie der Analyse der kardial-gesperrten SDHRNs vorstellen. Diese Methode bietet einen zeitlich synchronisierten Rahmen für die Untersuchung der Wirbelsäulenmechanismen, die den durch Akupunktur induzierten viszeralen Funktionsveränderungen des Brustkorbs zugrunde liegen.

Protokoll

Das Tierversuchsprotokoll hielt sich strikt an die Anforderungen des nationalen Standards "Guidelines for Ethical Review of Welfare of Laboratory Animals" (GB/T 35892-2018) und wurde von der Ethikkommission der Institution genehmigt. In dieser Studie wurden männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit Lichtschutzfaktor im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von etwa 220 g verwendet. Bei allen Experimenten wurden Laborkittel, Handschuhe und Masken getragen. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt. Am Endpunkt des Experiments wurden die Ratten über eine Herzperfusion unter tiefer Narkose mit anschließender Zervixluxation euthanasiert.

1. Präoperative Einrichtung

1. Verbinden Sie den Beatmungskreislauf mit dem Y-förmigen Endotrachealtubus, um eine sichere und luftdichte Schnittstelle zu gewährleisten.
2. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Beatmung, indem Sie die Einstellungen für einen stabilen Luftstrom, das entsprechende Atemzugvolumen und die Atemfrequenz auf dem Display des Beatmungsgeräts bestätigen.
3. Stellen Sie sicher, dass sich keine Kondensat- oder Partikelverunreinigungen in den Schläuchen befinden, indem Sie alle Segmente bei heller Beleuchtung visuell untersuchen.
4. SpeisenSie die verstärkten EKG-Signale gleichzeitig über einen Drei-Wege-BNC-Anschluss sowohl in den Elektrokardiographeneingang als auch in den analogen Eingang des Mikroelektrodenarray-Aufzeichnungssystems ein.
5. Leiten Sie die verstärkten Signale über einen Drei-Wege-BNC-Splitter, um gleichzeitig den Analogeingang des Elektrokardiographen und den analogen Eingang des Mikroelektrodenarray-Aufzeichnungssystems zu verbinden.
6. Richten Sie Synchronisationsauslöser ein, indem Sie den TTL-Ausgang des Elektrokardiographen mit dem digitalen Eingang des Mikroelektrodenarray-Aufzeichnungssystems verbinden. Initiieren Sie mit einem BNC-zu-Dupont-Schnittstellenkabel die gleichzeitige Erfassung auf beiden Systemen, um die zeitliche Ausrichtung zu überprüfen.

2. Präoperative Vorbereitung

1. Betäubung
   1. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 3-5% Isofluran durch Inhalation und verabreichen Sie der anästhesierten Ratte dann eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg). Verabreichen Sie Isofluran für die Inhalationsanästhesie, bevor Sie die Elektroden platzieren, und halten Sie eine Konzentration von ~1,2% aufrecht. Fahren Sie nur fort, wenn Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen, bevor Sie fortfahren.
   2. Entferne die Haare am vorderen Hals und am hinteren Rücken der Ratten.
   3. Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf einer wärmenden Decke und tragen Sie Salbe auf die Augen der Ratte auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Beobachten Sie die Atemfrequenz und prüfen Sie, ob Entzugsreaktionen auftreten, indem Sie mit einer Pinzette Druck auf das Fußpolster ausüben.

3. Tracheale Intubation

1. Bringen Sie die Ratten in Rückenlage und desinfizieren Sie den Halsbereich mit Jodtinktur.
2. Führen Sie einen Längsschnitt von ca. 1 cm entlang der Mittellinie des Halses durch und präparieren Sie das Muskelgewebe stumpf.
3. Sobald die Schilddrüse freigelegt ist, trennen Sie vorsichtig die dünne Membran zwischen den beiden Schilddrüsenlappen und achten Sie darauf, das Schilddrüsengewebe nicht zu beschädigen. Fahren Sie mit der Freilegung der Luftröhre fort.
4. Untersuchen Sie die "Y-förmige Kanüle, um zu bestätigen, dass sie vollständig trocken ist. Machen Sie mit einer Federschere einen Querschnitt in die Luftröhre, gefolgt vom Einführen der Kanüle in die Trachealöffnung. Sichern Sie die Trachealkanüle mit 3-0 nicht resorbierbaren Nähten, um ein Austreten von Luft und eine versehentliche Extubation zu verhindern.
5. Nähen Sie vorsichtig die Halsmuskulatur und die Haut und schließen Sie die Ratte an ein Beatmungsgerät an. Passen Sie die Atemfrequenz auf 85 Atemzüge/min und das Atemzugvolumen auf 3,5 ml an, entsprechend dem Körpergewicht der Ratte⁷ (Abbildung 1B).

4. EKG-Erkennung

1. Führen Sie drei Elektroden in die Haut der Ratte ein: die positive Elektrode in die linke untere Extremität, die negative Elektrode in die rechte obere Extremität und die Masseelektrode in die rechte untere Extremität¹⁰.
2. Erfassen Sie Daten mit einem Elektrokardiographen (Filtereinstellungen: Tiefpass bei 100 Hz, Hochpass bei 1 kHz; Abtastfrequenz: 4 kHz/s). Verwenden Sie EKG-Aufzeichnungssoftware, um Daten aufzuzeichnen, zu speichern und zu analysieren.

5. Perikardkatheterisierung zur medikamentösen Verabreichung Bradykinin (BK)

1. Legen Sie die Ratte in Rückenlage und desinfizieren Sie die Haut auf der Brust mit Jod.
2. Führen Sie eine Thorakotomie zwischen dem 1. und 3. Rippenknorpel an der linken oberen Brust durch, um den Thymus freizulegen. Präparieren Sie den Thymus stumpf entlang der Mittellinie, um das Perikard freizulegen (siehe Abbildung 1C,D).
3. Mache mit der Spitze einer Glaspräpariernadel (0,5 mm Durchmesser) eine kleine Öffnung im Perikard.
4. Führen Sie einen Silikonkatheter von 10-15 cm Länge mit mehreren kleinen Löchern an seinem distalen Ende durch den Schnitt im Perikard ein. Befestigen Sie den Katheter mit Biokleber an der Brustwand.
5. Schließen Sie die Brusthöhle Schicht für Schicht, um sicherzustellen, dass die Atmung der Ratte ungehindert bleibt (siehe Abbildung 1D).

6. Freilegung des T3-Rückenmarks

1. Bringen Sie die Ratte in Bauchlage und führen Sie eine routinemäßige Desinfektion mit Jod durch. Machen Sie einen Schnitt von ca. 8 cm entlang der Mittellinie des Rückens von den Wirbeln T2 bis T6.
2. Schneide mit einer Federschere durch die Haut- und Muskelschichten, einschließlich des Trapezmuskels. Führen Sie einen Retraktor zwischen die Muskeln ein, um das Operationsfeld weiter freizulegen.
3. Trennen Sie vorsichtig die Fett- und Winterschlafdrüsen an der vorderen Seite der Brustwirbel der Ratte und vermeiden Sie dabei die Blutgefäße unter den Drüsen (siehe Abbildung 1E).
4. Entfernen Sie die Muskeln, die an der Kopfklemme befestigt sind, und den geraden Teil der langen Nackenmuskulatur, wodurch die Dornfortsätze von T2 freigelegt werden.
5. Verschieben Sie die Muskeln semispinalis und spinalis, um den Wirbelbogen von T2 nach T6 freizulegen (siehe Abbildung 1E). Verwenden Sie Rongeure, um den Dornfortsatz des T3-Wirbels zu entfernen und dadurch das T3-Rückenmark freizulegen.
   HINWEIS: Während des Prozesses der Freilegung der Brustwirbel ist darauf zu achten, dass der Dornfortsatz von T2 erhalten bleibt, da er als primärer Krafteinwirkungspunkt für die spätere Freilegung des T3-Rückenmarks dient.
6. Entfernen Sie die Dura mater und die Arachnoidalmembran und tropfen Sie Paraffinöl auf die Oberfläche des Rückenmarks, um die Lebensfähigkeit der Spinalneuronen zu erhalten (siehe Abbildung 1F).
   HINWEIS: Die Blutgefäße des braunen Fettgewebes der Ratte entspringen an der Lamina T3, T4 oder T5 und sind wie ein venöser Sinus verteilt. Achten Sie darauf, sie nicht zu berühren, da dies bei der Ratte zu übermäßigem Blutverlust führen kann.

7. Fixierung und Einstellung der Brustwirbel

1. Verwenden Sie eine spezielle Wirbelsäulenklemme, um die Gelenkfortsätze von T2 und T6 zu sichern. Befeuchten Sie die umliegenden Muskeln mit Kochsalzlösung, um die Flüssigkeitszufuhr aufrechtzuerhalten.
2. Befestigen Sie das Elektrodenarray an dem Mikromanipulator eines stereotaktischen Instruments und führen Sie es senkrecht in das Hinterhorn des Rückenmarks am Wirbelsäulensegment T3 durch den Sulcus medianus dorsal, 500 μm lateral der Mittellinie, bis zu einer Tiefe von 1.500 μm ein.
3. Führen Sie die Referenzelektrode in den Rückenmuskel ein (siehe Abbildung 1G).
4. Starten Sie die extrazelluläre Mehrkanal-Aufzeichnungssoftware und navigieren Sie zu Datei | Hardware-Konfiguration; Wählen Sie das 32-Kanal-Array aus der Liste der Geräteschnittstelle aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die ausgewählte Kanalgruppe. und wählen Sie dann Eigenschaften aus dem Kontextmenü . Konfigurieren der Signalverarbeitungsparameter: Stellen Sie auf der Registerkarte Filter den Bandpassfilter (BP) auf 250 Hz - 5 kHz ein. Geben Sie im Feld "Abtastrate " 30 kHz/s ein. Aktivieren Sie Spike-Erkennungsalgorithmen, indem Sie das Kontrollkästchen Spike-Verarbeitung aktivieren aktivieren, um die Echtzeit-Spike-Sortierung und die schwellenwertbasierte Ereignisextraktion zu aktivieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Muskeln und das Gewebe, die die Gelenkfortsätze von T2 und T6 umgeben, vollständig entfernt sind, insbesondere in dem Bereich, in dem die benutzerdefinierte Wirbelsäulenklemme zur Wirbelsäulenfixierung angewendet wird, um eine Verschiebung bei nachfolgenden Experimenten zu verhindern.

8. Somatische und BK-Reize

1. Verwenden Sie BK (1 μg/ml in destilliertem Wasser), um eine nozizeptive Stimulation des Herzens zu induzieren. 4 μl der BK-Lösung werden mit einer Mikrospritze injiziert, die mit einem Silikonkatheter mit mehreren kleinen Öffnungen verbunden ist¹¹.
2. Beobachten Sie Veränderungen der Herzfrequenz (Erhöhungen oder Abnahmen) und neuronale Entladungen (Zu- oder Abnahmen) im Hinterhorn des T3-Rückenmarks innerhalb von 30 Minuten nach der Injektion, um dynamische Wechselwirkungen zwischen Neuronen des thorakalen Rückenmarks und des Hinterhorns zu identifizieren.
3. Führen Sie die manuelle Akupunktur am Akupunktur PC6 (MAPC6) mit dem Stimulationsparameter 1 Hz durch. PC6 (Neiguan-Akupunkturpunkt) befindet sich 2 mm proximal des Karpalgelenks am ventralen Unterarm, zwischen dem Flexor carpi radialis und dem Stamm des Nervus medianus. Führen Sie die Nadeln (0,25 mm x 25 mm) in einer Tiefe von ~3 mm in die PC6-Akupunkturpunkte ein. Vergleichen Sie die Veränderungen der neuronalen Aktivität und der Herzfunktion vor und nach den somatischen Reizen.

9. Datenanalyse und -verarbeitung

1. Importieren Sie die aufgezeichneten neuronalen Daten im ns6-Format wie folgt in die Software:
   1. Dateikonvertierung: Navigieren Sie zu Datei | Öffnen , um die ns6-Datei zu laden. Wählen Sie Datei | Speichern unter und wählen Sie das .nex5-Format, um standardisierte Spike-Train-Daten zu generieren.
   2. Spike Sorting: Importieren Sie die konvertierten .nex5-Dateien in die Klassifikationssoftware für die neuronale Klassifikation. Sortieren Sie Spike-Wellenformen basierend auf den Wellenformeigenschaften und der Hauptkomponentenanalyse (PCA), wobei die Schwellenwertparameter auf ±3 SD vom Basislinienrauschen festgelegt sind.
   3. Führen Sie dann den entsprechenden Code zum Filtern und Kategorisieren der Signale aus.
2. Analysieren Sie kardialgesperrte SDRNs.
   1. Nimmt man die R-Welle als Referenzereignis, zählt man die Anzahl der Neuronenfeuerungen innerhalb eines Zeitfensters von 0,2 s vor und nach jeder R-Welle.
   2. Nachdem Sie die R-Wellen in Intervallen von 50 ms gezählt haben, erstellen Sie ein Ringereignis-Histogramm. Normalisieren Sie das Histogramm (d. h. subtrahieren Sie die durchschnittliche Entladungsrate in 0,2 s vor und nach dem R-Wellen-Ereignis), um die Verteilung der Entladungsrate der Aktivität jedes Neurons während des Herzschlags zu erhalten.
   3. Bewerten Sie die statistische Signifikanz mithilfe von Monte-Carlo-12-Permutationstests, die mit 1.000 gemischten Iterationen implementiert wurden. Ermitteln Sie die Verteilung der Feuerungsrate und das Konfidenzintervall des Neurons im Prozess des randomisierten Herzschlags, indem Sie 0,2 s der Zeit vor und nach jeder Herzschlag-R-Welle randomisieren (der Bereich beträgt ± 0,1 s). Wenn die Feuerverteilung des Herzschlags eines Neurons das 95%-Konfidenzintervall der Feuerratenverteilung des randomisierten Herzschlagprozesses überschreitet (größer oder kleiner als), identifizieren Sie das Neuron als kardialgesperrtes Neuron (siehe Zusatzdatei 1).

Ergebnisse

Gemäß dem oben genannten Protokoll wurden die T3-SDHNs exponiert, wobei Bradykinin (BK) oder somatisches Needling an die Perikard-/Akupunkturregionen verabreicht wurde. Diese Untersuchung quantifizierte stimulusevozierte neuronale Aktivierungsprofile (Typ/Frequenz) und gleichzeitige elektrokardiographische (EKG) Veränderungen während des nozizeptiven viszeralen Inputs, der BK-Anwendung und der somatosensorischen Modulation.

Abbildung 2...

Diskussion

Die Entschlüsselung von SDH-Neuronalkodierungsprofilen ist essentiell für das Verständnis des neuromodulatorischen Mechanismus der Akupunktur-induzierten therapeutischen Wirkung auf viszerale Dysfunktion. Hier haben wir die MEA in vivo Aufzeichnungstechnik mit dem EKG-Aufzeichnungssystem kombiniert, um gleichzeitig die Entladungsaktivität der T3 SDHNs und des EKGs aufzuzeichnen. Die kardiale Schmerzstimulation kann Typ-C-Nozizeptoren aktivieren, die das Herz innervieren und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT