Analyse protéomique comparative des tubules rénaux entiers, moelleux et corticaux dans la pathogenèse diabétique des lésions rénales chez la souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’analyse protéomique de l’ensemble du rein, du tubule cortical isolé et des protéomes médullaires. L’étude compare également les protéomes régionaux dans un modèle de souris diabétiques et chez des souris non diabétiques.

Résumé

La définition de la séquence des événements dans l’insuffisance rénale est la pierre angulaire de la pratique clinique dans la boîte à outils du néphrologue. L’analyse protéomique tissulaire est une approche importante pour comprendre les processus physiologiques et moléculaires fondamentaux de la physiopathologie rénale. Les méthodes et protocoles que nous présentons ici permettront la dissection moléculaire du rein dans chaque région d’intérêt spécifique liée aux séquelles de la maladie. Pour déterminer les effets de la maladie sur des régions et des structures rénales spécifiques ayant des fonctions uniques, les objectifs de ce protocole sont de démontrer des techniques simplifiées de compartimentation rénale et d’isolement des tubules corticaux rénaux chez la souris en tandem avec des flux de travail protéomiques quantitatifs rationalisés sans marquage. La combinaison de ces méthodes aidera à l’identification de modèles moléculaires perturbés dans l’ensemble du rein, les compartiments médullaires et les structures des tubules corticaux des reins, dans le but ultime et final de la protéomique unicellulaire dans des contextes pathologiques. L’application de ces méthodes dans pratiquement n’importe quel modèle de maladie sera utile pour délimiter les mécanismes de pathologie liés à la dysfonction rénale.

Introduction

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une préoccupation majeure de la médecine moderne, représentant plus de 86 milliards de dollars de dépenses de santé rien qu’aux États-Unis¹. À l’échelle mondiale, l’incidence de l’IRC augmente avec la prévalence du diabète et des comorbidités rénales associées. Près de 14 % de la population américaine souffre d’IRC (rapport annuel USRDS 2024). De plus, la néphropathie diabétique est une forme d’IRC et la principale cause d’insuffisance rénale terminale (IRT), et 60 % des patients atteints d’IRT souffrent de diabète ^1,2,3. Le diabète affecte toutes les structures rénales et les types de cellules des néphrons, l’unité fonctionnelle des reins. Comme le montre la figure 1, différentes parties des néphrons sont contenues dans le cortex rénal et les régions modullaires. La majorité du rein est composée de tubules. Le dysfonctionnement des tubules rénaux et les lésions structurelles contribuent de manière significative au développement de la néphropathie diabétique (DN), et ces changements sont bien corrélés avec le taux de déclin de la fonction rénale 4,5,6,7,8. Au début du diabète, en réponse à l’augmentation du glucose et à l’absorption de sodium associée et aux demandes de protéines de transport membranaire dans tous les segments des tubules, les tubules subissent une hypertrophie. Avec l’augmentation des lésions microvasculaires plus tard dans le diabète, les tubules présentent une atrophie et une dilatation, tandis qu’il y a fibrose et expansion de l’interstitium⁹. Des études antérieures de notre laboratoire ont révélé des protéomes altérés et une abondance de protéines de réponse au stress dans les tubules corticaux de souris diabétiques^10,11. La moelle épinière est importante pour réguler la concentration d’urine, et le dysfonctionnement au cours de la maladie rénale est associé au stress oxydatif, le diabète entraînant une diminution de la tension d’oxygène dans cette région du rein en raison de l’augmentation de la consommation d’oxygène due aux activités métaboliques, de l’augmentation de l’activité des protéines de transport membranaire et des lésions microvasculaires 12,13,14.

La compréhension des mécanismes détaillés du développement et de la progression de la DN est un effort continu qui nécessitera des approches nouvelles et intégrées faisant appel à la modélisation de la maladie et au profilage moléculaire des processus de signalisation, à des changements adaptatifs dans la dynamique des protéines cellulaires et à une définition précise des composants des cellules rénales et des tissus affectés par les lésions dans les maladies chroniques. La protéomique, la métabolomique et la transcriptomique offrent la possibilité de sonder analytiquement les mécanismes moléculaires des maladies rénales. Les omiques sont un domaine relativement nouveau qui utilise des approches de biologie des systèmes pour acquérir une compréhension plus globale des systèmes biologiques. La protéomique a été un puissant outil omique en néphrologie au cours des dernières décennies. La recherche sur les biomarqueurs s’est développée au cours des 20 dernières années, comme l’indique la croissance des publications, bien que des travaux approfondis soient nécessaires pour mettre pleinement en œuvre ces résultats en clinique¹⁵. Avec les populations de cellules tubulaires très différentes et les rôles fonctionnels respectifs dans le cortex rénal et la moelle, l’analyse protéomique de reins entiers peut masquer des changements uniques associés à des structures spécifiques au sein de ces différentes régions. Par conséquent, les objectifs de cette étude sont de démontrer la séparation du cortex rénal et de la moelle, ainsi que la séparation des tubules corticaux des glomérules, suivie de protocoles détaillés pour la préparation d’extraits de protéines à partir de structures isolées pour des analyses de spectrométrie de masse et de bioinformatique de pointe. Les modèles murins de néphropathie diabétique jouent un rôle déterminant dans la définition des mécanismes de progression de la maladie. Pour cette étude, nous avons utilisé la souris transgénique OVE26, qui développe un diabète de type I précoce et présente des caractéristiques de DN précoce et avancé chez l’homme, notamment 1) une augmentation précoce et une baisse ultérieure du débit de filtration glomérulaire, 2) une hypertrophie rénale, 3) un épaississement de la membrane basale glomérulaire et une expansion mésangiale, 4) une protéinurie sévère et 5) une fibrose tubulo-interstitielle^{9, 16 et 17}. Des souris âgées de deux mois ont été choisies pour mettre en évidence des changements protéomiques dans les compartiments tubulaires avant des lésions structurelles manifestes. Comme indiqué précédemment et montré dans la figure 2, les souris OVE26 âgées de 2 mois présentent une expansion de la matrice mésangiale glomérulaire (figure 2, flèche verte) et une protéinurie sévère¹⁷, sans changements histologiques manifestes des tubules proximaux (figure 2, flèche jaune) chez les jeunes souris diabétiques. Nous présentons ici une approche protéomique quantitative combinée pour la caractérisation de l’ensemble du rein, de la moelle épinière et des tubules corticaux afin d’élucider et d’illustrer les différences dans le protéome dans chaque compartiment atteint de diabète.

Protocole

Les études menées sur des souris OVE26 et FVB ont été approuvées par les directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Louisville. Femme transgénique OVE26 (diabétique ; Souche # :005564) et FVB (non diabétique ; souche de fond ; Souche # :001800) ont été achetées à Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Les animaux ont été maintenus sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures à 25 °C, et ont eu libre accès à de l’eau et à de la nourriture. Toutes les études ont été menées sur des souris âgées de 2 mois.

1. Modèle animal

1. Isolement rénal
   1. Anesthésie les souris en leur administrant par voie intrapéritonéale 80 mg/kg de kétamine et 12 mg/kg de xylazine.
   2. Faites une incision abdominale médiane avec de petits ciseaux chirurgicaux et déplacez doucement les intestins vers l’extérieur et sur le côté de la souris à l’aide d’écouvillons pour exposer la veine cave.
   3. Faites une petite incision dans la veine cave au-dessus du rein droit.
   4. Perfuser la souris à travers le ventricule gauche avec 20 mL de solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS : pH 7,4 ; 210 mg/L KH₂PO₄, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na₂HPO_4·7H₂O) à l’aide d’une pompe péristaltique, à un débit de 10 mL/min.
      REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire si l’inclusion de protéines et de cellules sanguines dans les reins n’est pas un facteur critique dans les analyses en aval.
   5. Retirez les reins à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux. Retirez tout excès de graisse de l’extérieur des reins. Pesez les reins et placez-les dans du PBS froid sur de la glace.
   6. Retirez la capsule rénale.
   7. Placez les reins sur une assiette en verre ou une boîte de Pétri posée sur de la glace. Faites plusieurs coupes transversales à travers les reins à l’aide d’une lame de rasoir (Figure 3) pour aboutir à 3-4 tranches entre les pôles supérieur et inférieur des reins.
   8. Réservez 1 à 2 tranches du milieu et les deux pôles (tranches de rein encerclées à la figure 3) de chaque rein pour servir d’échantillons de « rein entier ». Placer une portion dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et ajouter un tampon d’homogénéisation glacé (10 % de glycérol, 50 mM d’HEPES, 100 mM de KCl, 2 mM d’EDTA, 0,1 % de NP40, 10 mM de NaF, 0,25 mM de NaVO₃, 1 inhibiteur de protéase HALTS) à environ 10 μL/mg d’échantillon de tissu (d’après la masse estimée de tranches de rein, dérivée du poids acquis des reins). Laissez le tube sur de la glace.
   9. Pour le reste des tranches transversales du milieu, posez la tranche à plat et coupez soigneusement le cortex (1 mm externe) de chaque tranche à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel (Figure 3, flux de travail schématique). Gardez le cortex séparé des régions modullaires pour le protocole d’isolement des tubules corticaux (ci-dessous, étape 1.3).
   10. Placez une partie de la moelle disséquée dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml, ajoutez un tampon d’homogénéisation glacé comme à l’étape 1.1.8 et laissez le tube sur de la glace.
   11. Congelez en un clin d’œil, dans de l’azote liquide, tous les morceaux entiers de rein et de moelle restants non utilisés pour l’homogénéisation et conservez-les à -80 °C.
2. Vous pouvez également congeler tous les compartiments rénaux et rachideux séparés et les stocker comme décrit à l’étape 1.1.11. Retirez-les de l’entreposage ultérieurement pour l’ajout d’un tampon d’homogénéisation comme à l’étape 1.1.8.
3. Isolation des tubules corticaux
   1. Coupez le cortex disséqué en morceaux de 1 à 3 mm sur une plaque de verre ou une boîte de Pétri avec une lame de rasoir, en formant une pâte.
   2. Digérer le cortex haché dans 1 mL de collagénase de type IA (1 mg/mL) pendant 30 min, à 37 °C, dans un bain d’eau berçante.
   3. Placez une passoire à cellules de 100 μm sur un tube conique de 50 mL sur de la glace.
   4. Placez la suspension corticale digérée sur la crépine cellulaire de 100 μm et appuyez doucement à travers la crépine à l’aide du piston d’une seringue de 10 mL. Lavez le dessus de la passoire avec 1 mL de PBS et le dessous de la passoire avec 1 mL de PBS.
   5. Passez le filtrat dans le tube de 50 mL à travers une crépine supplémentaire de 100 μm, puis lavez le haut de la crépine avec 1 mL de PBS.
   6. Passez le filtrat à travers une crépine de 70 μm placée sur un tube conique de 50 mL sur de la glace. Les tubules passeront à travers cette crépine dans le filtrat (les glomérules seront retenus sur la crépine de 70 μm). Lavez la passoire avec 1 mL de PBS.
   7. Faire tourner le filtrat final à 120 × g pendant 2 min à 4 °C. Jetez l’excès de PBS de la pastille de tubule.
   8. Vérifiez la pureté de la pastille du tubule cortical par visualisation au microscope, à l’aide d’un objectif 10x. Si plus de 10 % de la fraction contient des glomérules, remettre le filtrat en suspension avec 1 mL de PBS et le passer dans une crépine propre de 70 μm sans lavage supplémentaire de la crépine.
   9. Répartir la fraction de tubule enrichie dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et faire tourner à 2000 × g pendant 2 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
   10. Ajouter un tampon d’homogénéisation à la pastille tubule comme pour le rein entier et la moelle épinière (étapes 1.1.8 et 1.1.10).
4. Homogénéisation tissulaire/Extraction de protéines
   1. Homogénéiser chaque type d’échantillon dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’un pilon en plastique spécialement conçu pour les tubes de 1,5 mL. Si la suspension homogénéisée est trop épaisse, ajoutez un tampon d’homogénéisation supplémentaire au besoin.
   2. Laisser la suspension homogénéisée sur glace pendant 15 min suivie d’une sonication pendant 5 min dans un sonicateur de bain (interrupteur marche/arrêt uniquement, pas de réglages réglables sur l’appareil), avec de l’eau dans le bain à 25 °C. Laissez les échantillons sur de la glace pendant 10 min.
   3. Agiter brièvement au vortex (1000-1500 tr/min) homogéner, puis triturer 20 fois avec une pipette et laisser sur la glace pendant encore 15 min.
   4. Triturer les échantillons plusieurs fois avant la centrifugation à 13 000 × g pendant 20 min à 4 °C.
   5. Transférez les extraits de protéines éliminés dans des tubes propres.
   6. Aliquote 30 μL d’extrait clarifié pour l’estimation des protéines et la préparation de l’échantillon pour l’analyse par spectrométrie de masse. Conservez le reste des échantillons à -80 °C.

2. Protocole de digestion de la mini colonne de spin Suspension-Trap

1. Digestion protéolytique de protéines en fragments tryptiques pour des analyses protéomiques
2. Diluer ~40-50 μg de l’échantillon (à ~2 μg/μL) dans un tampon de lyse d’échantillon (10 % p/v de dodécylsulfate de sodium [SDS] dans 100 mM de bicarbonate de triéthylammonium (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM de tris (2-carboxyéthyl)phosphine [TCEP]) jusqu’à un volume final de 46 μL.
3. Réduction et alkylation des protéines
   1. Incuber à 65 °C pendant 30 min (la concentration finale de PTCE est de 20 mM).
   2. Ajouter 4 μL d’iodoacétamide 0,5 M dans de l’eau de qualité chromatographie liquide couplée spectrométrie de masse (LC-MS) et incuber à température ambiante (RT) dans l’obscurité pendant 30 min (la concentration finale d’iodoacétamide est de 40 mM).
4. Ajouter 5 μL d’acide phosphorique à 12 % p/p dans de l’eau de qualité LC-MS (diluer 141 μL d’acide phosphorique à 85 % dans 859 μL d’eau pour une solution à 12 %).
   1. Alternative à l’acide phosphorique, utilisez de l’acide trifluoroacétique ou de l’acide formique si vous effectuez un enrichissement en phosphopeptide¹⁸.
5. Ajouter 350 μL de tampon de liaison de piège en suspension (100 mM TEA-BC dans du méthanol à 90 % v/v et 10 % v/v de l’eau, pH 7,55).
6. Ajoutez un échantillon à la colonne suspension-trap. Centrifugeuse à 4 000 × g pendant 30 s à RT dans un rotor à angle fixe pour faire passer chaque volume à travers la colonne.
7. Laver avec 4x 400 μL de tampon de liaison de piège à suspension. Centrifugeuse à 4 000 x g pendant 30 s à RT dans un rotor à angle fixe pour faire passer chaque lavage dans la colonne.
   REMARQUE : Pour faciliter l’élimination des FDS, tournez la colonne dans le rotor de 180° après chaque lavage.
8. Centrifuger à 4 000 g pendant 1 min à RT pour éliminer complètement le tampon de liaison (empêche les gouttes pendant la digestion).
9. Transférez la colonne du piège à suspension dans un tube de collecte propre.
10. Ajouter 2,5 à 5 μg de trypsine dans 125 μL de 50 mM TEA-BC pH 8,5 dans de l’eau de grade LC-MS (Trypsine Protéase, MS-Grade). Le rapport final de la trypsine par rapport à l’échantillon est de 1:20 à 1:10.
11. Incuber à 47 °C pendant 2 h (ne pas serrer le bouchon, un mélangeur thermique réglé à 0 tr/min est préférable). Percer un trou dans le capuchon avec une aiguille peut empêcher la pression de s’accumuler dans la chambre supérieure du piège à suspension (une pression accrue fera couler la solution de trypsine à travers la colonne).
12. Ajouter 80 μL de 50 mM TEA-BC pH 8,5 dans de l’eau de qualité LC-MS. Centrifuger à 4 000 g à RT pendant 1 min dans un rotor à angle fixe pour faire passer chaque digestat dans la colonne.
13. Ajouter 80 μL d’acide formique à 0,2 % v/v dans de l’eau de qualité LC-MS. Centrifugeuse à 4 000 g pendant 1 min à RT dans un rotor à angle fixe pour collecter avec la digestion de l’étape 2.11.
14. Ajouter 80 μL d’acétonitrile à 50 % v/v dans de l’eau de qualité LC-MS. Centrifugeuse à 4 000 g à RT pendant 1 min dans un rotor à angle fixe pour recueillir avec la digestion de l’étape 2.11.
15. Stockez l’éluat du piège à suspension à -80 °C.
16. Séchez l’échantillon dans un concentrateur sous vide.
17. Conservez l’échantillon séché à -80 °C.

