Análise proteômica comparativa de rins inteiros, medula e túbulos corticais na patogênese diabética da lesão renal em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para análise proteômica de todo o rim, túbulo cortical isolado e proteomas medulares. O estudo também compara proteomas regionais em um modelo de camundongo diabético e camundongos não diabéticos.

Resumo

Definir a sequência de eventos na doença renal é a pedra angular da prática clínica no kit de ferramentas do nefrologista. As análises proteômicas teciduais são uma abordagem significativa para a compreensão dos processos fisiológicos e moleculares fundamentais da fisiopatologia renal. Os métodos e protocolos que apresentamos aqui permitirão a dissecção molecular do rim em cada região específica de interesse relacionada às sequelas da doença. Para determinar os efeitos da doença em regiões renais específicas e estruturas com funções únicas, os objetivos deste protocolo são demonstrar técnicas simplificadas de compartimentalização renal renal e isolamento do túbulo cortical renal em conjunto com fluxos de trabalho proteômicos quantitativos simplificados sem marcadores. A combinação desses métodos ajudará na identificação de padrões moleculares perturbados em todo o rim, compartimentos medulares e estruturas dos túbulos corticais dos rins, com o objetivo final e eventual da proteômica de célula única em contextos patológicos. A aplicação desses métodos em praticamente qualquer modelo de doença será útil para delinear mecanismos de patologia relacionados à disfunção renal.

Introdução

A doença renal crônica (DRC) é uma grande preocupação na medicina moderna, totalizando mais de US$ 86 bilhões em gastos com saúde somente nos Estados Unidos¹. Em todo o mundo, a incidência de DRC está aumentando com a prevalência de diabetes e comorbidades renais associadas. Cerca de 14% da população dos EUA tem DRC (relatório anual do USRDS 2024). Além disso, a nefropatia diabética é uma forma de DRC e a principal causa de doença renal terminal (DRT), e 60% dos pacientes com DRCT têm diabetes ^1,2,3. O diabetes afeta todas as estruturas renais e tipos de células dos néfrons, a unidade funcional dos rins. Conforme mostrado na Figura 1, diferentes porções de néfrons estão contidas no córtex renal e nas regiões da medula. A maior parte do rim é composta por túbulos. A disfunção dos túbulos renais e as lesões estruturais contribuem significativamente para o desenvolvimento da nefropatia diabética (ND), e essas alterações se correlacionam bem com a taxa de declínio da função renal 4,5,6,7,8. No início do diabetes, em resposta ao aumento da glicose e à captação de sódio associada e às demandas de proteína de transporte de membrana em todos os segmentos dos túbulos, os túbulos sofrem hipertrofia. Com o aumento da lesão microvascular mais tardia no diabetes, os túbulos apresentam atrofia e dilatação, enquanto há fibrose e expansão do interstício⁹. Estudos anteriores de nosso laboratório encontraram proteomas alterados e uma abundância de proteínas de resposta ao estresse em túbulos corticais de camundongos diabéticos^10,11. A medula é importante para regular a concentração urinária, e a disfunção durante a doença renal está associada ao estresse oxidativo, com o diabetes levando à diminuição da tensão de oxigênio nessa região do rim devido ao aumento do consumo de oxigênio das atividades metabólicas, aumento da atividade das proteínas de transporte da membrana e lesão microvascular 12,13,14.

Compreender os mecanismos detalhados de desenvolvimento e progressão da ND é um esforço contínuo que exigirá abordagens novas e integradas que invoquem modelagem de doenças e perfil molecular de processos de sinalização, mudanças adaptativas na dinâmica de proteínas celulares e definição precisa de células renais e componentes teciduais afetados por lesões em condições crônicas. Proteômica, metabolômica e transcriptômica oferecem a possibilidade de sondar analiticamente os mecanismos moleculares das doenças renais. A ômica é um campo relativamente novo que utiliza abordagens de biologia de sistemas para obter uma compreensão mais global dos sistemas biológicos. A proteômica tem sido uma poderosa ferramenta ômica em nefrologia nas últimas décadas. A pesquisa de biomarcadores se expandiu nos últimos 20 anos, conforme indicado no crescimento das publicações, embora seja necessário um trabalho extenso para implementar totalmente esses achados na clínica¹⁵. Com as populações de células tubulares amplamente diferentes e respectivos papéis funcionais no córtex renal e na medula, a análise proteômica de rins inteiros pode mascarar alterações únicas associadas a estruturas específicas nessas diferentes regiões. Portanto, os objetivos deste estudo são demonstrar a separação do córtex renal e da medula, bem como a separação dos túbulos corticais dos glomérulos, seguidos de protocolos detalhados para a preparação de extratos proteicos de estruturas isoladas para espectrometria de massas e análises de bioinformática de última geração. Modelos de camundongos de nefropatia diabética são fundamentais na definição de mecanismos de progressão da doença. Para este estudo, usamos o camundongo transgênico OVE26, que desenvolve diabetes tipo I de início precoce e mostra características de ND em estágio inicial e tardio em humanos, incluindo 1) um aumento precoce e declínio posterior na taxa de filtração glomerular, 2) hipertrofia renal, 3) espessamento da membrana basal glomerular e expansão mesangial, 4) proteinúria grave e 5) fibrose túbulo-intersticial^{9, 16,17}. Camundongos com dois meses de idade foram escolhidos para demonstrar alterações proteômicas nos compartimentos dos túbulos antes de lesões estruturais evidentes. Como relatado anteriormente e mostrado na Figura 2, camundongos OVE26 de 2 meses de idade exibem expansão da matriz mesangial glomerular (Figura 2, seta verde) e proteinúria grave¹⁷, sem alterações histológicas evidentes nos túbulos proximais (Figura 2, seta amarela) em camundongos jovens diabéticos. Aqui, apresentamos uma abordagem proteômica quantitativa combinada para a caracterização de todo o rim, medula e túbulos corticais para elucidar e ilustrar as diferenças no proteoma em cada compartimento com diabetes.

Protocolo

Estudos com camundongos OVE26 e FVB foram aprovados pelas diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Louisville (IACUC). Fêmea transgênica OVE26 (diabética; Cepa #:005564) e FVB (não diabético; cepa de fundo; Cepa #: 001800) foram comprados da Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h a 25 °C e tiveram livre acesso à água e à comida. Todos os estudos foram realizados em camundongos de 2 meses de idade.

