Vergleichende proteomische Analyse der gesamten Niere, des Marks und der kortikalen Tubuli in der diabetischen Pathogenese des Nierenversagens bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die proteomische Analyse der gesamten Niere, des isolierten kortikalen Tubulus und der medullären Proteome vor. Die Studie vergleicht auch regionale Proteome in einem diabetischen Mausmodell mit nicht-diabetischen Mäusen.

Zusammenfassung

Die Definition der Abfolge von Ereignissen bei Nierenerkrankungen ist der Eckpfeiler der klinischen Praxis im Werkzeugkasten der Nephrologen. Gewebeproteomische Analysen sind ein wichtiger Ansatz zum Verständnis der grundlegenden physiologischen und molekularen Prozesse der renalen Pathophysiologie. Die Methoden und Protokolle, die wir hier vorstellen, ermöglichen die molekulare Dissektion der Niere in jeder spezifischen Region von Interesse im Zusammenhang mit Krankheitsfolgen. Um die Auswirkungen der Krankheit auf bestimmte Nierenregionen und -strukturen mit einzigartigen Funktionen zu bestimmen, besteht das Ziel dieses Protokolls darin, eine vereinfachte Nierenkompartimentalisierung bei Mäusen und Isolationstechniken für Nierenrindentubuli in Verbindung mit optimierten markierungsfreien quantitativen proteomischen Arbeitsabläufen zu demonstrieren. Die Kombination dieser Methoden wird dazu beitragen, gestörte molekulare Muster in der gesamten Niere, in den medullären Kompartimenten und in den kortikalen Tubulusstrukturen der Niere zu identifizieren, mit dem ultimativen und letztendlichen Ziel der Einzelzellproteomik in pathologischen Kontexten. Die Anwendung dieser Methoden in praktisch jedem Krankheitsmodell wird hilfreich sein, um die Mechanismen der Pathologie im Zusammenhang mit Nierenfunktionsstörungen zu beschreiben.

Einleitung

Chronische Nierenerkrankungen (CKD) sind ein großes Problem in der modernen Medizin und belaufen sich allein in den Vereinigten Staaten auf über 86 Milliarden US-Dollar an Gesundheitsausgaben¹. Weltweit steigt die Inzidenz von CKD mit der Prävalenz von Diabetes und den damit verbundenen renalen Komorbiditäten. Fast 14 % der US-Bevölkerung leiden an CNE (USRDS 2024 annual report). Darüber hinaus ist die diabetische Nephropathie eine Form der CNE und die Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD), und 60 % der Patienten mit Niereninsuffizienz leiden an Diabetes ^1,2,3. Diabetes betrifft alle Nierenstrukturen und Zelltypen der Nephrone, der Funktionseinheit der Niere. Wie in Abbildung 1 gezeigt, sind verschiedene Anteile von Nephronen in der Nierenrinde und in der Medullaregion enthalten. Der Großteil der Niere besteht aus Tubuli. Eine Dysfunktion der Nierentubuli und strukturelle Läsionen tragen signifikant zur Entwicklung der diabetischen Nephropathie (DN) bei, und diese Veränderungen korrelieren gut mit der Rate des Rückgangs der Nierenfunktion 4,5,6,7,8. Zu Beginn des Diabetesstadiums werden die Tubuli als Reaktion auf die erhöhte Glukose- und die damit verbundene Natriumaufnahme und den Bedarf an Membrantransportproteinen in allen Tubulussegmenten hypertrophiert. Mit zunehmender mikrovaskulärer Schädigung im späteren Verlauf des Diabetes zeigen die Tubuli eine Atrophie und Dilatation, während es zu Fibrose und Ausdehnung des Interstitiums^{kommt 9}. Frühere Studien aus unserem Labor haben veränderte Proteome und eine Fülle von Stressreaktionsproteinen in den kortikalen Tubuli von diabetischen Mäusen gefunden ^10,11. Das Mark ist wichtig für die Regulierung der Urinkonzentration, und Funktionsstörungen bei Nierenerkrankungen sind mit oxidativem Stress verbunden, wobei Diabetes zu einer verminderten Sauerstoffspannung in dieser Region der Niere führt, da der Sauerstoffverbrauch durch Stoffwechselaktivitäten, die Aktivität der Membrantransportproteine erhöht ist und mikrovaskuläre Verletzungen auftreten 12,13,14.