3. Nettoyage avec une colonne d’équilibre hydrophile-lipophile (HLB)

1. Préparez les solutions A (2 % v/v d’acétonitrile/0,1 % d’acide formique) et B (80 % d’acétonitrile/v / 0,1 % d’acide formique).
2. Dissoudre l’échantillon dans 500 μL de la solution A.
3. Placez la colonne dans un collecteur à vide et appliquez une pression de gaz à ~1-2 mL/min.
4. Ajouter 500 μL de solution B dans la colonne HLB et évacuer à 1-2 mL/min ; Répétez deux fois.
5. Ajouter 750 μL de solution A dans la colonne HLB et évacuer à 1-2 mL/min ; Répétez deux fois.
6. Placez un microtube propre de 2 mL dans le rack sous la colonne HLB, chargez l’échantillon dans 500 μL de solution A et la pression du gaz comme ci-dessus ; Passez le flux dans la colonne une deuxième fois.
7. Placer la colonne HLB au-dessus du tube de déchets, ajouter 500 μL de solution A et évacuer comme ci-dessus ; Répétez deux fois.
8. Placer la colonne au-dessus d’un microtube propre de 2 mL, ajouter 500 μL de solution B et évacuer comme ci-dessus ; Répétez deux fois.
9. Congelez l’éluat à -80 °C, puis faites-le sécher dans un concentrateur sous vide. Conservez le résidu séché à -80 °C.
10. Dissoudre le résidu dans 20 μL d’acétonitrile à 2 % v/v et d’acide formique à 0,1 % v/v avant l’analyse MS. À l’aide d’un spectrophotomètre, vous pouvez estimer la concentration peptidique à une absorbance de 205 nm.

4. Analyse par spectrométrie de masse

1. Chromatographie liquide en phase inverse (LL)-MS/MS unidimensionnelle
   1. Injectez une masse égale de peptides (~600 ng) sur des nano-LC 1-dimensionnels et fractionnez-les sur des colonnes C18 en phase inverse.
   2. Éluer les peptides directement dans le MS à une tension de pulvérisation de 1,8 kV, avec un tube de transfert d’ions maintenu à 250 °C.
   3. Acquérez les spectres en mode d’ions top 20 dépendant des données, où le fragment MS/MS le plus intense est retiré de la file d’attente d’analyse pour améliorer la profondeur de la cartographie ionique sur les ions de faible abondance.

5. Analyse des données et bioinformatique

1. Procédures de traitement des données
   1. Après l’assignation spectrale et l’identification des peptides et des protéines dans PEAKS 12.0 (logiciel d’analyse de données LC-MS/MS), soumettez les listes de protéines pour analyse dans MetaboAnalyst 6.0 (plateforme d’analyse de données métabolomiques) en utilisant l’approche d’analyse statistique monofactorielle (https://www.metaboanalyst.ca/).
   2. Utilisez un logiciel d’analyse de données LC-MS/MS pour rechercher et filtrer les spectres à l’aide de critères stricts de taux de fausses découvertes (FDR) (1 % de protéines et de peptides) par rapport à la base de données FASTA examinée par des souris.
      REMARQUE : Les autres programmes de recherche facilement disponibles incluent Maxquant, Proteome Discoverer, parmi d’autres options largement utilisées.
   3. Spécifiez la carbamidométhylation de la cystéine comme une modification fixe. Spécifier l’oxydation de la méthionine comme une modification variable.
   4. Convertissez les listes au format CSV (valeurs séparées par des virgules) et les libellés de groupe/exemple attribués à chaque colonne et rangée. Ce format est flexible dans la plateforme d’analyse de données métabolomiques.
   5. Imputez les valeurs manquantes à l’aide de la règle de la valeur minimale de 1/5 pour les variables manquantes.
   6. Filtrez les données pour exclure les valeurs très variables à l’aide de l’intervalle interquartile, où la variance de 40 % est utilisée pour la limite.
   7. Normalisez les valeurs en fonction de l’intensité médiane, du log₁₀ transformé et de la moyenne centrée pour la mise à l’échelle. Utilisez d’autres approches de normalisation, en gardant à l’esprit que les résultats peuvent varier.
   8. Effectuez des tests T de manière non appariée avec une valeur seuil de < de 0,05. Effectuez plusieurs corrections de test à ce stade.
      REMARQUE : Cette étude n’a pas effectué cette correction pour l’ensemble de données représentatif à des fins de présentation des données.
   9. Indiquez les graphiques du volcan pour un changement de 1,5 fois (FC) et p < 0,05.
   10. Générez des cartes thermiques et effectuez une analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLSDA) et une analyse statistique (variable d’importance de projection [VIP]) des groupes d’échantillons.
   11. Les candidats potentiels pour le suivi sont soit suffisamment robustes pour éclipser 1,5FC et p-val < 0,05, soit VIP > 1,0, comme indiqué dans l’analyse PLSDA.
   12. Générez des diagrammes de Venn pour illustrer les différences dans le protéome de l’ensemble du rein, du tubule et de la moelle chez les souris OVE26.

Résultats

Dans l’ensemble, les identifications de protéines totales de chaque type d’échantillon étaient les suivantes : 1) rein entier (1438), 2) moelle épinière (2145) et tubules corticaux (1859). Après le traitement des données dans MetaboAnalyst 6.0, le filtrage des données et l’imputation, les identifications de protéines analysées pour chaque compartiment rénal étaient : rein entier (455), moelle épinière (997) et tubules corticaux (896). La figure 4<...

Discussion

Les méthodes présentées dans cette approche technique sont conçues pour illustrer l’analyse comparative du protéome de différentes zones du rein. Ici, nous avons utilisé des méthodes pour isoler les tubules rachideux et corticaux chez les souris diabétiques (OVE26) et les souris témoins (FVB) et effectué une analyse LC-MS/MS à 1 dimension et une analyse bioinformatique pour illustrer les différences fondamentales dans le protéome dans chaque partie du rein, en plus du pro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type 1A	Millipore Signal	C9891
Exploris 480 Orbitrap	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539	MS
Falcon Cell Strainer, 100 µm	VWR	21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µm	VWR	21008-952
Gibco PBS pH 7.4	Thermo	1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	VWR	PI78440
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149
MetaboAnalyst 6.0	MetaboAnalyst 6.0	https://www.metaboanalyst.ca/	metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column	Waters	186002034
PEAKS 12.0	Bioinformatics Solutions Inc		LC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL Microtube	Fisher Scientific	NC0782485
Suspension Trap (S-trap)	Protifi	C02-micro-10
TCEP	ThermoFisher Scientific	20490
TEABC	Sigma Aldrich	T7408
Trypsin Protease, MS-Grade	ThermoFisher Scientific	90057
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	Model 0884900