1. Modelo animal

1. Isolamento renal
   1. Anestesiar camundongos administrando intraperitonealmente 80 mg / kg de cetamina e 12 mg / kg de xilazina.
   2. Faça uma incisão abdominal na linha média com uma pequena tesoura cirúrgica e mova suavemente os intestinos para fora e para o lado do camundongo usando cotonetes para expor a veia cava.
   3. Faça um pequeno corte na veia cava acima do rim direito.
   4. Perfunda o camundongo através do ventrículo esquerdo com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS: pH 7,4; 210 mg / L KH₂PO₄, 9 g / L NaCl, 726 mg / L Na₂HPO_{4 ·}7H₂O) usando uma bomba peristáltica, a uma taxa de 10 mL / min.
      NOTA: Esta etapa não é necessária se a inclusão de proteínas e células do sangue nos rins não for um fator crítico nas análises a jusante.
   5. Remova os rins usando uma pequena tesoura cirúrgica. Remova qualquer excesso de gordura do lado de fora dos rins. Pese os rins e coloque-os em PBS frio no gelo.
   6. Remova a cápsula renal.
   7. Coloque os rins em uma placa de vidro ou placa de Petri colocada no gelo. Faça vários cortes transversais nos rins usando uma lâmina de barbear (Figura 3) para obter 3-4 cortes entre os pólos superior e inferior dos rins.
   8. Reserve 1-2 fatias do meio e os dois pólos (fatias de rim circuladas na Figura 3) de cada rim para servir como amostras de "rim inteiro". Coloque uma porção em tubos de centrífuga de 1,5 mL e adicione tampão de homogeneização gelado (10% de glicerol, 50 mM HEPES, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,1% NP40, 10 mM NaF, 0,25 mM NaVO₃, 1x inibidor de protease HALTS) a aproximadamente 10 μL / mg de amostra de tecido (com base na massa estimada de fatias de rim, derivada do peso do rim adquirido). Deixe o tubo no gelo.
   9. Para o restante das fatias transversais do meio, coloque a fatia plana e corte cuidadosamente o córtex (1 mm externo) de cada fatia usando uma lâmina de barbear ou bisturi (Figura 3, fluxo de trabalho esquemático). Mantenha o córtex separado das regiões da medula para o protocolo de isolamento do túbulo cortical (abaixo, etapa 1.3).
   10. Coloque uma parte da medula dissecada em tubos de centrífuga de 1,5 mL, adicione tampão de homogeneização gelado como na etapa 1.1.8 e deixe o tubo no gelo.
   11. Congelar em nitrogênio líquido todos os pedaços restantes de rim inteiro e medula não usados para homogeneização e armazenar a -80 ° C.
2. Em alternativa, congele todos os compartimentos separados do rim inteiro e da medula e guarde-os conforme descrito no passo 1.1.11. Remova-os do armazenamento posteriormente para a adição de tampão de homogeneização, como na etapa 1.1.8.
3. Isolamento do túbulo cortical
   1. Pique o córtex dissecado em pedaços de 1-3 mm em uma placa de vidro ou placa de Petri com uma lâmina de barbear, formando uma pasta.
   2. Digerir o córtex picado em 1 ml de colagenase tipo IA (1 mg/ml) durante 30 min, a 37 °C, em banho-maria.
   3. Coloque um filtro de células de 100 μm em cima de um tubo cônico de 50 mL no gelo.
   4. Coloque a suspensão cortical digerida no filtro de células de 100 μm e pressione suavemente através do filtro usando o êmbolo de uma seringa de 10 mL. Lave a parte superior do filtro com 1 mL de PBS e a parte inferior do filtro com 1 mL de PBS.
   5. Passe o filtrado no tubo de 50 mL por um filtro adicional de 100 μm e, em seguida, lave a parte superior do filtro com 1 mL de PBS.
   6. Passar o filtrado através de um filtro de células de 70 μm colocado sobre um tubo cónico de 50 ml sobre gelo. Os túbulos passarão por este filtro para o filtrado (os glomérulos serão retidos no filtro de 70 μm). Lave o filtro com 1 mL de PBS.
   7. Girar o filtrado final a 120 × g durante 2 min a 4 °C. Descarte o excesso de PBS do pellet do túbulo.
   8. Verifique a pureza do grânulo do túbulo cortical por visualização ao microscópio, usando uma objetiva de 10x. Se mais de 10% da fração contiver glomérulos, ressuspenda o filtrado com 1 mL de PBS e passe por um filtro de células limpo de 70 μm sem qualquer lavagem adicional do filtro.
   9. Distribuir a fracção dos túbulos enriquecidos em tubos de centrifugação de 1,5 ml e centrifugar a 2000 × g durante 2 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   10. Adicione tampão de homogeneização ao grânulo do túbulo como em todo o rim e medula (etapas 1.1.8 e 1.1.10).
4. Homogeneização de tecidos/extração de proteínas
   1. Homogeneizar cada tipo de amostra em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pilão de plástico especificamente para tubos de 1,5 mL. Se a suspensão homogeneizada for muito espessa, adicione tampão de homogeneização adicional conforme necessário.
   2. Deixe a suspensão homogeneizada no gelo por 15 min, seguida de sonicação por 5 min em um sonicador de banho (somente interruptor liga/desliga, sem configurações ajustáveis na unidade), com água no banho a 25 °C. Deixe as amostras no gelo por 10 min.
   3. Homogeneizar brevemente o vórtice (1000-1500 RPM), triturar 20 vezes com uma pipeta e deixar no gelo por mais 15 min.
   4. Triturar as amostras várias vezes antes da centrifugação a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.
   5. Transfira extratos de proteínas eliminados para tubos limpos.
   6. Alíquota 30 μL de extrato limpo para estimativa de proteínas e preparação de amostras para análise de espectrometria de massa. Armazenar o restante das amostras a -80 °C.

2. Protocolo de digestão da coluna giratória Suspension-Trap mini

1. Digestão proteolítica de proteínas em fragmentos trípticos para análises proteômicas
2. Diluir ~40-50 μg de amostra (a ~2 μg/μL) em tampão de lise de amostra (10% p/v de dodecil sulfato de sódio [SDS] em 100 mM de bicarbonato de trietilamônio (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM de tris (2-carboxietil)fosfina [TCEP]) até um volume final de 46 μL.
3. Redução e alquilação de proteínas
   1. Incubar a 65 °C durante 30 min (a concentração final de TCEP é de 20 mM).
   2. Adicione 4 μL de iodoacetamida 0,5 M em água de grau de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) e incube à temperatura ambiente (RT) no escuro por 30 min (a concentração final de iodoacetamida é de 40 mM).
4. Adicione 5 μL de ácido fosfórico a 12% p / p em água de grau LC-MS (dilua 141 μL de ácido fosfórico a 85% em 859 μL de água para solução a 12%).
   1. Alternativa ao ácido fosfórico, use ácido trifluoroacético ou ácido fórmico se realizar enriquecimento fosfopeptídico¹⁸.
5. Adicione 350 μL de tampão de ligação suspensão-armadilha (100 mM TEA-BC em 90% v / v metanol / 10% v / v água pH 7,55).
6. Adicione exemplo à coluna de armadilha de suspensão. Centrifugue a 4.000 × g por 30 s em RT em um rotor de ângulo fixo para passar cada volume pela coluna.
7. Lavar com 4x 400 μL de tampão de ligação suspensão-armadilha. Centrifugue a 4.000 x g por 30 s em RT em um rotor de ângulo fixo para passar cada lavagem pela coluna.
   NOTA: Para auxiliar na remoção do SDS, gire a coluna no rotor 180° após cada lavagem.
8. Centrifugue a 4.000 g por 1 min em RT para remover completamente o tampão de ligação (evita gotejamento durante a digestão).
9. Transferir a coluna de sifão para um tubo de recolha limpo.
10. Adicione 2,5-5 μg de tripsina em 125 μL de 50 mM TEA-BC pH 8,5 em água de grau LC-MS (Tripsina Protease, Grau MS). A proporção final de tripsina para a amostra é de 1:20 a 1:10.
11. Incubar a 47 °C durante 2 h (não apertar a tampa; é preferível um misturador térmico regulado para 0 RPM). Fazer um furo na tampa com uma agulha pode impedir que a pressão se acumule na câmara superior da armadilha de suspensão (o aumento da pressão fará com que a solução de tripsina escorra pela coluna).
12. Adicione 80 μL de 50 mM TEA-BC pH 8,5 em água de grau LC-MS. Centrifugue a 4.000 g em RT por 1 min em um rotor de ângulo fixo para passar cada digestão pela coluna.
13. Adicione 80 μL de ácido fórmico a 0,2% v/v em água de grau LC-MS. Centrifugar a 4.000 g durante 1 min a RT num rotor de ângulo fixo para recolher com digestão do passo 2.11.
14. Adicione 80 μL de acetonitrila a 50% v/v em água de grau LC-MS. Centrifugar a 4.000 g em RT durante 1 min num rotor de ângulo fixo para recolher com o resumo do passo 2.11.
15. Conservar o eluído do colector de suspensão a -80 °C.
16. Secar a amostra num concentrador de vácuo.
17. Armazenar a amostra seca a -80 °C.

3. Limpeza com coluna de equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB)

1. Faça as soluções A (2% v / v de acetonitrila / 0,1% v / v de ácido fórmico) e B (80% v / v de acetonitrila / 0,1% de ácido fórmico).
2. Dissolver a amostra em 500 μL da solução A.
3. Coloque a coluna em um coletor de vácuo e aplique pressão de gás a ~ 1-2 mL / min.
4. Adicione 500 μL de solução B à coluna HLB e evacue a 1-2 mL / min; Repita duas vezes.
5. Adicione 750 μL de solução A à coluna HLB e evacue a 1-2 mL / min; Repita duas vezes.
6. Coloque um microtubo limpo de 2 mL no rack abaixo da coluna HLB, carregue a amostra em 500 μL de solução A e pressão de gás como acima; Passe o fluxo para a coluna uma segunda vez.
7. Colocar a coluna HLB por cima do tubo de resíduos, adicionar 500 μL da solução A e evacuar como acima; Repita duas vezes.
8. Coloque a coluna acima de um microtubo limpo de 2 mL, adicione 500 μL de solução B e evacue como acima; Repita duas vezes.
9. Congelar o eluído a -80 °C e secar num concentrador de vácuo. Armazenar o resíduo seco a -80 °C.
10. Dissolva o resíduo em 20 μL de acetonitrila a 2% v/v/ácido fórmico a 0,1% v/v antes da análise de MS. Utilizar um espectrofotómetro para estimar a concentração de peptídeos a uma absorvância de 205 nm.

4. Análise por espectrometria de massa

1. Cromatografia líquida de fase reversa unidimensional (LC)-MS/MS
   1. Injete uma massa igual de peptídeos (~ 600 ng) em nano-LC de 1 dimensão e fracione-a em colunas de fase C18 invertida.
   2. Eluir os peptídeos diretamente no MS a uma tensão de pulverização de 1,8 kV, com um tubo de transferência de íons mantido a 250 °C.
   3. Adquira os espectros no modo de 20 íons principais dependentes de dados, onde o fragmento MS/MS mais intenso é removido da fila de análise para melhorar a profundidade do mapeamento de íons em íons de menor abundância.

5. Análise de dados e bioinformática

1. Procedimentos de tratamento de dados
   1. Após a atribuição espectral e a identificação de peptídeos e proteínas no PEAKS 12.0 (software de análise de dados LC-MS/MS), envie as listas de proteínas para análise no MetaboAnalyst 6.0 (plataforma de análise de dados metabolômicos) usando a abordagem de análise estatística de fator único (https://www.metaboanalyst.ca/).
   2. Use o software de análise de dados LC-MS/MS para pesquisar e filtrar espectros usando critérios estritos de taxa de descoberta falsa (FDR) (1% de proteína e peptídeo) em relação ao banco de dados FASTA revisado por camundongos.
      NOTA: Os programas de pesquisa alternativos que estão prontamente disponíveis incluem Maxquant, Proteome Discoverer, entre outras opções amplamente utilizadas.
   3. Especificar a carbamidometilação da cisteína como uma modificação fixa. Especificar a oxidação da metionina como uma modificação variável.
   4. Converta as listas para o formato CSV (valores separados por vírgula) e rótulos de grupo/amostra atribuídos a cada coluna e linha. Este formato é flexível na plataforma de análise de dados metabolômicos.
   5. Impute os valores ausentes usando a regra do valor mínimo de 1/5 para variáveis ausentes.
   6. Filtre os dados para excluir valores altamente variáveis usando o intervalo interquartil, onde a variância de 40% é usada para o ponto de corte.
   7. Normalize os valores para intensidade mediana, log₁₀ transformado e média centralizada para dimensionamento. Use outras abordagens de normalização, tendo em mente que os resultados podem variar.
   8. Execute testes T de maneira não pareada com um valor de corte de p < 0,05. Execute várias correções de teste neste estágio.
      NOTA: Este estudo não realizou essa correção para o conjunto de dados representativo para fins de apresentação de dados.
   9. Indique gráficos de vulcões para mudança de 1,5 vezes (FC) e p < 0,05.
   10. Gerar mapas de calor e realizar análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLSDA) e análise estatística (variável de importância da projeção [VIP]) dos grupos amostrais.
   11. Os candidatos potenciais para acompanhamento são robustos o suficiente para eclipsar 1,5FC e p-val < 0,05 ou VIP > 1,0, conforme indicado na análise PLSDA.
   12. Gere diagramas de Venn para ilustrar as diferenças no proteoma de todo o rim, túbulo e medula em camundongos OVE26.

Resultados

No geral, as identificações totais de proteínas de cada tipo de amostra foram 1) rim inteiro (1438) 2) medula (2145) e túbulos corticais (1859). Após o processamento dos dados no MetaboAnalyst 6.0, filtragem de dados e imputação, as identificações de proteínas finalmente analisadas para cada compartimento renal foram: rim inteiro (455), medula (997) e túbulos corticais (896). A Figura 4 mostra as alterações proteômicas globais no rim de camundo...

Discussão

Os métodos apresentados nesta abordagem técnica são projetados para ilustrar a análise comparativa do proteoma de diferentes áreas do rim. Aqui, utilizamos métodos para isolar medula e túbulos corticais em camundongos diabéticos (OVE26) e controle (FVB) e realizamos LC-MS/MS 1dimensional e análise de bioinformática para ilustrar diferenças básicas no proteoma em cada parte do rim, além do proteoma de rins inteiros.

O isolamento dos compartimentos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type 1A	Millipore Signal	C9891
Exploris 480 Orbitrap	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539	MS
Falcon Cell Strainer, 100 µm	VWR	21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µm	VWR	21008-952
Gibco PBS pH 7.4	Thermo	1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	VWR	PI78440
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149
MetaboAnalyst 6.0	MetaboAnalyst 6.0	https://www.metaboanalyst.ca/	metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column	Waters	186002034
PEAKS 12.0	Bioinformatics Solutions Inc		LC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL Microtube	Fisher Scientific	NC0782485
Suspension Trap (S-trap)	Protifi	C02-micro-10
TCEP	ThermoFisher Scientific	20490
TEABC	Sigma Aldrich	T7408
Trypsin Protease, MS-Grade	ThermoFisher Scientific	90057
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	Model 0884900