小鼠肾损伤糖尿病发病机制中全肾、髓质和皮质小管的比较蛋白质组学分析

摘要

在这里，我们提出了一个详细的方案，用于整个肾脏、离体皮质小管和髓质蛋白质组的蛋白质组学分析。该研究还比较了糖尿病小鼠模型和非糖尿病小鼠中的区域蛋白质组。

摘要

定义肾脏疾病的事件顺序是肾脏病学工具包中临床实践的基石。组织蛋白质组学分析是了解肾脏病理生理学的基本生理和分子过程的重要方法。我们在这里介绍的方法和协议将允许在与疾病后遗症相关的每个特定感兴趣区域对肾脏进行分子解剖。为了确定疾病对具有独特功能的特定肾脏区域和结构的影响，该方案的目标是展示简化的小鼠肾区室化和肾皮质小管分离技术与简化的无标记定量蛋白质组学工作流程相结合。结合这些方法将有助于识别整个肾脏、髓质隔室和肾脏皮质小管结构中扰动的分子模式，最终目标是在病理环境中进行单细胞蛋白质组学。将这些方法应用于几乎任何疾病模型都将有助于描述与肾功能障碍相关的病理机制。

引言

慢性肾病 （CKD） 是现代医学的一个主要问题，仅在美国，医疗保健支出就超过 860 亿美元¹。在世界范围内，CKD 的发病率随着糖尿病和相关肾脏合并症的患病率而增加。近 14% 的美国人口患有 CKD（USRDS 2024 年年度报告）。此外，糖尿病肾病是 CKD 的一种形式，是终末期肾病 （ESRD） 的主要原因，60% 的 ESRD 患者患有糖尿病 ^1,2,3。糖尿病会影响肾单位（肾脏的功能单位）的所有肾脏结构和细胞类型。如图 1 所示，肾单位的不同部分包含在肾皮层和延髓区域。肾脏的大部分由小管组成。肾小管功能障碍和结构病变显着导致糖尿病肾病 （DN） 的发生，这些变化与肾功能下降的速度密切相关 ^4,5,6,7,8。在糖尿病早期，为了响应所有肾小管段中葡萄糖和相关的钠摄取和膜转运蛋白需求增加，肾小管会肥大。随着糖尿病后期微血管损伤的增加，肾小管表现出萎缩和扩张，同时间质⁹ 出现纤维化和扩张。我们实验室以前的研究发现，糖尿病小鼠的皮质小管中存在蛋白质组改变和丰富的应激反应蛋白^10,11。髓质对于调节尿液浓度很重要，肾病期间的功能障碍与氧化应激有关，糖尿病导致肾脏该区域的氧张力降低，这是由于代谢活动耗氧量增加、膜转运蛋白活性增加和微血管损伤 12,13,14。

了解 DN 发展和进展的详细机制是一项持续的工作，需要新颖和综合的方法，调用疾病建模和信号传导过程的分子分析、细胞蛋白质动力学的适应性变化以及慢性病中受损伤影响的肾细胞和组织成分的精确定义。蛋白质组学、代谢组学和转录组学为分析探索肾脏疾病的分子机制提供了可能性。组学是一个相对较新的领域，它利用系统生物学方法来获得对生物系统的更全面的理解。近几十年来，蛋白质组学一直是肾脏病学领域强大的组学工具。正如出版物的增长所表明的那样，生物标志物研究在过去 20 年中得到了扩展，尽管需要做大量的工作才能将这些发现完全应用于临床¹⁵。由于肾小管细胞群在肾皮质和髓质内各自的功能作用差异很大，因此整个肾脏的蛋白质组学分析可以掩盖与这些不同区域内的特定结构相关的独特变化。因此，本研究的目标是证明肾皮层和延髓的分离，以及皮质小管与肾小球的分离，然后是从分离结构中制备蛋白质提取物的详细方案，用于最先进的质谱和生物信息学分析。糖尿病肾病的小鼠模型有助于确定疾病进展的机制。在这项研究中，我们使用了 OVE26 转基因小鼠，该小鼠发展为早发性 I 型糖尿病，并在人类中表现出早期和晚期 DN 的特征，包括 1） 肾小球滤过率的早期上升和晚期下降，2） 肾脏肥大，3） 肾小球基底膜增厚和系膜扩张，4） 严重蛋白尿，以及 5） 肾小管间质纤维化^9，16,17.选择两个月大的小鼠来证明明显结构病变之前小管室的蛋白质组学变化。如前所述，如图 2 所示，2 个月大的 OVE26 小鼠表现出肾小球系膜基质扩张（图 2，绿色箭头）和严重的蛋白尿¹⁷，在年轻的糖尿病小鼠中，近端小管没有明显的组织学变化（图 2，黄色箭头）。在这里，我们提出了一种用于表征整个肾脏、髓质和皮质小管的组合定量蛋白质组学方法，以阐明和说明糖尿病每个隔室中蛋白质组的差异。

研究方案

OVE26 和 FVB 小鼠的研究已获得路易斯维尔大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 指南的批准。转基因雌性 OVE26（糖尿病;菌株 #：005564） 和 FVB（非糖尿病;背景菌株;菌株 #：001800） 小鼠购自 Jackson Laboratories （Bar Harbor， ME）。将动物在 25 °C 下维持 12 小时的光照/黑暗循环，并自由获得水和食物。所有研究均在 2 个月大的小鼠身上进行。

1. 动物模型

1. 肾脏隔离
   1. 通过腹膜内施用 80 mg/kg 氯胺酮和 12 mg/kg 甲苯噻嗪来麻醉小鼠。
   2. 用小手术剪刀做一个中线腹部切口，然后用棉签轻轻地将肠道移出并移动到小鼠的侧面，以露出腔静脉。
   3. 在右肾上方的腔静脉上做一个小切口。
   4. 用 20 mL 冷磷酸盐缓冲盐水（PBS：pH 7.4;210 mg/L KH₂PO₄、9 g/L NaCl、726 mg/L Na₂HPO_4·7H₂O） 使用蠕动泵，速率为 10 mL/min。
      注意：如果肾脏中血液蛋白和细胞的包含不是下游分析中的关键因素，则不需要此步骤。
   5. 使用小手术剪刀切除肾脏。去除肾脏外部多余的脂肪。称量肾脏并将它们放入冰上的冷 PBS 中。
   6. 取出肾包膜。
   7. 将肾脏放在玻璃板或置于冰上的培养皿上。使用剃须刀片（图 3）在肾脏上切开几次，最终在肾脏的上极和下极之间形成 3-4 片。
   8. 从每个肾脏中保留 1-2 个中间切片和两个极（ 图 3 中圈出的肾切片）作为“全肾”样品。将一部分放入 1.5 mL 离心管中，加入冰冷的匀浆缓冲液（10% 甘油、50 mM HEPES、100 mM KCl、2 mM EDTA、0.1% NP40、10 mM NaF、0.25 mM NaVO₃、1x HALTS 蛋白酶抑制剂），约含 10 μL/mg 组织样品（基于来自获得性肾脏重量的肾切片估计质量）。将管子留在冰上。
   9. 对于中间横向切片的其余部分，将切片平放，并使用剃须刀片或手术刀小心地从每个切片上切掉皮层（外侧 1 毫米）（图 3，示意图工作流程）。将皮质与髓质区域分开，以进行皮质小管分离方案（下面，步骤 1.3）。
   10. 将一部分解剖的髓质放入 1.5 mL 离心管中，如步骤 1.1.8 所示加入冰冷的匀浆缓冲液，然后将管子放在冰上。
   11. 在液氮中快速冷冻所有剩余的未用于均质化的全肾和髓质碎片，并储存在 -80 °C。
2. 或者，冷冻所有分离的全肾和髓质隔室，并按照步骤 1.1.11 中的说明储存它们。稍后将它们从储存中取出，以便按照步骤 1.1.8 添加匀浆缓冲液。
3. 皮质小管分离
   1. 用剃须刀片在玻璃板或培养皿上将解剖的皮层切成 1-3 毫米的小块，形成糊状。
   2. 在 37 °C 下，在摇摆水浴中，将 1 mL IA 型胶原酶 （1 mg/mL） 中的碎皮质消化 30 分钟。
   3. 将 100 μm 细胞过滤器放在冰上的 50 mL 锥形管顶部。
   4. 将消化的皮质悬液放在 100 μm 细胞过滤器上，并使用 10 mL 注射器的柱塞轻轻按压过滤器。用 1 mL PBS 清洗过滤器顶部，用 1 mL PBS 清洗过滤器底部。
   5. 将 50 mL 试管中的滤液通过额外的 100 μm 过滤器，然后用 1 mL PBS 清洗过滤器顶部。
   6. 将滤液通过放置在冰上的 50 mL 锥形管上的 70 μm 细胞过滤器。小管将通过该过滤器进入滤液（肾小球将保留在 70 μm 过滤器上）。用 1 mL PBS 清洗过滤器。
   7. 将最终滤液在 4 °C 下以 120 × g 旋转 2 分钟。 丢弃小管沉淀中多余的 PBS。
   8. 使用 10 倍物镜在显微镜下观察，检查皮质小管颗粒的纯度。如果超过 10% 的馏分含有肾小球，则用 1 mL PBS 重悬滤液，并通过干净的 70 μm 细胞过滤器，无需额外清洗过滤器。
   9. 将富集的小管组分分配到 1.5 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 2000 × g 旋转 2 分钟。 丢弃上清液。
   10. 与整个肾脏和髓质一样，向小管沉淀中加入匀浆缓冲液（步骤 1.1.8 和 1.1.10）。
4. 组织匀浆/蛋白质提取
   1. 使用专用于 1.5 mL 试管的塑料研杵在 1.5 mL 微量离心管中对每种样品类型进行均质化。如果均质悬浮液太稠，请根据需要添加额外的均质缓冲液。
   2. 将匀浆悬浮液在冰上放置 15 分钟，然后在浴式超声仪（仅开/关开关，设备上无可调设置）中超声处理 5 分钟，在 25 °C 的浴中加水。 将样品放在冰上 10 分钟。
   3. 短暂涡旋 （1000-1500 RPM） 匀浆，然后用移液管研磨 20 次，再在冰上放置 15 分钟。
   4. 在 4 °C 下以 13,000 × g 离心 20 分钟之前，将样品研磨数次。
   5. 将澄清的蛋白质提取物转移到干净的试管中。
   6. 分装 30 μL 澄清的提取物，用于蛋白质估计和质谱分析的样品制备。将剩余的样品储存在 -80 °C。

2. Suspension-Trap 小型离心柱消解方案

1. 将蛋白质蛋白水解消化成胰蛋白酶片段，用于蛋白质组学分析
2. 将 ~40-50 μg 样品（~2 μg/μL）稀释到样品裂解缓冲液（10% w/v 十二烷基硫酸钠 [SDS] 溶于 100 mM 碳酸氢三乙基铵 （TEA-BC） pH 8.5、40 mM 三（2-羧乙基）膦 [TCEP] 中）至最终体积为 46 μL。
3. 蛋白质的还原和烷基化
   1. 在 65 °C 下孵育 30 分钟（TCEP 的最终浓度为 20 mM）。
   2. 在液相色谱-质谱 （LC-MS） 级水中加入 4 μL 0.5 M 碘乙酰胺，并在室温 （RT） 下避光孵育 30 分钟（碘乙酰胺的最终浓度为 40 mM）。
4. 加入 5 μL 12% w/w 磷酸的 LC-MS 级水中（将 141 μL 85% 磷酸稀释到 859 μL 水中，加入 12% 溶液）。
   1. 磷酸的替代品，如果进行磷酸肽富集，则使用三氟乙酸或甲酸¹⁸。
5. 加入 350 μL 悬浮捕集结合缓冲液（100 mM TEA-BC 溶于 90% v/v 甲醇/10% v/v 水，pH 7.55）。
6. 将样品加入悬浮捕集柱中。在固定角转子中在 RT 下以 4,000 × g 离心 30 秒，使每个体积通过色谱柱。
7. 用 4x 400 μL 悬浮捕集结合缓冲液洗涤。在固定角转子中在 RT 下以 4,000 x g 离心 30 秒，以使每次洗涤通过色谱柱。
   注：为了帮助去除 SDS，请在每次洗涤后将转子中的色谱柱旋转 180°。
8. 在 RT 下以 4,000 g 离心 1 分钟以完全去除结合缓冲液（防止消化过程中滴落）。
9. 将悬浮捕集柱转移到干净的收集管中。
10. 在 125 μL 50 mM TEA-BC （pH 8.5）的 LC-MS 级水（胰蛋白酶，MS 级）中加入 2.5-5 μg 胰蛋白酶。胰蛋白酶与样品的最终比例为 1：20 至 1：10。
11. 在 47 °C 下孵育 2 小时（不要拧紧盖子;最好使用设置为 0 RPM 的热混合器）。用针头在瓶盖上戳一个孔可能会阻止压力在悬浮捕集阱的上腔室中形成（压力增加会导致胰蛋白酶溶液滴过色谱柱）。
12. 加入 80 μL 50 mM TEA-BC （pH 8.5）的 LC-MS 级水中。在固定角转子中，在 RT 下以 4,000 g 离心 1 分钟，使每个消化物通过色谱柱。
13. 在 LC-MS 级水中加入 80 μL 0.2% v/v 甲酸。在固定角转子中在 RT 下以 4,000 g 离心 1 分钟，以收集步骤 2.11 中的消化物。
14. 加入 80 μL 50% v/v 乙腈的 LC-MS 级水中。在固定角转子中在 RT 下以 4,000 g 离心 1 分钟，以收集步骤 2.11 中的消化物。
15. 将悬浮捕集洗脱液储存在 -80 °C。
16. 在真空浓缩器中干燥样品。
17. 将干燥的样品储存在 -80 °C。

3. 使用亲水亲油平衡 （HLB） 色谱柱进行净化

1. 制备溶液 A（2% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸）和 B（80% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸）。
2. 将样品溶解在 500 μL 溶液 A 中。
3. 将色谱柱置于真空歧管中，并以 ~1-2 mL/min 的速率施加气压。
4. 向 HLB 色谱柱中加入 500 μL 溶液 B，并以 1-2 mL/min 的速度抽真空;重复两次。
5. 向 HLB 色谱柱中加入 750 μL 溶液 A，并以 1-2 mL/min 的速度抽真空;重复两次。
6. 将干净的 2 mL 微管放在 HLB 色谱柱下方的架子上，将样品加入 500 μL 溶液 A，气体压力如上所述;再次将流通液通入色谱柱。
7. 将 HLB 柱置于废液管上方，加入 500 μL 溶液 A，然后按上述方式排空;重复两次。
8. 将色谱柱置于干净的 2 mL 微管上方，加入 500 μL 溶液 B，然后按上述方法排空;重复两次。
9. 将洗脱液在 -80 °C 下冷冻，然后在真空浓缩器中干燥。将干燥的残留物储存在 -80 °C。
10. MS 分析前，将残留物溶解在 20 μL 2% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸中。使用分光光度计估计吸光度为 205 nm 的肽浓度。

4. 质谱分析

1. 一维反相液相色谱 （LC）-MS/MS
   1. 将等质量的肽 （~600 ng） 注入一维纳米液相色谱仪上，并在反相 C18 色谱柱上进行分级分离。
   2. 在 1.8 kV 的喷雾电压下将肽直接洗脱到 MS 中，离子传输管保持在 250 °C。
   3. 在数据依赖性前 20 个离子模式下采集谱图，其中从分析队列中删除最强的 MS/MS 碎片，以提高低丰度离子的离子分布深度。

