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Method Article
여기에서는 전체 신장, 분리된 피질 세뇨관 및 수질 단백질체의 단백질체학 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 연구는 또한 당뇨병성 마우스 모델과 비당뇨병 마우스의 지역 단백질체를 비교합니다.
신장 질환에서 사건의 순서를 정의하는 것은 신장 전문의 툴킷에서 임상 실습의 초석입니다. 조직 단백질체 분석은 신장 병태생리학의 기본적인 생리학적 및 분자적 과정을 이해하기 위한 중요한 접근 방식입니다. 여기에서 제시하는 방법과 프로토콜은 질병 후유증과 관련된 각 특정 관심 영역에서 신장의 분자 박리를 가능하게 합니다. 고유한 기능을 가진 특정 신장 영역 및 구조에 대한 질병의 영향을 결정하기 위해 이 프로토콜의 목표는 간소화된 label-free 정량적 단백질체학 워크플로우와 함께 단순화된 마우스 신장 구획화 및 신장 피질 세뇨관 분리 기술을 입증하는 것입니다. 이러한 방법을 결합하면 신장의 전체 신장, 수질 구획 및 피질 세뇨관 구조에서 교란된 분자 패턴을 식별하는 데 도움이 될 것이며, 병리학적 맥락에서 단일 세포 단백질체학의 궁극적이고 궁극적인 목표를 달성할 수 있습니다. 거의 모든 질병 모델에 이러한 방법을 적용하면 신장 기능 장애와 관련된 병리학의 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.
만성 신장 질환(CKD)은 현대 의학계의 주요 관심사로, 미국에서만 860억 달러 이상의 의료 지출이 발생하고 있습니다1. 전 세계적으로 당뇨병 및 관련 신장 동반 질환의 유병률과 함께 CKD의 발병률이 증가하고 있습니다. 미국 인구의 약 14%가 CKD를 앓고 있습니다(USRDS 2024 연례 보고서). 또한, 당뇨병성 신병증은 만성콩팥병의 한 형태이며 말기 신장 질환(ESRD)의 주요 원인이며, ESRD 환자의 60%가 당뇨병을 앓고 있습니다 1,2,3. 당뇨병은 모든 신장 구조와 신장의 기능 단위인 네프론의 세포 유형에 영향을 미칩니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 네프론의 다양한 부분은 신장 피질과 수질 영역에 포함되어 있습니다. 신장의 대부분은 세뇨관으로 구성되어 있습니다. 신세뇨관 기능 장애와 구조적 병변은 당뇨병성 신병증(DN)의 발병에 크게 기여하며, 이러한 변화는 신장 기능 저하 속도(4,5,6,7,8)와 밀접한 관련이 있습니다. 당뇨병 초기에는 모든 세뇨관 분절에서 포도당 및 관련 나트륨 흡수 및 막 수송 단백질 요구량 증가에 대한 반응으로 세뇨관이 비대됩니다. 나중에 당뇨병에서 미세혈관 손상이 증가하면 세뇨관이 위축되고 확장되는 반면, 섬유화와 간질(interstitium)이 확장됩니다9. 우리 실험실의 이전 연구에서는 당뇨병 쥐의 피질 세뇨관에서 변형된 단백질체와 풍부한 스트레스 반응 단백질을 발견했습니다10,11. 수질은 소변 농도를 조절하는 데 중요하며, 신장 질환 중 기능 장애는 산화 스트레스와 관련이 있으며, 당뇨병은 신진대사 활동으로 인한 산소 소비량 증가, 막 수송 단백질의 활동 증가 및 미세혈관 손상으로 인해 신장 이 부위의 산소 장력을 감소시킵니다 12,13,14.
DN의 발달 및 진행에 대한 자세한 메커니즘을 이해하는 것은 질병 모델링 및 신호 전달 과정의 분자 프로파일링, 세포 단백질 역학의 적응적 변화, 만성 질환에서 손상의 영향을 받는 신장 세포 및 조직 구성 요소의 정확한 정의를 호출하는 새롭고 통합된 접근 방식을 요구하는 지속적인 노력입니다. 단백질체학(Proteomics), 대사체학(metabolomics) 및 전사체학(transcriptomics)은 신장 질환의 분자 메커니즘을 분석적으로 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 오믹스는 생물학적 시스템에 대한 보다 세계적인 이해를 얻기 위해 시스템 생물학 접근 방식을 활용하는 비교적 새로운 분야입니다. 단백질체학은 최근 수십 년 동안 신장학에서 강력한 오믹스 도구였습니다. 지난 20년 동안 바이오마커 연구는 출판물의 증가에서 알 수 있듯이 확장되었지만, 이러한 연구 결과를 임상에 완전히 적용하기 위해서는 광범위한 작업이 필요하다15. 신장 피질과 수질 내에서 세뇨관 세포 집단과 각각의 기능적 역할이 매우 다르기 때문에 전체 신장에 대한 단백질체학 분석은 이러한 서로 다른 영역 내의 특정 구조와 관련된 고유한 변화를 가릴 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목표는 신장 피질과 수질의 분리뿐만 아니라 사구체에서 피질 세뇨관의 분리를 입증한 다음 최첨단 질량 분석 및 생물 정보학 분석을 위해 분리된 구조에서 단백질 추출물을 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 당뇨병성 신병증의 마우스 모델은 질병 진행의 메커니즘을 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 본 연구를 위해 OVE26 형질전환 마우스를 사용하였는데, 이 마우스는 1) 사구체 여과율의 조기 상승 및 후기 감소, 2) 신장 비대, 3) 사구체 기저막 비후 및 중간막 확장, 4) 중증 단백뇨, 5) 세뇨관 간질성 섬유증9 등 인간에서 초기 및 후기 단계의 DN 특징을 보여줍니다. 16,17. 생후 2개월 된 쥐를 선택하여 명백한 구조적 병변이 발생하기 전에 세뇨관 구획의 단백체 변화를 입증했습니다. 이전에 보고되고 그림 2에서 볼 수 있듯이, 2개월 된 OVE26 마우스는 어린 당뇨병 마우스에서 근위세뇨관(그림 2, 노란색 화살표)에 대한 명백한 조직학적 변화 없이 사구체 간막 기질 확장(그림 2, 녹색 화살표)과 중증 단백뇨17을 나타냅니다. 여기에서는 당뇨병이 있는 각 구획의 단백질체의 차이를 설명하고 설명하기 위해 전체 신장, 수질 및 피질 세뇨관의 특성을 규명하기 위한 결합된 정량적 단백질체학 접근법을 제시합니다.
OVE26 및 FVB 마우스를 사용한 연구는 루이빌 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침에 의해 승인되었습니다. 형질전환 여성 OVE26(당뇨병; 균주 #:005564) 및 FVB(비당뇨병성, 배경 균주; 균주 #:001800) 마우스는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 구입했습니다. 동물들은 25°C에서 12시간 동안 명암 주기로 유지되었으며 물과 음식을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. 모든 연구는 생후 2개월 된 쥐를 대상으로 수행되었습니다.
1. 동물 모형
2. Suspension-Trap 미니 스핀 컬럼 소화 프로토콜
3. 친수성-친유성 균형(HLB) 컬럼으로 정리
4. 질량 분석 분석
5. 데이터 분석 및 생물 정보학
전체적으로 각 샘플 유형에서 확인된 총 단백질은 1) 전체 신장(1438), 2) 수질(2145) 및 피질 세뇨관(1859)이었습니다. MetaboAnalyst 6.0의 데이터 처리, 데이터 필터링 및 대치에 따라 최종적으로 분석된 각 신장 구획에 대한 단백질 식별은 전체 신장(455), 수질(997) 및 피질 세뇨관(896)이었습니다. 그림 4 는 OVE26 당뇨병성 마우스 신장의 전반적인 단백질체 변화...
이 기술적 접근 방식에서 제시된 방법은 신장의 여러 영역에 대한 비교 단백질체 분석을 설명하기 위해 고안되었습니다. 여기에서는 당뇨병(OVE26) 및 대조군(FVB) 마우스에서 수질 및 피질 세뇨관을 분리하는 방법을 활용하고 1차원 LC-MS/MS 및 생물정보학 분석을 수행하여 전체 신장의 단백체 외에도 신장의 각 부분에 있는 단백체의 기본적인 차이를 설명했습니다.
저자는 공개하지 않습니다.
이 프로젝트를 위한 작업은 MTB(NIH K01DK080951) 및 TDC(NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04), 루이빌 대학교 신장 질환 프로그램 및 단백질체학 기술 센터(TDC, MTB)에 대한 자금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase type 1A | Millipore Signal | C9891 | |
Exploris 480 Orbitrap | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539 | MS |
Falcon Cell Strainer, 100 µm | VWR | 21008-950 | |
Falcon Cell Strainer, 70 µm | VWR | 21008-952 | |
Gibco PBS pH 7.4 | Thermo | 1001023 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | VWR | PI78440 | |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | |
MetaboAnalyst 6.0 | MetaboAnalyst 6.0 | https://www.metaboanalyst.ca/ | metabolomics data analysis platform |
NanoDrop 2000 | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000 | |
Oasis HLB column | Waters | 186002034 | |
PEAKS 12.0 | Bioinformatics Solutions Inc | LC-MS/MS data analysis software | |
Pestle for 1.5 mL Microtube | Fisher Scientific | NC0782485 | |
Suspension Trap (S-trap) | Protifi | C02-micro-10 | |
TCEP | ThermoFisher Scientific | 20490 | |
TEABC | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trypsin Protease, MS-Grade | ThermoFisher Scientific | 90057 | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | Model 0884900 |
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