Das Verständnis der detaillierten Mechanismen der Entwicklung und des Fortschreitens von DN ist eine fortlaufende Anstrengung, die neuartige und integrierte Ansätze erfordert, die die Modellierung von Krankheiten und die molekulare Profilierung von Signalprozessen, adaptive Veränderungen in der zellulären Proteindynamik und die genaue Definition von Nierenzell- und Gewebekomponenten umfassen, die von Verletzungen bei chronischen Erkrankungen betroffen sind. Proteomik, Metabolomik und Transkriptomik bieten die Möglichkeit, die molekularen Mechanismen von Nierenerkrankungen analytisch zu untersuchen. Omics ist ein relativ neues Gebiet, das systembiologische Ansätze nutzt, um ein globaleres Verständnis biologischer Systeme zu erlangen. Die Proteomik war in den letzten Jahrzehnten ein leistungsfähiges Omics-Werkzeug in der Nephrologie. Die Biomarkerforschung hat sich in den letzten 20 Jahren ausgeweitet, wie die Zunahme der Publikationen zeigt, obwohl umfangreiche Arbeit erforderlich ist, um diese Erkenntnisse vollständig in die Klinik zu implementieren¹⁵. Aufgrund der sehr unterschiedlichen Tubuluszellpopulationen und der jeweiligen funktionellen Rollen innerhalb der Nierenrinde und des Marks kann die proteomische Analyse ganzer Nieren einzigartige Veränderungen maskieren, die mit spezifischen Strukturen in diesen verschiedenen Regionen verbunden sind. Daher besteht das Ziel dieser Studie darin, die Trennung von Nierenrinde und Medulla sowie die Trennung von kortikalen Tubuli von Glomeruli zu demonstrieren, gefolgt von detaillierten Protokollen zur Herstellung von Proteinextrakten aus isolierten Strukturen für modernste Massenspektrometrie und bioinformatische Analysen. Mausmodelle der diabetischen Nephropathie sind maßgeblich an der Definition von Mechanismen des Krankheitsverlaufs beteiligt. Für diese Studie verwendeten wir die transgene OVE26-Maus, die einen früh einsetzenden Typ-I-Diabetes entwickelt und Merkmale einer frühen und späten DN beim Menschen aufweist, darunter 1) einen frühen Anstieg und späteren Rückgang der glomerulären Filtrationsrate, 2) renale Hypertrophie, 3) Verdickung der glomerulären Basalmembran und mesangiale Expansion, 4) schwere Proteinurie und 5) tubulointerstitielle Fibrose^{9, 16,17}. Zwei Monate alte Mäuse wurden ausgewählt, um proteomische Veränderungen in den Tubuluskompartimenten vor offensichtlichen strukturellen Läsionen zu demonstrieren. Wie bereits berichtet und in Abbildung 2 gezeigt, zeigen 2 Monate alte OVE26-Mäuse bei jungen diabetischen Mäusen eine Expansion der glomerulären mesangialen Matrix (Abbildung 2, grüner Pfeil) und eine schwere Proteinurie¹⁷, ohne offensichtliche histologische Veränderungen der proximalen Tubuli (Abbildung 2, gelber Pfeil). Hier stellen wir einen kombinierten quantitativen Proteomik-Ansatz zur Charakterisierung der gesamten Niere, des Marks und der kortikalen Tubuli vor, um die Unterschiede im Proteom in jedem Kompartiment bei Diabetes aufzuklären und zu veranschaulichen.

Protokoll

Studien mit OVE26- und FVB-Mäusen wurden durch die Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Louisville genehmigt. Transgenes weibliches OVE26 (Diabetiker; Stamm #:005564) und FVB (nicht-diabetisch; Hintergrundstamm; Stamm #:001800) Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) gekauft. Die Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gehalten und erhielten freien Zugang zu Wasser und Futter. Alle Studien wurden an 2 Monate alten Mäusen durchgeführt.

1. Tiermodell

1. Isolierung der Niere
   1. Betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung von 80 mg/kg Ketamin und 12 mg/kg Xylazin.
   2. Machen Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere einen Bauchschnitt in der Mittellinie und bewegen Sie den Darm vorsichtig aus der Maus heraus und zur Seite, indem Sie Tupfer verwenden, um die Hohlvene freizulegen.
   3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Hohlvene oberhalb der rechten Niere.
   4. Perfundieren Sie die Maus durch den linken Ventrikel mit 20 mL kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS: pH 7,4; 210 mg/L KH₂PO₄, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na₂HPO_4·7H₂O) mit einer Schlauchpumpe mit einer Geschwindigkeit von 10 mL/min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn der Einschluss von Blutproteinen und -zellen in die Nieren bei nachgelagerten Analysen kein kritischer Faktor ist.
   5. Entferne die Nieren mit einer kleinen chirurgischen Schere. Entfernen Sie überschüssiges Fett von der Außenseite der Nieren. Wiegen Sie die Nieren und legen Sie sie in kaltes PBS auf Eis.
   6. Entfernen Sie die Nierenkapsel.
   7. Legen Sie die Nieren auf eine Glasplatte oder Petrischale auf Eis. Machen Sie mit einer Rasierklinge mehrere Querschnitte durch die Nieren (Abbildung 3), um 3-4 Schnitte zwischen dem oberen und unteren Pol der Nieren zu erhalten.
   8. Reservieren Sie 1-2 mittlere Scheiben und die beiden Pole (eingekreiste Nierenscheiben in Abbildung 3) von jeder Niere beiseite, um sie als "ganze Niere" zu verwenden. Geben Sie eine Portion in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie eiskalten Homogenisierungspuffer (10 % Glycerin, 50 mM HEPES, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,1 % NP40, 10 mM NaF, 0,25 mM NaVO₃, 1x HALTS-Proteasehemmer) in einer Gewebeprobe von ca. 10 μL/mg hinzu (basierend auf der geschätzten Masse der Nierenscheiben, abgeleitet aus dem erworbenen Nierengewicht). Lassen Sie die Tube auf Eis.
   9. Legen Sie die Scheibe für den Rest der mittleren Querscheiben flach hin und schneiden Sie die Rinde (äußere 1 mm) vorsichtig mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell von jeder Scheibe ab (Abbildung 3, schematischer Ablauf). Halten Sie den Kortex von den Medullaregionen getrennt, um das Protokoll zur Isolierung des kortikalen Tubulus zu erhalten (unten, Schritt 1.3).
   10. Geben Sie einen Teil des präparierten Marks in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie eiskalten Homogenisierungspuffer wie in Schritt 1.1.8 hinzu und lassen Sie das Röhrchen auf Eis.
   11. Alle restlichen ganzen Nieren- und Markstücke, die nicht zur Homogenisierung verwendet werden, werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
2. Alternativ können Sie alle getrennten ganzen Nieren- und Medullakompartimente einfrieren und wie in Schritt 1.1.11 beschrieben aufbewahren. Sie werden zu einem späteren Zeitpunkt aus dem Lager genommen, um Homogenisierungspuffer hinzuzufügen, wie in Schritt 1.1.8 beschrieben.
3. Isolierung des kortikalen Tubulus
   1. Den präparierten Kortex auf einer Glasplatte oder Petrischale mit einer Rasierklinge in 1-3 mm große Stücke hacken, so dass eine Paste entsteht.
   2. Verdauen Sie den zerkleinerten Kortex in 1 ml Kollagenase Typ IA (1 mg/ml) für 30 Minuten bei 37 °C in einem schaukelnden Wasserbad.
   3. Legen Sie ein 100-μm-Zellsieb auf ein konisches 50-ml-Röhrchen auf Eis.
   4. Geben Sie die verdaute kortikale Suspension auf das 100-μm-Zellsieb und drücken Sie es vorsichtig mit dem Kolben einer 10-ml-Spritze durch das Sieb. Waschen Sie die Oberseite des Siebs mit 1 mL PBS und die Unterseite des Siebs mit 1 mL PBS.
   5. Geben Sie das Filtrat in das 50-ml-Röhrchen durch ein zusätzliches 100-μm-Sieb und waschen Sie dann die Oberseite des Siebs mit 1 mL PBS.
   6. Das Filtrat wird durch ein 70-μm-Zellsieb geleitet, das über einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis platziert ist. Durch dieses Sieb gelangen Tubuli in das Filtrat (Glomeruli bleiben auf dem 70 μm Sieb erhalten). Waschen Sie das Sieb mit 1 ml PBS.
   7. Das Endfiltrat bei 120 × g 2 min bei 4 °C schleudern. Entsorgen Sie überschüssiges PBS aus dem Tubuluspellet.
   8. Überprüfen Sie die Reinheit des kortikalen Tubuluspellets durch Visualisierung unter einem Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv. Wenn mehr als 10 % der Fraktion Glomeruli enthalten, wird das Filtrat erneut mit 1 ml PBS suspendiert und durch ein sauberes 70-μm-Zellsieb geleitet, ohne dass das Sieb zusätzlich gewaschen werden muss.
   9. Die angereicherte Tubulusfraktion in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen verteilen und bei 2000 × g für 2 min bei 4 °C schleudern. Entsorgen Sie den Überstand.
   10. Geben Sie Homogenisierungspuffer zu dem Tubuluspellet wie bei der gesamten Niere und Medulla (Schritte 1.1.8 und 1.1.10).
4. Homogenisierung des Gewebes/Proteinextraktion
   1. Homogenisieren Sie jeden Probentyp in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Kunststoffstößel, der speziell für 1,5-ml-Röhrchen geeignet ist. Wenn die homogenisierte Suspension zu dickflüssig ist, wird bei Bedarf zusätzlicher Homogenisierungspuffer hinzugefügt.
   2. Lassen Sie die homogenisierte Suspension 15 Minuten lang auf Eis, gefolgt von einer 5-minütigen Beschallung in einem Bad-Ultraschallgerät (nur Ein-/Ausschalter, keine einstellbaren Einstellungen am Gerät), wobei sich Wasser im Bad bei 25 °C befindet. Lassen Sie die Proben 10 Minuten auf Eis.
   3. Kurz vortexen (1000-1500 U/min), homogenisieren, dann 20 Mal mit einer Pipette zerreiben und weitere 15 Minuten auf Eis ruhen lassen.
   4. Die Proben werden vor der Zentrifugation bei 13.000 × g für 20 min bei 4 °C mehrmals zertieriert.
   5. Übertragen Sie freigegebene Proteinextrakte in saubere Röhrchen.
   6. Aliquot 30 μl geklärter Extrakt für die Proteinschätzung und Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse. Die restlichen Proben werden bei -80 °C gelagert.

2. Protokoll für den Aufschluss der Mini-Spin-Säule mit Suspensionsfalle

1. Proteolytischer Verdau von Proteinen in tryptische Fragmente für proteomische Analysen
2. Verdünnen Sie ~40-50 μg der Probe (bei ~2 μg/μl) in Probenlysepuffer (10 % w/v Natriumdodecylsulfat [SDS] in 100 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM Tris (2-Carboxyethyl)phosphin [TCEP]) auf ein Endvolumen von 46 μl.
3. Reduktion und Alkylierung von Proteinen
   1. 30 min bei 65 °C inkubieren (die Endkonzentration von TCEP beträgt 20 mM).
   2. Geben Sie 4 μl 0,5 M Iodacetamid in Wasser in Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln für 30 Minuten (die Endkonzentration von Iodacetamid beträgt 40 mM).
4. 5 μl 12 % Gew.-% Phosphorsäure in Wasser der LC-MS-Qualität geben (141 μl 85 % Phosphorsäure in 859 μl Wasser für 12 % ige Lösung verdünnen).
   1. Alternativ zu Phosphorsäure ist Trifluoressigsäure oder Ameisensäure zu verwenden, wenn eine Phosphopeptidanreicherung^{durchgeführt wird 18}.
5. 350 μl Suspensionsfallen-Bindungspuffer (100 mM TEA-BC in 90 % v/v Methanol/10 % v/v Wasser, pH 7,55) zugeben.
6. Die Probe in die Suspensionsfallsäule geben. Zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 30 s bei RT in einem Rotor mit festem Winkel, um jedes Volumen durch die Säule zu leiten.
7. Mit 4x 400 μl Suspensionsfall-Bindungspuffer waschen. Zentrifugieren Sie bei 4.000 x g für 30 s bei RT in einem Festwinkelrotor, um jede Wäsche durch die Säule zu leiten.
   HINWEIS: Um die Entfernung von SDS zu erleichtern, drehen Sie die Säule im Rotor nach jedem Waschen um 180°.
8. Zentrifugieren Sie bei 4.000 g für 1 min bei RT, um den Bindungspuffer vollständig zu entfernen (verhindert ein Nachtropfen während des Aufschlusses).
9. Übertragen Sie die Suspensionsfallsäule in ein sauberes Auffangröhrchen.
10. Geben Sie 2,5-5 μg Trypsin in 125 μl 50 mM TEA-BC pH 8,5 in Wasser in LC-MS-Qualität (Trypsin-Protease, MS-Qualität). Das endgültige Verhältnis von Trypsin zur Probe beträgt 1:20 bis 1:10.
11. 2 h bei 47 °C inkubieren (Kappe nicht festziehen; bevorzugt wird ein Thermomischer mit 0 U/min). Das Einstechen eines Lochs in die Kappe mit einer Nadel kann verhindern, dass sich Druck in der oberen Kammer der Suspensionsfalle aufbaut (erhöhter Druck führt dazu, dass Trypsinlösung durch die Säule tropft).
12. Geben Sie 80 μl 50 mM TEA-BC pH 8,5 in Wasser der LC-MS-Qualität. Zentrifugieren Sie bei 4.000 g bei RT für 1 Minute in einem Rotor mit festem Winkel, um jeden Aufschluss durch die Säule zu leiten.
13. Geben Sie 80 μl 0,2 % v/v Ameisensäure in Wasser der LC-MS-Qualität. Bei 4.000 g für 1 min bei RT in einem Festwinkelrotor zentrifugieren, um mit dem Aufschluss aus Schritt 2.11 zu sammeln.
14. Geben Sie 80 μl 50 % v/v Acetonitril in Wasser der LC-MS-Qualität. Bei 4.000 g bei RT für 1 min in einem Festwinkelrotor zentrifugieren, um den Aufschluss mit dem Aufschluss aus Schritt 2.11 zu sammeln.
15. Lagern Sie das Eluat der Suspensionsfalle bei -80 °C.
16. Trocknen Sie die Probe in einem Vakuumkonzentrator.
17. Lagern Sie die getrocknete Probe bei -80 °C.

3. Reinigung mit Hydrophil-Lipophilic Balance (HLB) Säule

1. Die Lösungen A (2 % v/v Acetonitril/0,1 % v/v Ameisensäure) und B (80 % v/v Acetonitril/0,1 % v/v Ameisensäure) herstellen.
2. Die Probe wird in 500 μl Lösung A gelöst.
3. Stellen Sie die Säule in einen Vakuumverteiler und legen Sie einen Gasdruck von ~1-2 mL/min an.
4. Geben Sie 500 μl Lösung B in die HLB-Säule und evakuieren Sie sie mit 1-2 mL/min; Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
5. Geben Sie 750 μl Lösung A in die HLB-Säule und evakuieren Sie mit 1-2 mL/min; Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
6. Legen Sie ein sauberes 2-ml-Mikroröhrchen in das Gestell unter der HLB-Säule, laden Sie die Probe in 500 μl Lösung A und gasen Sie den Gasdruck wie oben; Übergeben Sie den Durchfluss ein zweites Mal in die Spalte.
7. Stellen Sie die HLB-Säule über das Abfallrohr, fügen Sie 500 μl Lösung A hinzu und evakuieren Sie wie oben; Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
8. Platzieren Sie die Säule über einem sauberen 2-ml-Mikroröhrchen, fügen Sie 500 μl Lösung B hinzu und evakuieren Sie wie oben; Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
9. Das Eluat wird bei -80 °C eingefroren und anschließend in einem Vakuumkonzentrator getrocknet. Lagern Sie den getrockneten Rückstand bei -80 °C.
10. Lösen Sie den Rückstand vor der MS-Analyse in 20 μl 2 % v/v Acetonitril/0,1 % v/v Ameisensäure. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Peptidkonzentration bei einer Extinktion von 205 nm abzuschätzen.

4. Massenspektrometrische Analyse

1. Eindimensionale Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS
   1. Injizieren Sie eine gleiche Masse an Peptiden (~600 ng) auf 1-dimensionales Nano-LC und fraktionieren Sie es auf C18-Säulen mit umgekehrter Phase.
   2. Eluieren Sie die Peptide direkt in das MS bei einer Sprühspannung von 1,8 kV, wobei eine Ionentransferröhre bei 250 °C gehalten wird.
   3. Erfassen Sie die Spektren im datenabhängigen Top-20-Ionenmodus, bei dem das intensivste MS/MS-Fragment aus der Analysewarteschlange entfernt wird, um die Tiefe der Ionenkartierung auf Ionen mit geringerer Häufigkeit zu verbessern.

5. Datenanalyse und Bioinformatik

1. Verfahren zur Datenverarbeitung
   1. Nach der spektralen Zuordnung und der Peptid- und Proteinidentifizierung in PEAKS 12.0 (LC-MS/MS-Datenanalysesoftware) reichen Sie die Listen der Proteine zur Analyse in MetaboAnalyst 6.0 (Metabolomik-Datenanalyseplattform) unter Verwendung des statistischen Einzelfaktor-Analyseansatzes (https://www.metaboanalyst.ca/) ein.
   2. Verwenden Sie die LC-MS/MS-Datenanalysesoftware, um Spektren anhand strenger FDR-Kriterien (False Discovery Rate) (1 % Protein und Peptid) anhand der Mouse Reviewed FASTA-Datenbank zu durchsuchen und zu filtern.
      HINWEIS: Zu den alternativen Suchprogrammen, die leicht verfügbar sind, gehören Maxquant, Proteome Discoverer und andere weit verbreitete Optionen.
   3. Spezifizieren Sie die Carbamidomethylierung von Cystein als feste Modifikation. Geben Sie die Oxidation von Methionin als variable Modifikation an.
   4. Konvertieren Sie die Listen in das CSV-Format (Comma Separated Values) und Gruppen-/Beispielbeschriftungen, die jeder Spalte und Zeile zugewiesen sind. Dieses Format ist in der Metabolomics-Datenanalyseplattform flexibel.
   5. Imputieren Sie die fehlenden Werte mit der 1/5-Mindestwertregel für fehlende Variablen.
   6. Filtern Sie die Daten, um stark variable Werte auszuschließen, indem Sie den Interquartilsbereich verwenden, wobei eine Varianz von 40 % für den Grenzwert verwendet wird.
   7. Normalisieren Sie die Werte für die Skalierung auf die mittlere Intensität, log₁₀ transformiert und den Mittelwert zentriert. Verwenden Sie andere Normalisierungsansätze, wobei zu beachten ist, dass die Ergebnisse variieren können.
   8. Führen Sie t-Tests ungepaart mit einem p-Wert-Grenzwert < 0,05 durch. Führen Sie in dieser Phase mehrere Testkorrekturen durch.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde diese Korrektur für den repräsentativen Datensatz zu Zwecken der Datenpräsentation nicht durchgeführt.
   9. Geben Sie Vulkandiagramme für die 1,5-fache Änderung (FC) und p < 0,05 an.
   10. Generieren Sie Heatmaps und führen Sie eine partielle Analyse der kleinsten Quadrate (PLSDA) und eine statistische Analyse (Variable of importance of projection [VIP]) der Stichprobengruppen durch.
   11. Potenzielle Kandidaten für eine Nachbeobachtung sind entweder robust genug, um 1,5FC und p-val < 0,05 oder VIP > 1,0 zu übertreffen, wie die PLSDA-Analyse zeigt.
   12. Erstellen Sie Venn-Diagramme, um Unterschiede im Proteom der gesamten Niere, des Tubulus und der Medulla bei OVE26-Mäusen zu veranschaulichen.

Ergebnisse

Insgesamt betrug die Gesamtproteinidentifikation von jedem Probentyp 1) ganze Niere (1438), 2) Medulla (2145) und kortikale Tubuli (1859). Nach der Datenverarbeitung in MetaboAnalyst 6.0, der Datenfilterung und der Imputation wurden schließlich folgende analysierte Proteinidentifikationen für jedes Nierenkompartiment durchgeführt: ganze Niere (455), Medulla (997) und kortikale Tubuli (896). Abbildung 4 zeigt globale proteomische Veränderungen in der OVE2...

Diskussion

Die in diesem technischen Ansatz vorgestellten Methoden sollen die vergleichende Proteomanalyse verschiedener Bereiche der Niere veranschaulichen. Hier verwendeten wir Methoden zur Isolierung von Medulla und kortikalen Tubuli in diabetischen (OVE26) und Kontrollmäusen (FVB) und führten 1-dimensionale LC-MS/MS- und bioinformatische Analysen durch, um grundlegende Unterschiede im Proteom in jedem Teil der Niere zusätzlich zum Proteom der ganzen Niere zu veranschaulichen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type 1A	Millipore Signal	C9891
Exploris 480 Orbitrap	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539	MS
Falcon Cell Strainer, 100 µm	VWR	21008-950
Falcon Cell Strainer, 70 µm	VWR	21008-952
Gibco PBS pH 7.4	Thermo	1001023
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	VWR	PI78440
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149
MetaboAnalyst 6.0	MetaboAnalyst 6.0	https://www.metaboanalyst.ca/	metabolomics data analysis platform
NanoDrop 2000	Thermofisher	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB column	Waters	186002034
PEAKS 12.0	Bioinformatics Solutions Inc		LC-MS/MS data analysis software
Pestle for 1.5 mL Microtube	Fisher Scientific	NC0782485
Suspension Trap (S-trap)	Protifi	C02-micro-10
TCEP	ThermoFisher Scientific	20490
TEABC	Sigma Aldrich	T7408
Trypsin Protease, MS-Grade	ThermoFisher Scientific	90057
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	Model 0884900