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Method Article
ここでは、腎臓全体、単離された皮質尿細管、および髄質プロテオームのプロテオミクス解析のための詳細なプロトコールを紹介します。また、この研究では、糖尿病マウスモデルと非糖尿病マウスの局所プロテオームも比較しています。
腎疾患におけるイベントの順序を定義することは、腎臓専門医ツールキットの臨床診療の基礎です。組織プロテオミクス解析は、腎病態生理学の基本的な生理学的および分子的プロセスを理解するための重要なアプローチです。ここで紹介する方法とプロトコルは、疾患の後遺症に関連する関心のある各特定の領域における腎臓の分子解剖を可能にします。疾患が特定の腎臓領域や独自の機能を持つ構造に及ぼす影響を判断するために、このプロトコルの目標は、簡素化されたマウス腎臓の区画化と腎皮質尿細管分離技術を、合理化されたラベルフリーの定量的プロテオミクスワークフローと並行して実証することです。これらの方法を組み合わせることで、腎臓全体、髄質コンパートメント、および腎臓の皮質尿細管構造における摂動分子パターンの同定に役立ち、病理学的状況におけるシングルセルプロテオミクスの究極的かつ最終的な目標を達成します。これらの方法をほぼすべての疾患モデルに適用することは、腎機能障害に関連する病理学のメカニズムを描写するのに役立ちます。
慢性腎臓病(CKD)は現代医学における主要な懸念事項であり、米国だけでも860億ドル以上の医療費が支出されています1。世界中で、CKDの罹患率は、糖尿病の有病率および関連する腎併存疾患とともに増加しています。米国人口の14%近くがCKDを患っています(USRDS 2024年年次報告書)。また、糖尿病性腎症はCKDの一種であり、末期腎疾患(ESRD)の主な原因であり、ESRD患者の60%が糖尿病を患っています1,2,3。糖尿病は、腎臓の機能単位であるネフロンのすべての腎臓構造と細胞型に影響を及ぼします。図1に示すように、ネフロンのさまざまな部分が腎臓皮質と髄質領域に含まれています。腎臓の大部分は尿細管で構成されています。腎尿細管機能障害と構造的病変は、糖尿病性腎症(DN)の発症に大きく寄与しており、これらの変化は腎機能の低下率とよく相関しています4,5,6,7,8。糖尿病の初期には、すべての尿細管セグメントにおけるグルコースとそれに伴うナトリウムの取り込みおよび膜輸送タンパク質の要求の増加に反応して、尿細管は肥大します。糖尿病の後半で微小血管損傷が増加すると、尿細管は萎縮と拡張を示しますが、線維化と間質の拡張があります9。私たちの研究室からの以前の研究では、糖尿病マウスの皮質尿細管に変化したプロテオームと豊富なストレス応答タンパク質が見つかりました10,11。髄質は尿中濃度を調節するために重要であり、腎臓病中の機能障害は酸化ストレスと関連しており、糖尿病は代謝活動による酸素消費量の増加、膜輸送タンパク質の活性の増加、および微小血管損傷12,13,14により、腎臓のこの領域の酸素圧の低下につながります。
DNの発生と進行の詳細なメカニズムを理解することは、疾患のモデリングとシグナル伝達プロセスの分子プロファイリング、細胞タンパク質ダイナミクスの適応的変化、および慢性疾患の損傷の影響を受ける腎細胞および組織成分の正確な定義を呼び出す新しい統合的なアプローチを必要とする継続的な取り組みです。プロテオミクス、メタボロミクス、トランスクリプトミクスは、腎臓病の分子メカニズムを解析的に調べる可能性を提供します。オミクスは、システムバイオロジーのアプローチを利用して、生物学的システムをより包括的に理解する比較的新しい分野です。プロテオミクスは、ここ数十年で腎臓学における強力なオミクスツールとなっています。バイオマーカー研究は、出版物の増加に示されているように、過去20年間で拡大しましたが、これらの発見を臨床に完全に実装するには広範な作業が必要です15。尿細管細胞集団と、腎皮質と髄質内のそれぞれの機能的役割は大きく異なるため、腎臓全体のプロテオミクス分析では、これらの異なる領域内の特定の構造に関連する独自の変化を隠すことができます。したがって、この研究の目標は、腎皮質と髄質の分離、および糸球体からの皮質尿細管の分離を実証することであり、続いて、最先端の質量分析およびバイオインフォマティクス分析のための単離構造からのタンパク質抽出物の調製に関する詳細なプロトコルを示すことです。糖尿病性腎症のマウスモデルは、疾患の進行メカニズムを定義するのに役立ちます。本研究では、早期発症型のI型糖尿病を発症し、ヒトにおける早期および後期のDNの特徴であるOVE26トランスジェニックマウスを用いて、1)糸球体濾過率の早期上昇と後期低下、2)腎肥大、3)糸球体基底膜肥厚とメサンギウム拡大、4)重度のタンパク尿、5)尿細管間質性線維症9、16、17。生後2か月のマウスを選抜して、明白な構造病変の前に尿細管コンパートメントのプロテオミクス変化を示しました。以前に報告され、図2に示されているように、生後2か月のOVE26マウスは、若い糖尿病マウスでは、近位尿細管(図2、黄色の矢印)に明らかな組織学的変化を伴わずに、糸球体メサンギウムマトリックスの拡大(図2、緑の矢印)と重度のタンパク尿17を示します。ここでは、腎臓全体、髄質、および皮質尿細管の特性評価のための複合定量的プロテオミクスアプローチを提示し、糖尿病の各コンパートメントのプロテオームの違いを解明し、説明します。
OVE26マウスとFVBマウスを用いた研究は、ルイビル大学動物管理委員会(IACUC)のガイドラインによって承認されました。トランスジェニック女性OVE26(糖尿病;株#:005564)およびFVB(非糖尿病;バックグラウンド株;Strain #:001800)マウスをJackson Laboratories(メイン州バーハーバー)から購入しました。動物は、25°Cで12時間の明暗サイクルで維持され、水と食物への自由なアクセスが与えられました。すべての研究は、生後2ヶ月のマウスで実施されました。
1.動物モデル
2. Suspension-Trap mini スピンカラム消化プロトコール
3. HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)カラムによるクリーンアップ
4. 質量分析
5. データ解析とバイオインフォマティクス
全体として、各サンプルタイプからの総タンパク質同定は、1)全腎臓(1438)、2)髄質(2145)、および皮質尿細管(1859)であった。MetaboAnalyst 6.0でのデータ処理、データフィルタリング、インピュテーションを経て、最終的に各腎臓コンパートメントのタンパク質同定を解析したのは、全腎臓(455)、髄質(997)、皮質尿細管(896)でした。 図4 は、OVE26糖尿病マ?...
この技術的アプローチで提示される方法は、腎臓のさまざまな領域の比較プロテオーム分析を説明するように設計されています。ここでは、糖尿病マウス(OVE26)および対照マウス(FVB)の髄質および皮質尿細管を単離する方法を利用し、1次元LC-MS/MSおよびバイオインフォマティクス解析を行い、腎臓全体のプロテオームに加えて、腎臓の各部分のプロテオームの基本的な...
著者は開示していません。
このプロジェクトの作業の一部は、MTB(NIH K01DK080951)とTDC(NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04)、ルイビル大学腎臓病プログラムとプロテオミクス技術センター(TDC、MTB)の資金によって支援されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase type 1A | Millipore Signal | C9891 | |
Exploris 480 Orbitrap | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539 | MS |
Falcon Cell Strainer, 100 µm | VWR | 21008-950 | |
Falcon Cell Strainer, 70 µm | VWR | 21008-952 | |
Gibco PBS pH 7.4 | Thermo | 1001023 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | VWR | PI78440 | |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | |
MetaboAnalyst 6.0 | MetaboAnalyst 6.0 | https://www.metaboanalyst.ca/ | metabolomics data analysis platform |
NanoDrop 2000 | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000 | |
Oasis HLB column | Waters | 186002034 | |
PEAKS 12.0 | Bioinformatics Solutions Inc | LC-MS/MS data analysis software | |
Pestle for 1.5 mL Microtube | Fisher Scientific | NC0782485 | |
Suspension Trap (S-trap) | Protifi | C02-micro-10 | |
TCEP | ThermoFisher Scientific | 20490 | |
TEABC | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trypsin Protease, MS-Grade | ThermoFisher Scientific | 90057 | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | Model 0884900 |
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