Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Burada, tüm böbrek, izole kortikal tübül ve medüller proteomların proteomik analizi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Çalışma ayrıca diyabetik bir fare modelinde ve diyabetik olmayan farelerde bölgesel proteomları karşılaştırır.
Böbrek hastalığındaki olayların sırasını tanımlamak, nefrolog araç setindeki klinik uygulamanın temel taşıdır. Doku proteomik analizleri, renal patofizyolojinin temel fizyolojik ve moleküler süreçlerini anlamak için önemli bir yaklaşımdır. Burada sunduğumuz yöntemler ve protokoller, hastalık sekelleri ile ilgili her bir spesifik ilgi bölgesinde böbreğin moleküler diseksiyonuna izin verecektir. Hastalığın belirli böbrek bölgeleri ve benzersiz işlevlere sahip yapılar üzerindeki etkilerini belirlemek için bu protokolün amacı, basitleştirilmiş fare böbrek bölümlendirme ve renal kortikal tübül izolasyon tekniklerini, kolaylaştırılmış, etiketsiz kantitatif proteomik iş akışlarıyla birlikte göstermektir. Bu yöntemlerin birleştirilmesi, patolojik bağlamlarda tek hücreli proteomiklerin nihai ve nihai hedefi ile tüm böbrek, medüller bölmeler ve böbreklerin kortikal tübül yapılarındaki bozulmuş moleküler modellerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Bu yöntemlerin hemen hemen her hastalık modelinde uygulanması, böbrek fonksiyon bozukluğu ile ilgili patoloji mekanizmalarının tanımlanmasında yardımcı olacaktır.
Kronik böbrek hastalığı (KBH), modern tıpta önemli bir endişe kaynağıdır ve yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde 86 milyar doların üzerinde sağlık harcaması tutarındadır1. Dünya çapında, KBH insidansı, diyabet ve ilişkili renal komorbiditelerin prevalansı ile artmaktadır. ABD nüfusunun yaklaşık %14'ü KBH'ye sahiptir (USRDS 2024 yıllık raporu). Ayrıca, diyabetik nefropati KBH'nin bir şeklidir ve son dönem böbrek yetmezliğinin (SDBY) önde gelen nedenidir ve SDBY hastalarının %60'ında diyabet vardır 1,2,3. Diyabet, böbreklerin fonksiyonel birimi olan nefronların tüm böbrek yapılarını ve hücre tiplerini etkiler. Şekil 1'de gösterildiği gibi, böbrek korteksi ve medulla bölgelerinde nefronların farklı kısımları bulunur. Böbreğin büyük çoğunluğu tübüllerden oluşur. Renal tübül disfonksiyonu ve yapısal lezyonlar diyabetik nefropati (DN) gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunur ve bu değişiklikler böbrek fonksiyonlarındaki azalma oranıile iyi ilişkilidir 4,5,6,7,8. Diyabetin erken dönemlerinde, tüm tübül segmentlerinde artan glikoz ve buna bağlı sodyum alımı ve membran taşıma proteini taleplerine yanıt olarak, tübüller hipertrofiye uğrar. Diyabetin ilerleyen dönemlerinde artan mikrovasküler yaralanma ile tübüller atrofi ve dilatasyon sergilerken, fibroz ve interstisyumungenişlemesi vardır 9. Laboratuvarımızdan yapılan önceki çalışmalar, diyabetik farelerin kortikal tübüllerinde değişmiş proteomlar ve bol miktarda stres yanıt proteini bulmuştur10,11. Medulla, idrar konsantrasyonunun düzenlenmesi için önemlidir ve böbrek hastalığı sırasındaki işlev bozukluğu oksidatif stres ile ilişkilidir, diyabet, metabolik aktivitelerden kaynaklanan oksijen tüketiminin artması, zar taşıma proteinlerinin aktivitesinin artması ve mikrovasküler yaralanma nedeniyle böbreğin bu bölgesinde oksijen gerginliğinin azalmasına neden olur 12,13,14.
