A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا للتحليل البروتيني للكلية بأكملها ، والنبيبات القشرية المعزولة ، والبروتينات النخاعي. تقارن الدراسة أيضا البروتينات الإقليمية في نموذج الفئران السكري والفئران غير السكرية.
يعد تحديد تسلسل الأحداث في أمراض الكلى حجر الزاوية في الممارسة السريرية في مجموعة أدوات أمراض الكلى. تعد التحليلات البروتينية للأنسجة نهجا مهما لفهم العمليات الفسيولوجية والجزيئية الأساسية للفيزيولوجيا المرضية الكلوية. ستسمح الطرق والبروتوكولات التي نقدمها هنا بالتشريح الجزيئي للكلية في كل منطقة محددة ذات أهمية تتعلق بعواقب المرض. لتحديد آثار المرض على مناطق وهياكل معينة من الكلى ذات الوظائف الفريدة ، تتمثل أهداف هذا البروتوكول في إظهار تجزئة الكلى المبسطة للفأر وعزل النبيبات القشرية الكلوية جنبا إلى جنب مع تدفقات عمل البروتينات الكمية المبسطة الخالية من الملصقات. سيساعد الجمع بين هذه الأساليب في تحديد الأنماط الجزيئية المضطربة في الكلى بأكملها ، والمقصورات النخاعية ، وهياكل الأنابيب القشرية للكلى ، مع الهدف النهائي والنهائي المتمثل في البروتينات أحادية الخلية في السياقات المرضية. سيكون تطبيق هذه الأساليب في أي نموذج مرضي تقريبا مفيدا في تحديد آليات علم الأمراض المتعلقة بضعف الكلى.
يعد مرض الكلى المزمن (CKD) مصدر قلق كبير في الطب الحديث ، حيث يصل إلى أكثر من 86 مليار دولار من نفقات الرعاية الصحية في الولايات المتحدة وحدها1. في جميع أنحاء العالم ، يتزايد معدل الإصابة بمرض الكلى المزمن مع انتشار مرض السكري والأمراض المصاحبة للكلى المرتبطة به. ما يقرب من 14٪ من سكان الولايات المتحدة مصابون بمرض الكلى المزمن (التقرير السنوي USRDS 2024). علاوة على ذلك ، فإن اعتلال الكلية السكري هو شكل من أشكال مرض الكلى المزمن والسبب الرئيسي لمرض الكلى في المرحلة النهائية (ESRD) ، و 60٪ من مرضى ESRD يعانون من مرض السكري1،2،3. يؤثر مرض السكري على جميع هياكل الكلى وأنواع خلايا النيفرون ، الوحدة الوظيفية للكلى. كما هو موضح في الشكل 1 ، توجد أجزاء مختلفة من النيفرون في مناطق قشرة الكلى والنخاع. تتكون غالبية الكلى من الأنابيب. يساهم الخلل الوظيفي في النبيبات الكلوية والآفات الهيكلية بشكل كبير في تطور اعتلال الكلية السكري (DN) ، وترتبط هذه التغييرات بشكل جيد بمعدل انخفاض وظائف الكلى4،5،6،7،8. في وقت مبكر من مرض السكري ، استجابة لزيادة امتصاص الجلوكوز وما يرتبط به من صوديوم ومتطلبات بروتين نقل الغشاء في جميع قطاعات الأنابيب ، تخضع الأنابيب لتضخم. مع زيادة إصابة الأوعية الدموية الدقيقة في وقت لاحق من مرض السكري ، تظهر الأنابيب ضمور وتمدد ، بينما يوجد تليف وتوسع في النسيجالخلالي 9. وجدت الدراسات السابقة من مختبرنا أن البروتينات المتغيرة ووفرة من بروتينات الاستجابة للإجهاد في الأنابيب القشرية للفئران المصابة بالسكري10،11. النخاع مهم لتنظيم تركيز البول ، ويرتبط الخلل الوظيفي أثناء أمراض الكلى بالإجهاد التأكسدي ، حيث يؤدي مرض السكري إلى انخفاض توتر الأكسجين في هذه المنطقة من الكلى بسبب زيادة استهلاك الأكسجين من أنشطة التمثيل الغذائي ، وزيادة نشاط بروتينات نقل الغشاء ، وإصابة الأوعية الدموية الدقيقة12،13،14.
يعد فهم الآليات التفصيلية لتطور وتطور DN جهدا مستمرا سيتطلب مناهج جديدة ومتكاملة تستدعي نمذجة المرض والتنميط الجزيئي لعمليات الإشارات ، والتغيرات التكيفية في ديناميكيات البروتين الخلوي ، والتعريف الدقيق للخلايا الكلوية ومكونات الأنسجة المتأثرة بالإصابة في الحالات المزمنة. توفر البروتينات والتمثيل الغذائي والنسخ إمكانية التحقيق التحليلي للآليات الجزيئية لأمراض الكلى. Omics هو مجال جديد نسبيا يستخدم مناهج بيولوجيا الأنظمة لاكتساب فهم أكثر عالمية للأنظمة البيولوجية. كانت البروتينات أداة قوية من Omics في أمراض الكلى في العقود الأخيرة. توسعت أبحاث المؤشرات الحيوية خلال السنوات العشرين الماضية ، كما يتضح من النمو في المنشورات ، على الرغم من ضرورة العمل المكثف لتنفيذ هذه النتائج بالكامل في العيادة15. مع اختلاف مجموعات خلايا الأنابيب والأدوار الوظيفية الخاصة بها داخل القشرة الكلوية والنخاع ، يمكن للتحليل البروتيني للكلى بأكملها إخفاء التغييرات الفريدة المرتبطة بهياكل محددة داخل هذه المناطق المختلفة. لذلك ، فإن أهداف هذه الدراسة هي إثبات فصل القشرة الكلوية والنخاع ، وكذلك فصل الأنابيب القشرية عن الكبيبات ، تليها بروتوكولات مفصلة لتحضير مستخلصات البروتين من الهياكل المعزولة لقياس الطيف الكتلي الحديث وتحليلات المعلوماتية الحيوية. تعتبر نماذج الفئران لاعتلال الكلية السكري مفيدة في تحديد آليات تطور المرض. في هذه الدراسة ، استخدمنا الفأر المعدل وراثيا OVE26 ، والذي يصاب بمرض السكري من النوع الأول المبكر ويظهر ميزات DN في المرحلة المبكرة والمتأخرة لدى البشر ، بما في ذلك 1) الارتفاع المبكر والانخفاض اللاحق في معدل الترشيح الكبيبي ، 2) تضخم الكلى ، 3) سماكة الغشاء القاعدي الكبيبي والتمدد المتوسط ، 4) البيلة البروتينية الشديدة ، و 5) التليف الخلاليالأنبوبي 9 ، 16،17. تم اختيار الفئران البالغة من العمر شهرين لإظهار التغيرات البروتينية في مقصورات الأنابيب قبل الآفات الهيكلية العلنية. كما ذكرنا سابقا وموضحا في الشكل 2 ، تظهر الفئران OVE26 البالغة من العمر شهرين توسعا في المصفوفة المتوسطة الكبيبية (الشكل 2 ، السهم الأخضر) والبيلة البروتينيةالشديدة 17 ، دون تغييرات نسيجية علنية في الأنابيب القريبة (الشكل 2 ، السهم الأصفر) في الفئران الصغيرة المصابة بالسكري. نقدم هنا نهجا مشتركا للبروتينات الكمية لتوصيف الكلى بأكملها ، والنخاع ، والأنابيب القشرية لتوضيح وتوضيح الاختلافات في البروتين في كل حجرة مصابة بمرض السكري.
تمت الموافقة على الدراسات التي أجريت على الفئران OVE26 و FVB من قبل إرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة لويزفيل (IACUC). أنثى معدلة وراثيا OVE26 (مرضى السكري ؛ سلالة #: 005564) و FVB (غير مرضى السكري ؛ سلالة الخلفية ؛ سلالة #: 001800) تم شراء الفئران من مختبرات جاكسون (بار هاربور ، مي). تم الحفاظ على في دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة عند 25 درجة مئوية ، وتم منحها حرية الوصول إلى الماء والغذاء. أجريت جميع الدراسات على الفئران البالغة من العمر شهرين.
1. نموذج
2. بروتوكول هضم عمود الدوران الصغير Suspension-Trap
3. التنظيف باستخدام عمود التوازن المحب للماء والدهون (HLB)
4. تحليل قياس الطيف الكتلي
5. تحليل البيانات والمعلوماتية الحيوية
بشكل عام ، كانت التعريفات الإجمالية للبروتين من كل نوع من أنواع العينة 1) كلية كاملة (1438) 2) نخاع (2145) ، وأنابيب قشرية (1859). بعد معالجة البيانات في MetaboAnalyst 6.0 ، وتصفية البيانات ، والاحتساب ، كانت تعريفات البروتين التي تم تحليلها أخيرا لكل حجرة كلى: الكلى الكاملة (455) ، والنخاع (997...
تم تصميم الطرق المقدمة في هذا النهج التقني لتوضيح تحليل البروتين المقارن لمناطق مختلفة من الكلى. هنا ، استخدمنا طرقا لعزل النخاع والأنابيب القشرية في الفئران المصابة بالسكري (OVE26) والتحكم (FVB) وأجرينا تحليل LC-MS / MS أحادي البعد والمعلوماتية الحيوية لتوضيح الاختلافات الأسا?...
لم يكشف المؤلفان عن أي إفصاح.
تم دعم العمل في هذا المشروع جزئيا بأموال ل MTB (المعاهد الوطنية للصحة K01DK080951) و TDC (اتحاد أبحاث أمراض الكلى NephCure-Pediatric NKI-2023-04) وبرنامج أمراض الكلى بجامعة لويزفيل ومركز تكنولوجيا البروتينات (TDC ، MTB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase type 1A | Millipore Signal | C9891 | |
Exploris 480 Orbitrap | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539 | MS |
Falcon Cell Strainer, 100 µm | VWR | 21008-950 | |
Falcon Cell Strainer, 70 µm | VWR | 21008-952 | |
Gibco PBS pH 7.4 | Thermo | 1001023 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | VWR | PI78440 | |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | |
MetaboAnalyst 6.0 | MetaboAnalyst 6.0 | https://www.metaboanalyst.ca/ | metabolomics data analysis platform |
NanoDrop 2000 | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000 | |
Oasis HLB column | Waters | 186002034 | |
PEAKS 12.0 | Bioinformatics Solutions Inc | LC-MS/MS data analysis software | |
Pestle for 1.5 mL Microtube | Fisher Scientific | NC0782485 | |
Suspension Trap (S-trap) | Protifi | C02-micro-10 | |
TCEP | ThermoFisher Scientific | 20490 | |
TEABC | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trypsin Protease, MS-Grade | ThermoFisher Scientific | 90057 | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | Model 0884900 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved