Análisis proteómico comparativo del riñón entero, la médula y los túbulos corticales en la patogénesis diabética de la lesión renal en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el análisis proteómico de todo el riñón, túbulos corticales aislados y proteomas medulares. El estudio también compara los proteomas regionales en un modelo de ratón diabético y ratones no diabéticos.

Resumen

La definición de la secuencia de eventos en la enfermedad renal es la piedra angular de la práctica clínica en el conjunto de herramientas del nefrólogo. Los análisis proteómicos de tejidos son un enfoque importante para comprender los procesos fisiológicos y moleculares fundamentales de la fisiopatología renal. Los métodos y protocolos que aquí presentamos permitirán la disección molecular del riñón en cada región específica de interés relacionada con las secuelas de la enfermedad. Para determinar los efectos de la enfermedad en regiones y estructuras renales específicas con funciones únicas, los objetivos de este protocolo son demostrar la compartimentación reñal simplificada del riñón en ratón y técnicas de aislamiento de túbulos corticales renales junto con flujos de trabajo proteómicos cuantitativos optimizados y sin marcajes. La combinación de estos métodos ayudará en la identificación de patrones moleculares perturbados en todo el riñón, los compartimentos medulares y las estructuras de los túbulos corticales de los riñones, con el objetivo final y eventual de la proteómica unicelular en contextos patológicos. La aplicación de estos métodos en prácticamente cualquier modelo de enfermedad será útil para delinear los mecanismos de patología relacionados con la disfunción renal.

Introducción

La enfermedad renal crónica (ERC) es una preocupación importante en la medicina moderna, que asciende a más de $ 86 mil millones en gastos de atención^{médica solo en} los Estados Unidos. A nivel mundial, la incidencia de la ERC está aumentando con la prevalencia de diabetes y las comorbilidades renales asociadas. Cerca del 14 % de la población estadounidense tiene ERC (informe anual USRDS 2024). Además, la nefropatía diabética es una forma de ERC y la principal causa de enfermedad renal terminal (IRCT), y el 60% de los pacientes con IRCT tienen diabetes ^1,2,3. La diabetes afecta a todas las estructuras renales y a los tipos de células de las nefronas, la unidad funcional de los riñones. Como se muestra en la Figura 1, diferentes porciones de nefronas están contenidas en las regiones de la corteza renal y la médula. La mayor parte del riñón está compuesto por túbulos. La disfunción de los túbulos renales y las lesiones estructurales contribuyen significativamente al desarrollo de nefropatía diabética (DN), y estos cambios se correlacionan bien con la tasa de disminución de la función renal 4,5,6,7,8. Al principio de la diabetes, en respuesta al aumento de la glucosa y a la absorción de sodio asociada y a las demandas de proteínas transportadoras de membrana en todos los segmentos de los túbulos, los túbulos experimentan hipertrofia. Con el aumento de la lesión microvascular más adelante en la diabetes, los túbulos exhiben atrofia y dilatación, mientras que hay fibrosis y expansión del intersticio⁹. Estudios previos de nuestro laboratorio han encontrado proteomas alterados y una abundancia de proteínas de respuesta al estrés en los túbulos corticales de ratones diabéticos^10,11. La médula es importante para regular la concentración de orina, y la disfunción durante la enfermedad renal se asocia con estrés oxidativo, ya que la diabetes conduce a una disminución de la tensión de oxígeno en esta región del riñón debido al aumento del consumo de oxígeno de las actividades metabólicas, el aumento de la actividad de las proteínas transportadoras de membrana y la lesión microvascular 12,13,14.

La comprensión de los mecanismos detallados del desarrollo y la progresión de la DN es un esfuerzo continuo que requerirá enfoques novedosos e integrados que invoquen el modelado de la enfermedad y el perfil molecular de los procesos de señalización, los cambios adaptativos en la dinámica de las proteínas celulares y la definición precisa de los componentes de las células y tejidos renales afectados por lesiones en enfermedades crónicas. La proteómica, la metabolómica y la transcriptómica ofrecen la posibilidad de investigar analíticamente los mecanismos moleculares de las enfermedades renales. La ómica es un campo relativamente nuevo que utiliza enfoques de biología de sistemas para obtener una comprensión más global de los sistemas biológicos. La proteómica ha sido una poderosa herramienta ómica en nefrología en las últimas décadas. La investigación de biomarcadores se ha expandido en los últimos 20 años, como lo indica el crecimiento en las publicaciones, aunque se necesita un trabajo extenso para implementar completamente estos hallazgos en la clínica¹⁵. Con las poblaciones de células de túbulos ampliamente diferentes y los roles funcionales respectivos dentro de la corteza renal y la médula, el análisis proteómico de riñones completos puede enmascarar cambios únicos asociados con estructuras específicas dentro de estas diferentes regiones. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son demostrar la separación de la corteza renal y la médula, así como la separación de los túbulos corticales de los glomérulos, seguido de protocolos detallados para la preparación de extractos de proteínas a partir de estructuras aisladas para espectrometría de masas y análisis bioinformáticos de última generación. Los modelos murinos de nefropatía diabética son fundamentales para definir los mecanismos de progresión de la enfermedad. Para este estudio, utilizamos el ratón transgénico OVE26, que desarrolla diabetes tipo I de inicio temprano y muestra características de DN en etapa temprana y tardía en humanos, que incluyen 1) un aumento temprano y una disminución posterior en la tasa de filtración glomerular, 2) hipertrofia renal, 3) engrosamiento de la membrana basal glomerular y expansión mesangial, 4) proteinuria severa y 5) fibrosis tubulointersticial^{9, 16,17}. Se eligieron ratones de dos meses de edad para demostrar cambios proteómicos en los compartimentos de los túbulos antes de las lesiones estructurales manifiestas. Como se informó anteriormente y se muestra en la Figura 2, los ratones OVE26 de 2 meses de edad exhiben expansión de la matriz mesangial glomerular (Figura 2, flecha verde) y proteinuria¹⁷ grave, sin cambios histológicos manifiestos en los túbulos proximales (Figura 2, flecha amarilla) en ratones diabéticos jóvenes. Aquí presentamos un enfoque combinado de proteómica cuantitativa para la caracterización de todo el riñón, la médula y los túbulos corticales para dilucidar e ilustrar las diferencias en el proteoma en cada compartimento con diabetes.

Protocolo

Los estudios con ratones OVE26 y FVB fueron aprobados por las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Louisville. Hembra transgénica OVE26 (diabética; Cepa #:005564) y FVB (no diabético; cepa de fondo; Cepa #:001800) se compraron ratones de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas a 25 °C, y se les dio libre acceso a agua y alimentos. Todos los estudios se realizaron en ratones de 2 meses de edad.

1. Modelo animal

1. Aislamiento renal
   1. Anestesiar ratones administrando por vía intraperitoneal 80 mg/kg de ketamina y 12 mg/kg de xilacina.
   2. Haga una incisión en la línea media del abdomen con unas tijeras quirúrgicas pequeñas y mueva suavemente los intestinos hacia afuera y hacia el costado del ratón con hisopos para exponer la vena cava.
   3. Haz una pequeña incisión en la vena cava por encima del riñón derecho.
   4. Perfundir el ratón a través del ventrículo izquierdo con 20 mL de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS: pH 7,4; 210 mg/L KH₂PO₄, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na₂HPO_4·7H₂O) utilizando una bomba peristáltica, a razón de 10 mL/min.
      NOTA: Este paso no es necesario si la inclusión de proteínas sanguíneas y células en los riñones no es un factor crítico en los análisis posteriores.
   5. Extirpa los riñones con unas tijeras quirúrgicas pequeñas. Elimina el exceso de grasa del exterior de los riñones. Pese los riñones y colóquelos en PBS frío sobre hielo.
   6. Retire la cápsula de riñón.
   7. Coloque los riñones en una placa de vidrio o en una placa de Petri colocada sobre hielo. Realice varios cortes transversales a través de los riñones con una cuchilla de afeitar (Figura 3) para terminar con 3-4 cortes entre los polos superior e inferior de los riñones.
   8. Reserve 1-2 rodajas del medio y los dos polos (rodajas de riñón encerradas en un círculo en la Figura 3) de cada riñón a un lado para que sirvan como muestras de "riñón completo". Coloque una porción en tubos de centrífuga de 1,5 mL y agregue tampón de homogeneización helado (10% de glicerol, 50 mM de HEPES, 100 mM de KCl, 2 mM de EDTA, 0,1% de NP40, 10 mM de NaF, 0,25 mM de NaVO₃, 1x inhibidor de la proteasa HALTS) a aproximadamente 10 μL/mg de muestra de tejido (basado en la masa estimada de las rodajas de riñón, derivada del peso adquirido del riñón). Deje el tubo en hielo.
   9. Para el resto de las rebanadas transversales del medio, coloque la rebanada plana y corte con cuidado la corteza (1 mm exterior) de cada rebanada con una cuchilla de afeitar o un bisturí (Figura 3, flujo de trabajo esquemático). Mantenga la corteza separada de las regiones de la médula para el protocolo de aislamiento de los túbulos corticales (abajo, paso 1.3).
   10. Coloque una porción de la médula disecada en tubos de centrífuga de 1,5 mL, agregue tampón de homogeneización helado como en el paso 1.1.8 y deje el tubo en hielo.
   11. Congele rápidamente en nitrógeno líquido todos los restos de riñón entero y médula que no se utilicen para la homogeneización y almacene a -80 °C.
2. Alternativamente, congele todos los compartimentos separados del riñón entero y la médula y guárdelos como se describe en el paso 1.1.11. Quítelos del almacenamiento en un momento posterior para agregar un búfer de homogeneización como en el paso 1.1.8.
3. Aislamiento de los túbulos corticales
   1. Picar la corteza diseccionada en trozos de 1-3 mm en una placa de vidrio o placa de Petri con una cuchilla de afeitar, formando una pasta.
   2. Digirir la corteza picada en 1 mL de colagenasa tipo IA (1 mg/mL) durante 30 min, a 37 °C, en un baño de agua mecedora.
   3. Coloque un colador de células de 100 μm encima de un tubo cónico de 50 ml sobre hielo.
   4. Coloque la suspensión cortical digerida en el filtro de células de 100 μm y presione suavemente a través del filtro con el émbolo de una jeringa de 10 mL. Lave la parte superior del colador con 1 mL de PBS y la parte inferior del colador con 1 mL de PBS.
   5. Pase el filtrado en el tubo de 50 ml a través de un filtro adicional de 100 μm, luego lave la parte superior del filtro con 1 mL de PBS.
   6. Pase el filtrado a través de un filtro de células de 70 μm colocado sobre un tubo cónico de 50 mL sobre hielo. Los túbulos pasarán a través de este filtro hacia el filtrado (los glomérulos se retendrán en el filtro de 70 μm). Lave el colador con 1 mL de PBS.
   7. Centrifugar el filtrado final a 120 × g durante 2 min a 4 °C. Deseche el exceso de PBS del gránulo del túbulo.
   8. Compruebe la pureza del gránulo del túbulo cortical mediante la visualización bajo un microscopio, utilizando un objetivo 10x. Si más del 10% de la fracción contiene glomérulos, vuelva a suspender el filtrado con 1 mL de PBS y páselo a través de un filtro de células limpio de 70 μm sin ningún lavado adicional del filtro.
   9. Distribuya la fracción de túbulo enriquecida en tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrifuga a 2000 × g durante 2 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
   10. Añada tampón de homogeneización a la pelletización del túbulo como con todo el riñón y la médula (pasos 1.1.8 y 1.1.10).
4. Homogeneización de tejidos/Extracción de proteínas
   1. Homogeneice cada tipo de muestra en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL utilizando un mortero de plástico específico para tubos de 1,5 mL. Si la suspensión homogeneizada es demasiado espesa, agregue tampón de homogeneización adicional según sea necesario.
   2. Deje la suspensión homogeneizada en hielo durante 15 minutos, seguida de sonicación durante 5 minutos en un sonicador de baño (solo interruptor de encendido/apagado, sin ajustes ajustables en la unidad), con agua en el baño a 25 °C. Deje las muestras en hielo durante 10 minutos.
   3. Homogeneizar brevemente el vórtice (1000-1500 RPM), luego triturar 20 veces con una pipeta y dejar en hielo durante otros 15 min.
   4. Triturar las muestras varias veces antes de la centrifugación a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.
   5. Transfiera los extractos de proteínas aclarados a tubos limpios.
   6. Alícuota 30 μL de extracto aclarado para la estimación de proteínas y la preparación de muestras para análisis de espectrometría de masas. Almacene el resto de las muestras a -80 °C.

2. Protocolo de digestión de mini columna de centrifugado Suspension-Trap

1. Digestión proteolítica de proteínas en fragmentos trípticos para análisis proteómicos
2. Diluir ~40-50 μg de muestra (a ~2 μg/μL) en tampón de lisis de muestra (10% p/v de dodecil sulfato de sodio [SDS] en 100 mM de bicarbonato de trietilamonio (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM tris (2-carboxietil)fosfina [TCEP]) hasta un volumen final de 46 μL.
3. Reducción y alquilación de proteínas
   1. Incubar a 65 °C durante 30 min (la concentración final de TCEP es de 20 mM).
   2. Añadir 4 μL de yodoacetamida 0,5 M en agua de grado de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) e incubar a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad durante 30 min (la concentración final de yodoacetamida es de 40 mM).
4. Agregue 5 μL de ácido fosfórico al 12% p/p en agua de grado LC-MS (diluya 141 μL de ácido fosfórico al 85% en 859 μL de agua para una solución al 12%).
   1. Como alternativa al ácido fosfórico, utilice ácido trifluoroacético o ácido fórmico si realiza el enriquecimiento de fosfopéptidos¹⁸.
5. Añadir 350 μL de tampón de unión de trampa de suspensión (100 mM TEA-BC en 90% v/v de metanol/10% v/v de agua pH 7,55).
6. Agregue muestra a la columna de trampa de suspensión. Centrífuga a 4.000 × g durante 30 s a RT en un rotor de ángulo fijo para pasar cada volumen a través de la columna.
7. Lavar con 4 x 400 μL de tampón aglutinante de trampa de suspensión. Centrífuga a 4.000 x g durante 30 s a RT en un rotor de ángulo fijo para pasar cada lavado a través de la columna.
   NOTA: Para ayudar en la extracción de SDS, gire la columna en el rotor 180° después de cada lavado.
8. Centrifugar a 4.000 g durante 1 min a RT para eliminar completamente el tampón aglutinante (evita el goteo durante la digestión).
9. Transfiera la columna de la trampa de suspensión a un tubo de recolección limpio.
10. Añadir 2,5-5 μg de tripsina en 125 μL de 50 mM TEA-BC pH 8,5 en agua de grado LC-MS (tripsina proteasa, grado MS). La proporción final de tripsina en la muestra es de 1:20 hasta 1:10.
11. Incubar a 47 °C durante 2 h (no apriete el tapón; es preferible un mezclador térmico ajustado a 0 RPM). Hacer un agujero en la tapa con una aguja puede evitar que se acumule presión en la cámara superior de la trampa de suspensión (el aumento de la presión hará que la solución de tripsina gotee a través de la columna).
12. Agregue 80 μL de 50 mM TEA-BC pH 8.5 en agua de grado LC-MS. Centrifugar a 4.000 g a RT durante 1 min en un rotor de ángulo fijo para pasar cada digestión a través de la columna.
13. Añadir 80 μL de ácido fórmico al 0,2% v/v en agua de grado LC-MS. Centrifugar a 4.000 g durante 1 min a RT en un rotor de ángulo fijo para recoger con la digestión del paso 2.11.
14. Agregue 80 μL de acetonitrilo al 50% v/v en agua de grado LC-MS. Centrifugar a 4.000 g a RT durante 1 min en un rotor de ángulo fijo para recoger con la digestión del paso 2.11.
15. Almacene el eluido de la trampa de suspensión a -80 °C.
16. Seque la muestra en un concentrador de vacío.
17. Almacene la muestra seca a -80 °C.

3. Limpieza con columna de equilibrio hidrofílico-lipofílico (HLB)

1. Prepara las soluciones A (2% v/v de acetonitrilo/0,1% v/v de ácido fórmico) y B (80% v/v de acetonitrilo/0,1% v/v de ácido fórmico).
2. Disolver la muestra en 500 μL de solución A.
3. Coloque la columna en un colector de vacío y aplique presión de gas a ~1-2 mL/min.
4. Añadir 500 μL de solución B a la columna de HLB y evacuar a 1-2 mL/min; Repita dos veces.
5. Añadir 750 μL de solución A a la columna de HLB y evacuar a 1-2 mL/min; Repita dos veces.
6. Coloque un microtubo limpio de 2 mL en la gradilla debajo de la columna de HLB, cargue la muestra en 500 μL de solución A y presione el gas como se indicó anteriormente; Pase el flujo a la columna por segunda vez.
7. Coloque la columna de HLB sobre el tubo de desagüe, agregue 500 μL de solución A y evacúe como se indicó anteriormente; Repita dos veces.
8. Coloque la columna sobre un microtubo limpio de 2 mL, agregue 500 μL de solución B y evacúe como se indicó anteriormente; Repita dos veces.
9. Congele el eluido a -80 °C y luego séquelo en un concentrador de vacío. Almacene el residuo seco a -80 °C.
10. Disuelva el residuo en 20 μL de acetonitrilo al 2% v/v de ácido fórmico al 0,1% v/v antes del análisis de MS. Utilice un espectrofotómetro para estimar la concentración de péptidos a una absorbancia de 205 nm.

4. Análisis por espectrometría de masas

1. Cromatografía líquida monodimensional de fase inversa (LC)-MS/MS
   1. Inyecte una masa igual de péptidos (~600 ng) en nano-LC de 1 dimensión y fraccione en columnas C18 de fase reversa.
   2. Eluir los péptidos directamente en el MS a una tensión de pulverización de 1,8 kV, con un tubo de transferencia de iones mantenido a 250 °C.
   3. Adquiera los espectros en el modo de 20 iones principales dependiente de los datos, donde el fragmento MS/MS más intenso se elimina de la cola de análisis para mejorar la profundidad del mapeo de iones en iones de menor abundancia.

5. Análisis de datos y bioinformática

1. Procedimientos de tratamiento de datos
   1. Después de la asignación espectral y la identificación de péptidos y proteínas en PEAKS 12.0 (software de análisis de datos LC-MS/MS), envíe las listas de proteínas para su análisis en MetaboAnalyst 6.0 (plataforma de análisis de datos metabolómicos) utilizando el enfoque de análisis estadístico de un solo factor (https://www.metaboanalyst.ca/).
   2. Utilice el software de análisis de datos LC-MS/MS para buscar y filtrar espectros utilizando criterios estrictos de tasa de falso descubrimiento (FDR) (1% de proteína y péptido) en la base de datos FASTA revisada por ratones.
      NOTA: Los programas de búsqueda alternativos que están disponibles incluyen Maxquant, Proteome Discoverer, entre otras opciones ampliamente utilizadas.
   3. Especificar la carbamidometilación de la cisteína como una modificación fija. Especificar la oxidación de la metionina como una modificación variable.
   4. Convierta las listas al formato de valores separados por comas (CSV) y las etiquetas de grupo/muestra asignadas a cada columna y fila. Este formato es flexible en la plataforma de análisis de datos metabolómicos.
   5. Impute los valores que faltan utilizando la regla de valor mínimo de 1/5 para las variables que faltan.
   6. Filtre los datos para excluir valores muy variables mediante el rango intercuartílico, donde se utiliza una varianza del 40% para el corte.
   7. Normalice los valores a la intensidad mediana, el logaritmo₁₀ transformado y el valor medio centrado para el escalado. Utilice otros enfoques de normalización, teniendo en cuenta que los resultados pueden variar.
   8. Realice pruebas T de forma no apareada con un valor de corte p < 0,05. Realice varias correcciones de prueba en esta etapa.
      NOTA: Este estudio no realizó esta corrección para el conjunto de datos representativo para fines de presentación de datos.
   9. Indique las gráficas de volcanes para el cambio de 1,5 veces (FC) y p < 0,05.
   10. Generar mapas de calor y realizar análisis discriminantes de mínimos cuadrados parciales (PLSDA) y análisis estadísticos (variables de importancia de la proyección [VIP]) de los grupos de muestra.
   11. Los posibles candidatos para el seguimiento son lo suficientemente robustos como para eclipsar 1.5FC y p-val < 0.05 o VIP > 1.0, como se indica en el análisis de PLSDA.
   12. Genere diagramas de Venn para ilustrar las diferencias en el proteoma de todo el riñón, el túbulo y el bulbo raquídeo en ratones OVE26.

Resultados

En general, las identificaciones totales de proteínas de cada tipo de muestra fueron: 1) riñón completo (1438), 2) médula (2145) y túbulos corticales (1859). Tras el procesamiento de datos en MetaboAnalyst 6.0, el filtrado de datos y la imputación, finalmente se analizaron las identificaciones de proteínas para cada compartimento renal: riñón entero (455), médula (997) y túbulos corticales (896). La Figura 4 muestra los cambios proteómicos global...

Discusión

Los métodos presentados en este enfoque técnico están diseñados para ilustrar el análisis comparativo del proteoma de diferentes áreas del riñón. Aquí, utilizamos métodos para aislar la médula y los túbulos corticales en ratones diabéticos (OVE26) y control (FVB) y realizamos análisis bioinformáticos y de LC-MS/MS en 1 dimensión para ilustrar las diferencias básicas en el proteoma en cada parte del riñón, además del proteoma de los riñones completos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type 1A	Millipore Signal	C9891
Exploris 480 Orbitrap	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539	MS
Falcon Cell Strainer, 100 µm	VWR	21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µm	VWR	21008-952
Gibco PBS pH 7.4	Thermo	1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	VWR	PI78440
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149
MetaboAnalyst 6.0	MetaboAnalyst 6.0	https://www.metaboanalyst.ca/	metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column	Waters	186002034
PEAKS 12.0	Bioinformatics Solutions Inc		LC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL Microtube	Fisher Scientific	NC0782485
Suspension Trap (S-trap)	Protifi	C02-micro-10
TCEP	ThermoFisher Scientific	20490
TEABC	Sigma Aldrich	T7408
Trypsin Protease, MS-Grade	ThermoFisher Scientific	90057
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	Model 0884900