5. 数据分析和生物信息学

1. 数据处理程序
   1. 在 PEAKS 12.0（LC-MS/MS 数据分析软件）中进行光谱分配以及肽和蛋白质鉴定后，使用单因素统计分析方法 （https://www.metaboanalyst.ca/） 提交蛋白质列表以在 MetaboAnalyst 6.0（代谢组学数据分析平台）中进行分析。
   2. 使用 LC-MS/MS 数据分析软件，根据小鼠审查的 FASTA 数据库，使用严格的错误发现率 （FDR） 标准（1% 蛋白质和肽）搜索和过滤光谱。
      注意：现成的替代搜索程序包括 Maxquant、Proteome Discoverer 和其他广泛使用的选项。
   3. 将半胱氨酸的脲甲基化指定为固定修饰。将蛋氨酸的氧化指定为可变修饰。
   4. 将列表转换为逗号分隔值 （CSV） 格式，并为每个列和行分配组/样品标签。这种格式在代谢组学数据分析平台中是灵活的。
   5. 对缺失变量使用 1/5 最小值规则插补缺失值。
   6. 使用四分位距过滤数据以排除高度可变的值，其中 40% 的方差用于中断。
   7. 将值标准化为中位强度，对数₁₀ 转换，并以平均值为中心进行缩放。使用其他归一化方法，请记住结果可能会有所不同。
   8. 以非配对方式执行 T 检验，p 值截断值为 0.05<。在此阶段执行多次测试校正。
      注意：本研究没有为数据呈现目的对代表性数据集进行此校正。
   9. 表示 1.5 倍变化 （FC） 的火山图，p < 0.05。
   10. 生成热图并对样本组执行偏最小二乘判别分析 （PLSDA） 和统计（投影重要性变量 [VIP]）分析。
   11. 如 PLSDA 分析所示，潜在的随访候选者要么足够稳健，使 1.5FC 和 p-val < 0.05 或 VIP > 1.0。
   12. 生成维恩图以说明 OVE26 小鼠全肾、小管和延髓蛋白质组的差异。

结果

总体而言，每种样品类型的总蛋白质鉴定为 1） 全肾 （1438） 2） 髓质 （2145） 和皮质小管 （1859）。在 MetaboAnalyst 6.0 中进行数据处理、数据过滤和插补后，最终分析了每个肾区室的蛋白质鉴定：全肾 （455）、髓质 （997） 和皮质小管 （896）。 图 4 显示了 OVE26 糖尿病小鼠肾脏的整体蛋白质组学变化。与报告离子标记（TMT、iTRAQ 等）相比，无标记定?...

讨论

该技术方法中介绍的方法旨在说明肾脏不同区域的蛋白质组比较分析。在这里，我们利用分离糖尿病 （OVE26） 和对照 （FVB） 小鼠髓质和皮质小管的方法，并进行了一维 LC-MS/MS 和生物信息学分析，以说明肾脏每个部分蛋白质组的基本差异，以及整个肾脏的蛋白质组。

肾隔室的隔离需要仔细解剖远离髓质的皮层。对于肾脏的初始横向切片，薄片将允许...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type 1A	Millipore Signal	C9891
Exploris 480 Orbitrap	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539	MS
Falcon Cell Strainer, 100 µm	VWR	21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µm	VWR	21008-952
Gibco PBS pH 7.4	Thermo	1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	VWR	PI78440
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149
MetaboAnalyst 6.0	MetaboAnalyst 6.0	https://www.metaboanalyst.ca/	metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column	Waters	186002034
PEAKS 12.0	Bioinformatics Solutions Inc		LC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL Microtube	Fisher Scientific	NC0782485
Suspension Trap (S-trap)	Protifi	C02-micro-10
TCEP	ThermoFisher Scientific	20490
TEABC	Sigma Aldrich	T7408
Trypsin Protease, MS-Grade	ThermoFisher Scientific	90057
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	Model 0884900