DN'nin ayrıntılı gelişim ve ilerleme mekanizmalarını anlamak, hastalığın modellenmesini ve sinyalleme süreçlerinin moleküler profillenmesini, hücresel protein dinamiklerinde adaptif değişiklikleri ve kronik durumlarda yaralanmadan etkilenen böbrek hücresi ve doku bileşenlerinin kesin tanımını içeren yeni ve entegre yaklaşımlar gerektirecek devam eden bir çabadır. Proteomik, metabolomik ve transkriptomik, böbrek hastalıklarının moleküler mekanizmalarını analitik olarak inceleme imkanı sunar. Omik, biyolojik sistemler hakkında daha küresel bir anlayış kazanmak için sistem biyolojisi yaklaşımlarını kullanan nispeten yeni bir alandır. Proteomik, son yıllarda nefrolojide güçlü bir Omik aracı olmuştur. Biyobelirteç araştırmaları, yayınlardaki büyümede belirtildiği gibi son 20 yıl içinde genişlemiştir, ancak bu bulguları kliniğe tam olarak uygulamak için kapsamlı çalışmalar gereklidir15. Renal korteks ve medulla içindeki çok farklı tübül hücre popülasyonları ve ilgili fonksiyonel rollerle, tüm böbreklerin proteomik analizi, bu farklı bölgelerdeki belirli yapılarla ilişkili benzersiz değişiklikleri maskeleyebilir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, renal korteks ve medullanın ayrılmasının yanı sıra kortikal tübüllerin glomerüllerden ayrılmasını ve ardından son teknoloji kütle spektrometresi ve biyoinformatik analizler için izole edilmiş yapılardan protein ekstraktlarının hazırlanması için ayrıntılı protokolleri göstermektir. Diyabetik nefropatinin fare modelleri, hastalığın ilerleme mekanizmalarını tanımlamada etkilidir. Bu çalışma için, erken başlangıçlı tip I diyabet geliştiren ve insanlarda erken ve geç evre DN özelliklerini gösteren OVE26 transgenik fareyi kullandık, bunlar arasında 1) glomerüler filtrasyon hızında erken bir artış ve daha sonra düşüş, 2) böbrek hipertrofisi, 3) glomerüler bazal membran kalınlaşması ve mezanjiyal genişleme, 4) şiddetli proteinüri ve 5) tubulointerstisyel fibroz9, 16,17. Açık yapısal lezyonlardan önce tübül kompartmanlarında proteomik değişiklikler göstermek için iki aylık fareler seçildi. Daha önce bildirildiği ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, 2 aylık OVE26 fareleri, genç diyabetik farelerde proksimal tübüllerde açık histolojik değişiklikler olmaksızın (Şekil 2, sarı ok) glomerüler mezanjiyal matriks genişlemesi (Şekil 2, yeşil ok) ve şiddetli proteinüri17 sergiler. Burada, diyabetli her bir bölmedeki proteomdaki farklılıkları aydınlatmak ve göstermek için tüm böbrek, medulla ve kortikal tübüllerin karakterizasyonu için birleşik bir kantitatif proteomik yaklaşım sunuyoruz.
OVE26 ve FVB fareleri ile yapılan çalışmalar, Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergeleri tarafından onaylanmıştır. Transgenik dişi OVE26 (diyabetik; Suş #:005564) ve FVB (diyabetik olmayan; arka plan suşu; Suş #:001800) fareler Jackson Laboratories'den (Bar Harbor, ME) satın alındı. Hayvanlar, 25 ° C'de 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu ve su ve yiyeceğe serbest erişim sağlandı. Tüm çalışmalar 2 aylık fareler üzerinde yapılmıştır.
1. Hayvan modeli
2. Süspansiyon-Tuzak mini spin kolon sindirim protokolü
3. Hidrofilik-lipofilik denge (HLB) sütunu ile temizleme
4. Kütle spektrometresi analizi
5. Veri analizi ve biyoinformatik
Genel olarak, her numune tipinden toplam protein tanımlamaları 1) tüm böbrek (1438), 2) medulla (2145) ve kortikal tübüller (1859) idi. MetaboAnalyst 6.0'da veri işleme, veri filtreleme ve atamanın ardından, son olarak her böbrek bölmesi için analiz edilen protein tanımlamaları şunlardı: tüm böbrek (455), medulla (997) ve kortikal tübüller (896). Şekil 4 , OVE26 diyabetik fare böbreğindeki küresel proteomik değişiklikleri göstermek...
Bu teknik yaklaşımda sunulan yöntemler, böbreğin farklı bölgelerinin karşılaştırmalı proteom analizini göstermek için tasarlanmıştır. Burada, diyabetik (OVE26) ve kontrol (FVB) farelerinde medulla ve kortikal tübülleri izole etmek için yöntemler kullandık ve tüm böbreklerin proteomuna ek olarak böbreğin her bir bölümündeki proteomdaki temel farklılıkları göstermek için 1 boyutlu LC-MS/MS ve biyoinformatik analiz gerçekleştirdik.
Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.
Bu proje için çalışmalar, MTB (NIH K01DK080951) ve TDC (NephCure-Pediatrik Nefroloji Araştırma Konsorsiyumu NKI-2023-04) ve Louisville Üniversitesi Böbrek Hastalığı Programı ve Proteomik Teknoloji Merkezi (TDC, MTB) için sağlanan fonlarla kısmen desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase type 1A | Millipore Signal | C9891 | |
Exploris 480 Orbitrap | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539 | MS |
Falcon Cell Strainer, 100 µm | VWR | 21008-950 | |
Falcon Cell Strainer, 70 µm | VWR | 21008-952 | |
Gibco PBS pH 7.4 | Thermo | 1001023 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | VWR | PI78440 | |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | |
MetaboAnalyst 6.0 | MetaboAnalyst 6.0 | https://www.metaboanalyst.ca/ | metabolomics data analysis platform |
NanoDrop 2000 | Thermofisher | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000 | |
Oasis HLB column | Waters | 186002034 | |
PEAKS 12.0 | Bioinformatics Solutions Inc | LC-MS/MS data analysis software | |
Pestle for 1.5 mL Microtube | Fisher Scientific | NC0782485 | |
Suspension Trap (S-trap) | Protifi | C02-micro-10 | |
TCEP | ThermoFisher Scientific | 20490 | |
TEABC | Sigma Aldrich | T7408 | |
Trypsin Protease, MS-Grade | ThermoFisher Scientific | 90057 | |
Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | Model 0884900 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır