JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا للتحليل البروتيني للكلية بأكملها ، والنبيبات القشرية المعزولة ، والبروتينات النخاعي. تقارن الدراسة أيضا البروتينات الإقليمية في نموذج الفئران السكري والفئران غير السكرية.

Abstract

يعد تحديد تسلسل الأحداث في أمراض الكلى حجر الزاوية في الممارسة السريرية في مجموعة أدوات أمراض الكلى. تعد التحليلات البروتينية للأنسجة نهجا مهما لفهم العمليات الفسيولوجية والجزيئية الأساسية للفيزيولوجيا المرضية الكلوية. ستسمح الطرق والبروتوكولات التي نقدمها هنا بالتشريح الجزيئي للكلية في كل منطقة محددة ذات أهمية تتعلق بعواقب المرض. لتحديد آثار المرض على مناطق وهياكل معينة من الكلى ذات الوظائف الفريدة ، تتمثل أهداف هذا البروتوكول في إظهار تجزئة الكلى المبسطة للفأر وعزل النبيبات القشرية الكلوية جنبا إلى جنب مع تدفقات عمل البروتينات الكمية المبسطة الخالية من الملصقات. سيساعد الجمع بين هذه الأساليب في تحديد الأنماط الجزيئية المضطربة في الكلى بأكملها ، والمقصورات النخاعية ، وهياكل الأنابيب القشرية للكلى ، مع الهدف النهائي والنهائي المتمثل في البروتينات أحادية الخلية في السياقات المرضية. سيكون تطبيق هذه الأساليب في أي نموذج مرضي تقريبا مفيدا في تحديد آليات علم الأمراض المتعلقة بضعف الكلى.

Introduction

يعد مرض الكلى المزمن (CKD) مصدر قلق كبير في الطب الحديث ، حيث يصل إلى أكثر من 86 مليار دولار من نفقات الرعاية الصحية في الولايات المتحدة وحدها1. في جميع أنحاء العالم ، يتزايد معدل الإصابة بمرض الكلى المزمن مع انتشار مرض السكري والأمراض المصاحبة للكلى المرتبطة به. ما يقرب من 14٪ من سكان الولايات المتحدة مصابون بمرض الكلى المزمن (التقرير السنوي USRDS 2024). علاوة على ذلك ، فإن اعتلال الكلية السكري هو شكل من أشكال مرض الكلى المزمن والسبب الرئيسي لمرض الكلى في المرحلة النهائية (ESRD) ، و 60٪ من مرضى ESRD يعانون من مرض السكري1،2،3. يؤثر مرض السكري على جميع هياكل الكلى وأنواع خلايا النيفرون ، الوحدة الوظيفية للكلى. كما هو موضح في الشكل 1 ، توجد أجزاء مختلفة من النيفرون في مناطق قشرة الكلى والنخاع. تتكون غالبية الكلى من الأنابيب. يساهم الخلل الوظيفي في النبيبات الكلوية والآفات الهيكلية بشكل كبير في تطور اعتلال الكلية السكري (DN) ، وترتبط هذه التغييرات بشكل جيد بمعدل انخفاض وظائف الكلى4،5،6،7،8. في وقت مبكر من مرض السكري ، استجابة لزيادة امتصاص الجلوكوز وما يرتبط به من صوديوم ومتطلبات بروتين نقل الغشاء في جميع قطاعات الأنابيب ، تخضع الأنابيب لتضخم. مع زيادة إصابة الأوعية الدموية الدقيقة في وقت لاحق من مرض السكري ، تظهر الأنابيب ضمور وتمدد ، بينما يوجد تليف وتوسع في النسيجالخلالي 9. وجدت الدراسات السابقة من مختبرنا أن البروتينات المتغيرة ووفرة من بروتينات الاستجابة للإجهاد في الأنابيب القشرية للفئران المصابة بالسكري10،11. النخاع مهم لتنظيم تركيز البول ، ويرتبط الخلل الوظيفي أثناء أمراض الكلى بالإجهاد التأكسدي ، حيث يؤدي مرض السكري إلى انخفاض توتر الأكسجين في هذه المنطقة من الكلى بسبب زيادة استهلاك الأكسجين من أنشطة التمثيل الغذائي ، وزيادة نشاط بروتينات نقل الغشاء ، وإصابة الأوعية الدموية الدقيقة12،13،14.

يعد فهم الآليات التفصيلية لتطور وتطور DN جهدا مستمرا سيتطلب مناهج جديدة ومتكاملة تستدعي نمذجة المرض والتنميط الجزيئي لعمليات الإشارات ، والتغيرات التكيفية في ديناميكيات البروتين الخلوي ، والتعريف الدقيق للخلايا الكلوية ومكونات الأنسجة المتأثرة بالإصابة في الحالات المزمنة. توفر البروتينات والتمثيل الغذائي والنسخ إمكانية التحقيق التحليلي للآليات الجزيئية لأمراض الكلى. Omics هو مجال جديد نسبيا يستخدم مناهج بيولوجيا الأنظمة لاكتساب فهم أكثر عالمية للأنظمة البيولوجية. كانت البروتينات أداة قوية من Omics في أمراض الكلى في العقود الأخيرة. توسعت أبحاث المؤشرات الحيوية خلال السنوات العشرين الماضية ، كما يتضح من النمو في المنشورات ، على الرغم من ضرورة العمل المكثف لتنفيذ هذه النتائج بالكامل في العيادة15. مع اختلاف مجموعات خلايا الأنابيب والأدوار الوظيفية الخاصة بها داخل القشرة الكلوية والنخاع ، يمكن للتحليل البروتيني للكلى بأكملها إخفاء التغييرات الفريدة المرتبطة بهياكل محددة داخل هذه المناطق المختلفة. لذلك ، فإن أهداف هذه الدراسة هي إثبات فصل القشرة الكلوية والنخاع ، وكذلك فصل الأنابيب القشرية عن الكبيبات ، تليها بروتوكولات مفصلة لتحضير مستخلصات البروتين من الهياكل المعزولة لقياس الطيف الكتلي الحديث وتحليلات المعلوماتية الحيوية. تعتبر نماذج الفئران لاعتلال الكلية السكري مفيدة في تحديد آليات تطور المرض. في هذه الدراسة ، استخدمنا الفأر المعدل وراثيا OVE26 ، والذي يصاب بمرض السكري من النوع الأول المبكر ويظهر ميزات DN في المرحلة المبكرة والمتأخرة لدى البشر ، بما في ذلك 1) الارتفاع المبكر والانخفاض اللاحق في معدل الترشيح الكبيبي ، 2) تضخم الكلى ، 3) سماكة الغشاء القاعدي الكبيبي والتمدد المتوسط ، 4) البيلة البروتينية الشديدة ، و 5) التليف الخلاليالأنبوبي 9 ، 16،17. تم اختيار الفئران البالغة من العمر شهرين لإظهار التغيرات البروتينية في مقصورات الأنابيب قبل الآفات الهيكلية العلنية. كما ذكرنا سابقا وموضحا في الشكل 2 ، تظهر الفئران OVE26 البالغة من العمر شهرين توسعا في المصفوفة المتوسطة الكبيبية (الشكل 2 ، السهم الأخضر) والبيلة البروتينيةالشديدة 17 ، دون تغييرات نسيجية علنية في الأنابيب القريبة (الشكل 2 ، السهم الأصفر) في الفئران الصغيرة المصابة بالسكري. نقدم هنا نهجا مشتركا للبروتينات الكمية لتوصيف الكلى بأكملها ، والنخاع ، والأنابيب القشرية لتوضيح وتوضيح الاختلافات في البروتين في كل حجرة مصابة بمرض السكري.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسات التي أجريت على الفئران OVE26 و FVB من قبل إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة لويزفيل (IACUC). أنثى معدلة وراثيا OVE26 (مرضى السكري ؛ سلالة #: 005564) و FVB (غير مرضى السكري ؛ سلالة الخلفية ؛ سلالة #: 001800) تم شراء الفئران من مختبرات جاكسون (بار هاربور ، مي). تم الحفاظ على في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة عند 25 درجة مئوية ، وتم منحها حرية الوصول إلى الماء والغذاء. أجريت جميع الدراسات على الفئران البالغة من العمر شهرين.

1. نموذج

  1. عزل الكلى
    1. تخدير الفئران عن طريق إعطاء 80 مجم / كجم من الكيتامين و 12 مجم / كجم زيلازين داخل الصفاق.
    2. قم بعمل شق في البطن في خط الوسط بمقص جراحي صغير وحرك الأمعاء برفق إلى جانب الفأر باستخدام مسحات لكشف الوريد الأجوف.
    3. قم بعمل قطع صغير في الوريد الأجوف فوق الكلية اليمنى.
    4. قم بنقخ الفأر من خلال البطين الأيسر ب 20 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS: درجة الحموضة 7.4 ؛ 210 مجم / لتر KH2PO4 ، 9 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 726 مجم / لتر Na2HPO4 ·7H2O) باستخدام مضخة تمعجية بمعدل 10 مل / دقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة غير مطلوبة إذا لم يكن إدراج بروتينات الدم وخلاياها في الكلى عاملا حاسما في التحليلات النهائية.
    5. إزالة الكلى باستخدام مقص جراحي صغير. قم بإزالة أي دهون زائدة من خارج الكلى. قم بوزن الكلى وضعها في PBS بارد على الثلج.
    6. قم بإزالة كبسولة الكلى.
    7. ضع الكلى على طبق زجاجي أو طبق بتري على الثلج. قم بعمل عدة قطع عرضية عبر الكلى باستخدام شفرة حلاقة (الشكل 3) لينتهي بك الأمر ب 3-4 شرائح بين القطبين العلوي والسفلي من الكلى.
    8. احتفظ ب 1-2 شريحة متوسطة والقطبين (شرائح الكلى المحاطة بدائرة في الشكل 3) من كل كلية جانبا لتكون بمثابة عينات "كلية كاملة". ضع جزءا في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل وأضف مخزن التجانس المثلج البارد (10٪ جلسرين ، 50 ملي هيبس ، 100 ملي كولينوريد ، 2 ملي EDTA ، 0.1٪ NP40 ، 10 ملي NaF ، 0.25 ملي NaVO3 ، 1x مثبط البروتياز HALTS) عند حوالي 10 ميكرولتر / مجم من عينة الأنسجة (بناء على الكتلة المقدرة لشرائح الكلى ، المشتقة من وزن الكلى المكتسب). اترك الأنبوب على الجليد.
    9. بالنسبة لبقية الشرائح المستعرضة الوسطى ، ضع الشريحة بشكل مسطح وقم بتقطيع القشرة بعناية (الخارجية 1 مم) من كل شريحة باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط (الشكل 3 ، سير العمل التخطيطي). حافظ على القشرة منفصلة عن مناطق النخاع لبروتوكول عزل النبيبات القشرية (أدناه ، الخطوة 1.3).
    10. ضع جزءا من النخاع المفصل في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وأضف مخزن التجانس البارد كما في الخطوة 1.1.8 ، واترك الأنبوب على الجليد.
    11. قم بتجميد جميع الكلى الكاملة المتبقية وقطع النخاع في النيتروجين السائل وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  2. بدلا من ذلك ، قم بتجميد جميع أجزاء الكلى والنخاع الكاملة المنفصلة وتخزينها كما هو موضح في الخطوة 1.1.11. قم بإزالتها من التخزين في وقت لاحق لإضافة المخزن المؤقت للتجانس كما في الخطوة 1.1.8.
  3. عزل النبيبات القشرية
    1. افرم القشرة المقطعة إلى قطع 1-3 مم على طبق زجاجي أو طبق بتري بشفرة حلاقة لتشكيل عجينة.
    2. هضم القشرة المفرومة في 1 مل من نوع الكولاجيناز IA (1 مجم / مل) لمدة 30 دقيقة ، عند 37 درجة مئوية ، في حمام مائي هزاز.
    3. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل على الجليد.
    4. ضع المعلق القشري المهضوم على مصفاة الخلية 100 ميكرومتر واضغط برفق من خلال المصفاة باستخدام مكبس حقنة سعة 10 مل. اغسل الجزء العلوي من المصفاة ب 1 مل من PBS والجانب السفلي من المصفاة ب 1 مل من PBS.
    5. مرر المرشح في أنبوب 50 مل من خلال مصفاة إضافية سعة 100 ميكرومتر ، ثم اغسل الجزء العلوي من المصفاة ب 1 مل من PBS.
    6. مرر المرشح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل على الجليد. سوف تمر الأنابيب عبر هذه المصفاة إلى المرشح (سيتم الاحتفاظ بالكبيبات على مصفاة 70 ميكرومتر). اغسل المصفاة ب 1 مل من PBS.
    7. قم بتدوير المرشح النهائي عند 120 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من PBS الزائد من حبيبات الأنبوب.
    8. تحقق من نقاء حبيبات النبيبات القشرية عن طريق التصور تحت المجهر, باستخدام هدف 10x. إذا كان أكثر من 10٪ من الكسر يحتوي على الكبيبات ، فأعد تعليق المرشح ب 1 مل من PBS وقم بالمرور عبر مصفاة خلية نظيفة 70 ميكرومتر دون أي غسل إضافي للمصفاة.
    9. قم بتوزيع جزء النبيبات المخصب في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل وتدور عند 2000 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    10. أضف مخزن التجانس إلى حبيبات النبيبات كما هو الحال مع الكلية بأكملها والنخاع (الخطوتان 1.1.8 و 1.1.10).
  4. تجانس الأنسجة / استخراج البروتين
    1. قم بتجانس كل نوع من أنواع العينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام مدقة بلاستيكية مخصصة لأنابيب 1.5 مل. إذا كان التعليق المتجانس سميكا جدا ، فأضف مخزن مؤقت إضافي للتجانس حسب الحاجة.
    2. اترك التعليق المتجانس على الجليد لمدة 15 دقيقة متبوعا بالصوتنة لمدة 5 دقائق في سونيكاتر الحمام (مفتاح التشغيل / الإيقاف فقط ، لا توجد إعدادات قابلة للتعديل على الوحدة) ، مع الماء في الحمام عند 25 درجة مئوية. اترك العينات على الثلج لمدة 10 دقائق.
    3. تتجانس الدوامة لفترة وجيزة (1000-1500 دورة في الدقيقة) ، ثم تتجانس 20 مرة باستخدام ماصة وتترك على الجليد لمدة 15 دقيقة أخرى.
    4. قم بترتيبول العينات عدة مرات قبل الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. نقل مستخلصات البروتين التي تم تطهيرها إلى أنابيب نظيفة.
    6. Aliquot 30 ميكرولتر من المستخلص المقشر لتقدير البروتين وإعداد العينة لتحليل قياس الطيف الكتلي. قم بتخزين باقي العينات عند -80 درجة مئوية.

