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Method Article
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die proteomische Analyse der gesamten Niere, des isolierten kortikalen Tubulus und der medullären Proteome vor. Die Studie vergleicht auch regionale Proteome in einem diabetischen Mausmodell mit nicht-diabetischen Mäusen.
Die Definition der Abfolge von Ereignissen bei Nierenerkrankungen ist der Eckpfeiler der klinischen Praxis im Werkzeugkasten der Nephrologen. Gewebeproteomische Analysen sind ein wichtiger Ansatz zum Verständnis der grundlegenden physiologischen und molekularen Prozesse der renalen Pathophysiologie. Die Methoden und Protokolle, die wir hier vorstellen, ermöglichen die molekulare Dissektion der Niere in jeder spezifischen Region von Interesse im Zusammenhang mit Krankheitsfolgen. Um die Auswirkungen der Krankheit auf bestimmte Nierenregionen und -strukturen mit einzigartigen Funktionen zu bestimmen, besteht das Ziel dieses Protokolls darin, eine vereinfachte Nierenkompartimentalisierung bei Mäusen und Isolationstechniken für Nierenrindentubuli in Verbindung mit optimierten markierungsfreien quantitativen proteomischen Arbeitsabläufen zu demonstrieren. Die Kombination dieser Methoden wird dazu beitragen, gestörte molekulare Muster in der gesamten Niere, in den medullären Kompartimenten und in den kortikalen Tubulusstrukturen der Niere zu identifizieren, mit dem ultimativen und letztendlichen Ziel der Einzelzellproteomik in pathologischen Kontexten. Die Anwendung dieser Methoden in praktisch jedem Krankheitsmodell wird hilfreich sein, um die Mechanismen der Pathologie im Zusammenhang mit Nierenfunktionsstörungen zu beschreiben.
Chronische Nierenerkrankungen (CKD) sind ein großes Problem in der modernen Medizin und belaufen sich allein in den Vereinigten Staaten auf über 86 Milliarden US-Dollar an Gesundheitsausgaben1. Weltweit steigt die Inzidenz von CKD mit der Prävalenz von Diabetes und den damit verbundenen renalen Komorbiditäten. Fast 14 % der US-Bevölkerung leiden an CNE (USRDS 2024 annual report). Darüber hinaus ist die diabetische Nephropathie eine Form der CNE und die Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD), und 60 % der Patienten mit Niereninsuffizienz leiden an Diabetes 1,2,3. Diabetes betrifft alle Nierenstrukturen und Zelltypen der Nephrone, der Funktionseinheit der Niere. Wie in Abbildung 1 gezeigt, sind verschiedene Anteile von Nephronen in der Nierenrinde und in der Medullaregion enthalten. Der Großteil der Niere besteht aus Tubuli. Eine Dysfunktion der Nierentubuli und strukturelle Läsionen tragen signifikant zur Entwicklung der diabetischen Nephropathie (DN) bei, und diese Veränderungen korrelieren gut mit der Rate des Rückgangs der Nierenfunktion 4,5,6,7,8. Zu Beginn des Diabetesstadiums werden die Tubuli als Reaktion auf die erhöhte Glukose- und die damit verbundene Natriumaufnahme und den Bedarf an Membrantransportproteinen in allen Tubulussegmenten hypertrophiert. Mit zunehmender mikrovaskulärer Schädigung im späteren Verlauf des Diabetes zeigen die Tubuli eine Atrophie und Dilatation, während es zu Fibrose und Ausdehnung des Interstitiumskommt 9. Frühere Studien aus unserem Labor haben veränderte Proteome und eine Fülle von Stressreaktionsproteinen in den kortikalen Tubuli von diabetischen Mäusen gefunden 10,11. Das Mark ist wichtig für die Regulierung der Urinkonzentration, und Funktionsstörungen bei Nierenerkrankungen sind mit oxidativem Stress verbunden, wobei Diabetes zu einer verminderten Sauerstoffspannung in dieser Region der Niere führt, da der Sauerstoffverbrauch durch Stoffwechselaktivitäten, die Aktivität der Membrantransportproteine erhöht ist und mikrovaskuläre Verletzungen auftreten 12,13,14.
Das Verständnis der detaillierten Mechanismen der Entwicklung und des Fortschreitens von DN ist eine fortlaufende Anstrengung, die neuartige und integrierte Ansätze erfordert, die die Modellierung von Krankheiten und die molekulare Profilierung von Signalprozessen, adaptive Veränderungen in der zellulären Proteindynamik und die genaue Definition von Nierenzell- und Gewebekomponenten umfassen, die von Verletzungen bei chronischen Erkrankungen betroffen sind. Proteomik, Metabolomik und Transkriptomik bieten die Möglichkeit, die molekularen Mechanismen von Nierenerkrankungen analytisch zu untersuchen. Omics ist ein relativ neues Gebiet, das systembiologische Ansätze nutzt, um ein globaleres Verständnis biologischer Systeme zu erlangen. Die Proteomik war in den letzten Jahrzehnten ein leistungsfähiges Omics-Werkzeug in der Nephrologie. Die Biomarkerforschung hat sich in den letzten 20 Jahren ausgeweitet, wie die Zunahme der Publikationen zeigt, obwohl umfangreiche Arbeit erforderlich ist, um diese Erkenntnisse vollständig in die Klinik zu implementieren15. Aufgrund der sehr unterschiedlichen Tubuluszellpopulationen und der jeweiligen funktionellen Rollen innerhalb der Nierenrinde und des Marks kann die proteomische Analyse ganzer Nieren einzigartige Veränderungen maskieren, die mit spezifischen Strukturen in diesen verschiedenen Regionen verbunden sind. Daher besteht das Ziel dieser Studie darin, die Trennung von Nierenrinde und Medulla sowie die Trennung von kortikalen Tubuli von Glomeruli zu demonstrieren, gefolgt von detaillierten Protokollen zur Herstellung von Proteinextrakten aus isolierten Strukturen für modernste Massenspektrometrie und bioinformatische Analysen. Mausmodelle der diabetischen Nephropathie sind maßgeblich an der Definition von Mechanismen des Krankheitsverlaufs beteiligt. Für diese Studie verwendeten wir die transgene OVE26-Maus, die einen früh einsetzenden Typ-I-Diabetes entwickelt und Merkmale einer frühen und späten DN beim Menschen aufweist, darunter 1) einen frühen Anstieg und späteren Rückgang der glomerulären Filtrationsrate, 2) renale Hypertrophie, 3) Verdickung der glomerulären Basalmembran und mesangiale Expansion, 4) schwere Proteinurie und 5) tubulointerstitielle Fibrose9, 16,17. Zwei Monate alte Mäuse wurden ausgewählt, um proteomische Veränderungen in den Tubuluskompartimenten vor offensichtlichen strukturellen Läsionen zu demonstrieren. Wie bereits berichtet und in Abbildung 2 gezeigt, zeigen 2 Monate alte OVE26-Mäuse bei jungen diabetischen Mäusen eine Expansion der glomerulären mesangialen Matrix (Abbildung 2, grüner Pfeil) und eine schwere Proteinurie17, ohne offensichtliche histologische Veränderungen der proximalen Tubuli (Abbildung 2, gelber Pfeil). Hier stellen wir einen kombinierten quantitativen Proteomik-Ansatz zur Charakterisierung der gesamten Niere, des Marks und der kortikalen Tubuli vor, um die Unterschiede im Proteom in jedem Kompartiment bei Diabetes aufzuklären und zu veranschaulichen.
Studien mit OVE26- und FVB-Mäusen wurden durch die Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Louisville genehmigt. Transgenes weibliches OVE26 (Diabetiker; Stamm #:005564) und FVB (nicht-diabetisch; Hintergrundstamm; Stamm #:001800) Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) gekauft. Die Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gehalten und erhielten freien Zugang zu Wasser und Futter. Alle Studien wurden an 2 Monate alten Mäusen durchgeführt.
1. Tiermodell
2. Protokoll für den Aufschluss der Mini-Spin-Säule mit Suspensionsfalle
3. Reinigung mit Hydrophil-Lipophilic Balance (HLB) Säule
4. Massenspektrometrische Analyse
5. Datenanalyse und Bioinformatik
Insgesamt betrug die Gesamtproteinidentifikation von jedem Probentyp 1) ganze Niere (1438), 2) Medulla (2145) und kortikale Tubuli (1859). Nach der Datenverarbeitung in MetaboAnalyst 6.0, der Datenfilterung und der Imputation wurden schließlich folgende analysierte Proteinidentifikationen für jedes Nierenkompartiment durchgeführt: ganze Niere (455), Medulla (997) und kortikale Tubuli (896). Abbildung 4 zeigt globale proteomische Veränderungen in der OVE2...
Die in diesem technischen Ansatz vorgestellten Methoden sollen die vergleichende Proteomanalyse verschiedener Bereiche der Niere veranschaulichen. Hier verwendeten wir Methoden zur Isolierung von Medulla und kortikalen Tubuli in diabetischen (OVE26) und Kontrollmäusen (FVB) und führten 1-dimensionale LC-MS/MS- und bioinformatische Analysen durch, um grundlegende Unterschiede im Proteom in jedem Teil der Niere zusätzlich zum Proteom der ganzen Niere zu veranschaulichen.
Die Autoren machen keine Angaben.
Die Arbeit an diesem Projekt wurde teilweise mit Mitteln für MTB (NIH K01DK080951) und TDC (NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04) sowie dem University of Louisville Kidney Disease Program und dem Proteomics Technology Center (TDC, MTB) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase type 1A | Millipore Signal | C9891 | |
Exploris 480 Orbitrap | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539 | MS |
Falcon Cell Strainer, 100 µm | VWR | 21008-950 | |
Falcon Cell Strainer, 70 µm | VWR | 21008-952 | |
Gibco PBS pH 7.4 | Thermo | 1001023 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | VWR | PI78440 | |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | |
MetaboAnalyst 6.0 | MetaboAnalyst 6.0 | https://www.metaboanalyst.ca/ | metabolomics data analysis platform |
NanoDrop 2000 | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000 | |
Oasis HLB column | Waters | 186002034 | |
PEAKS 12.0 | Bioinformatics Solutions Inc | LC-MS/MS data analysis software | |
Pestle for 1.5 mL Microtube | Fisher Scientific | NC0782485 | |
Suspension Trap (S-trap) | Protifi | C02-micro-10 | |
TCEP | ThermoFisher Scientific | 20490 | |
TEABC | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trypsin Protease, MS-Grade | ThermoFisher Scientific | 90057 | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | Model 0884900 |
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