2. بروتوكول هضم عمود الدوران الصغير Suspension-Trap

  1. الهضم المحلل للبروتينات إلى شظايا تربتية لتحليلات البروتينات
  2. تمييع ~ 40-50 ميكروغرام من العينة (عند ~ 2 ميكروغرام / ميكرولتر) في مخزن تحلل العينة (10٪ وزن / حجم كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS] في 100 ملي مولار ثلاثي إيثيل أمونيوم بيكربونات (TEA-BC) درجة الحموضة 8.5 ، 40 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين [TCEP]) إلى حجم نهائي يبلغ 46 ميكرولتر.
  3. تقليل وأكلة البروتينات
    1. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (التركيز النهائي ل TCEP هو 20 ملليمتر).
    2. أضف 4 ميكرولتر من 0.5 M يودوأسيتاميد في ماء من درجة قياس الطيف الكتلي للألوان السائلة (LC-MS) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام لمدة 30 دقيقة (التركيز النهائي لليودوأسيتاميد هو 40 مليمتر).
  4. أضف 5 ميكرولتر من 12٪ وزن / وزن حمض الفوسفوريك في ماء بدرجة LC-MS (قم بتخفيف 141 ميكرولتر من 85٪ حمض الفوسفوريك إلى 859 ميكرولتر من الماء لمحلول 12٪).
    1. بديل لحمض الفوسفوريك ، استخدم حمض ثلاثي فلورو أسيتيك أو حمض الفورميك في حالة إجراء تخصيب الفوسفوببتيد18.
  5. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط مصيدة التعليق (100 ملي مولار من TEA-BC في 90٪ حجم / حجم الميثانول / 10٪ حجم / حجم الماء الرقم الهيدروجيني 7.55).
  6. إضافة عينة إلى عمود التعليق والمراكب اللونية. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 30 ثانية عند RT في دوار بزاوية ثابتة لتمرير كل حجم عبر العمود.
  7. يغسل ب 4 × 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط مصيدة التعليق. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 30 ثانية عند RT في دوار بزاوية ثابتة لتمرير كل غسيل عبر العمود.
    ملاحظة: للمساعدة في إزالة SDS ، قم بتدوير العمود في الدوار 180 درجة بعد كل غسلة.
  8. جهاز طرد مركزي بوزن 4,000 جم لمدة 1 دقيقة عند RT لإزالة عازلة الربط تماما (يمنع التنقيط أثناء الهضم).
  9. انقل عمود مصيدة التعليق إلى أنبوب تجميع نظيف.
  10. أضف 2.5-5 ميكروغرام من التربسين في 125 ميكرولتر من 50 ملي مولار من الشاي - BC درجة الحموضة 8.5 في ماء من الدرجة LC-MS (التربسين بروتياز ، درجة MS). النسبة النهائية للتربسين إلى العينة هي 1:20 حتى 1:10.
  11. احتضن عند 47 درجة مئوية لمدة ساعتين (لا تشد الغطاء ؛ يفضل ضبط الخلاط الحراري عند 0 دورة في الدقيقة). قد يؤدي إحداث ثقب في الغطاء بإبرة إلى منع الضغط من التراكم في الغرفة العلوية لمصيدة التعليق (سيؤدي الضغط المتزايد إلى تقطير محلول التربسين عبر العمود).
  12. أضف 80 ميكرولتر من 50 ملي مولار من الشاي - BC الرقم الهيدروجيني 8.5 في ماء LC-MS. جهاز طرد مركزي عند 4,000 جم عند RT لمدة 1 دقيقة في دوار بزاوية ثابتة لتمرير كل ملخص عبر العمود.
  13. أضف 80 ميكرولتر من 0.2٪ v / v حمض الفورميك في ماء LC-MS. جهاز طرد مركزي بوزن 4,000 جم لمدة دقيقة واحدة في RT في دوار بزاوية ثابتة لتجميعه مع الهضم من الخطوة 2.11.
  14. أضف 80 ميكرولتر من 50٪ من حجم / حجم الأسيتونيتريل في ماء من الدرجة LC-MS. جهاز طرد مركزي عند 4,000 جم عند RT لمدة 1 دقيقة في دوار بزاوية ثابتة لتجميعه مع الهضم من الخطوة 2.11.
  15. قم بتخزين مصيدة التعليق عند -80 درجة مئوية.
  16. جفف العينة في مكثف فراغ.
  17. قم بتخزين العينة المجففة عند -80 درجة مئوية.

3. التنظيف باستخدام عمود التوازن المحب للماء والدهون (HLB)

  1. اصنع المحاليل A (2٪ v / v acetonitrile / 0.1٪ v / v acid formic) و B (80٪ v / v acetonitrile / 0.1٪ v / v acid formic).
  2. قم بإذابة العينة في 500 ميكرولتر من المحلول أ.
  3. ضع العمود في مشعب فراغ وقم بتطبيق ضغط الغاز عند ~ 1-2 مل / دقيقة.
  4. أضف 500 ميكرولتر من المحلول B إلى عمود HLB وقم بإخلاؤه عند 1-2 مل / دقيقة ؛ كرر مرتين.
  5. أضف 750 ميكرولتر من المحلول A إلى عمود HLB وقم بإخلاؤه عند 1-2 مل / دقيقة ؛ كرر مرتين.
  6. ضع أنبوبا دقيقا نظيفا سعة 2 مل في الرف أسفل عمود HLB ، وقم بتحميل العينة في 500 ميكرولتر من المحلول A ، وضغط الغاز على النحو الوارد أعلاه ؛ قم بتمرير التدفق إلى العمود مرة ثانية.
  7. ضع عمود HLB فوق أنبوب النفايات ، وأضف 500 ميكرولتر من المحلول A ، وقم بإخلاء المحلول على النحو الوارد أعلاه ؛ كرر مرتين.
  8. ضع العمود فوق أنبوب دقيق نظيف سعة 2 مل ، وأضف 500 ميكرولتر من المحلول B ، وقم بإفراغه على النحو الوارد أعلاه ؛ كرر مرتين.
  9. قم بتجميد المصفاة عند -80 درجة مئوية ، ثم جففها في مكثف مفرغ. قم بتخزين البقايا المجففة عند -80 درجة مئوية.
  10. قم بإذابة البقايا في 20 ميكرولتر من 2٪ v / v acetonitrile / 0.1٪ v / v حمض الفورميك قبل تحليل MS. استخدم مقياس الطيف الضوئي لتقدير تركيز الببتيد عند امتصاص 205 نانومتر.

4. تحليل قياس الطيف الكتلي

  1. كروماتوغرافيا السائل أحادية البعد ذات الطور العكسي (LC) - MS / MS
    1. حقن كتلة متساوية من الببتيدات (~ 600 نانوغرام) على نانو LC أحادي الأبعاد وقم بتجزئتها على أعمدة المرحلة C18 المعكوسة.
    2. قم بتصفية الببتيدات مباشرة في MS بجهد رش يبلغ 1.8 كيلو فولت ، مع الحفاظ على أنبوب نقل الأيونات عند 250 درجة مئوية.
    3. احصل على الأطياف في وضع أعلى 20 أيونيا يعتمد على البيانات حيث تتم إزالة جزء MS / MS الأكثر كثافة من قائمة انتظار التحليل لتحسين عمق رسم خرائط الأيونات على أيونات الوفرة المنخفضة.

5. تحليل البيانات والمعلوماتية الحيوية

  1. إجراءات معالجة البيانات
    1. بعد التخصيص الطيفي وتحديد الببتيد والبروتين في PEAKS 12.0 (برنامج تحليل بيانات LC-MS / MS) ، أرسل قوائم البروتينات للتحليل في MetaboAnalyst 6.0 (منصة تحليل بيانات التمثيل الغذائي) باستخدام نهج التحليل الإحصائي أحادي العامل (https://www.metaboanalyst.ca/).
    2. استخدم برنامج تحليل بيانات LC-MS / MS للبحث عن الأطياف وتصفيتها باستخدام معايير معدل الاكتشاف الخاطئ الصارمة (FDR) (1٪ بروتين وببتيد) مقابل قاعدة بيانات Mouse Reviewed FASTA.
      ملاحظة: تشمل برامج البحث البديلة المتوفرة بسهولة Maxquant و Proteome Discoverer ، من بين الخيارات الأخرى المستخدمة على نطاق واسع.
    3. حدد كارباميدوميثيل السيستين كتعديل ثابت. حدد أكسدة الميثيونين كتعديل متغير.
    4. قم بتحويل القوائم إلى تنسيق قيم مفصولة بفواصل (CSV) وتسميات مجموعة/عينة معينة لكل عمود وصف. هذا التنسيق مرن في منصة تحليل بيانات التمثيل الغذائي.
    5. احسب القيم المفقودة باستخدام قاعدة القيمة الدنيا 1/5 للمتغيرات المفقودة.
    6. قم بتصفية البيانات لاستبعاد القيم المتغيرة للغاية باستخدام النطاق الربيعي ، حيث يتم استخدام تباين 40٪ للقطع.
    7. تطبيع القيم إلى متوسط الشدة، وتحويل السجل10 ، ومتوسط المنتصف للتحجيم. استخدم أساليب التطبيع الأخرى ، مع الأخذ في الاعتبار أن النتائج قد تختلف.
    8. قم بإجراء اختبارات T بطريقة غير متزاوجة مع قطع قيمة p < 0.05. قم بإجراء تصحيحات اختبار متعددة في هذه المرحلة.
      ملاحظة: لم تقم هذه الدراسة بإجراء هذا التصحيح لمجموعة البيانات التمثيلية لأغراض عرض البيانات.
    9. أشر إلى مخططات البركان للتغيير بمقدار 1.5 ضعفا (FC) و ص < 0.05.
    10. إنشاء خرائط حرارية وإجراء تحليل تمييزي جزئي للمربعات الصغرى (PLSDA) والتحليل الإحصائي (متغير أهمية الإسقاط [VIP]) لمجموعات العينات.
    11. المرشحون المحتملون للمتابعة إما أقوياء بما يكفي لتجاوز 1.5FC و p-val < 0.05 أو VIP > 1.0 ، كما هو موضح في تحليل PLSDA.
    12. قم بإنشاء مخططات Venn لتوضيح الاختلافات في بروتين الكلى والنبيبات والنخاع بأكملها في فئران OVE26.

النتائج

بشكل عام ، كانت التعريفات الإجمالية للبروتين من كل نوع من أنواع العينة 1) كلية كاملة (1438) 2) نخاع (2145) ، وأنابيب قشرية (1859). بعد معالجة البيانات في MetaboAnalyst 6.0 ، وتصفية البيانات ، والاحتساب ، كانت تعريفات البروتين التي تم تحليلها أخيرا لكل حجرة كلى: الكلى الكاملة (455) ، والنخاع (997...

Discussion

تم تصميم الطرق المقدمة في هذا النهج التقني لتوضيح تحليل البروتين المقارن لمناطق مختلفة من الكلى. هنا ، استخدمنا طرقا لعزل النخاع والأنابيب القشرية في الفئران المصابة بالسكري (OVE26) والتحكم (FVB) وأجرينا تحليل LC-MS / MS أحادي البعد والمعلوماتية الحيوية لتوضيح الاختلافات الأسا?...

Disclosures

لم يكشف المؤلفان عن أي إفصاح.

Acknowledgements

تم دعم العمل في هذا المشروع جزئيا بأموال ل MTB (المعاهد الوطنية للصحة K01DK080951) و TDC (اتحاد أبحاث أمراض الكلى NephCure-Pediatric NKI-2023-04) وبرنامج أمراض الكلى بجامعة لويزفيل ومركز تكنولوجيا البروتينات (TDC ، MTB).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase type 1A Millipore SignalC9891
Exploris 480 Orbitrap Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539MS
Falcon Cell Strainer, 100 µmVWR21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µmVWR21008-952
Gibco PBS pH 7.4 Thermo1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor CocktailVWRPI78440
IodoacetamideSigma AldrichI1149
MetaboAnalyst 6.0 MetaboAnalyst 6.0 https://www.metaboanalyst.ca/metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000 Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column Waters186002034
PEAKS 12.0Bioinformatics Solutions IncLC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL MicrotubeFisher ScientificNC0782485
Suspension Trap (S-trap)ProtifiC02-micro-10
TCEPThermoFisher Scientific20490
TEABCSigma AldrichT7408
Trypsin Protease, MS-GradeThermoFisher Scientific90057
Ultrasonic CleanerCole-Parmer  Model 0884900

References

  1. Ding, X., et al. Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019. Front Endocrinol. 15, 1383777 (2024).
  2. Liu, W., et al. Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis. Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).
  3. Xie, D., et al. Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019. Sci Rep. 13 (1), 20234 (2023).
  4. Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension. Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).
  5. Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. Tubular changes in early diabetic nephropathy. Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).
  6. Thomas, M. C., et al. Diabetic kidney disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15018 (2015).
  7. Nath, K. A. Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage. Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).
  8. Bonventre, J. V. Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes. Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).
  9. Powell, D. W., et al. Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice. Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).
  10. Cummins, T. D., et al. Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling. Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).
  11. Barati, M. T., et al. Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice. Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).
  12. Zheleznova, N. N., et al. Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).
  13. Nordquist, L., Palm, F. Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism. Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).
  14. dos Santos, E. A., Li, L. -. P., Ji, L., Prasad, P. V. Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging. Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).
  15. Cummins, T. D., et al. Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome. Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).
  16. Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice. Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).
  17. Zheng, S., et al. Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice. Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).
  18. Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation. Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).
  19. Mather, A., Pollock, C. Glucose handling by the kidney. Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).
  20. Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. Glucose metabolism in renal tubular function. Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).
  21. Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response. J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).
  22. Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved