Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 1R21AG031965-01A1. MK es una Ellison Medical Foundation de Nueva Académico en el envejecimiento.

Parte 1: Preparación de los cultivos de envejecimiento <ol><li> Cepas racha de interés de las existencias congeladas en placas de agar YEPD (1% extracto de levadura, 2% Bacto-peptona, 2% de agar, 2% de glucosa). </li><li> Se incuban las células a 30 ˚ C durante 48 horas o hasta que las colonias solo aparecen. </li><li> Elige colonias aisladas e inocular en 5 ml de medio líquido YEPD (1% extracto de levadura, 2% Bacto-peptona, 2% de glucosa) en tubos de ensayo. </li><li> Crecer cultivos de una noche a 30 ˚ C, manteniendo agitación constante usando un agitador o un tambor de rodillos. </li><li> Inocular 5 ml de sintético completo (SC) medio (Tabla 1) con 50 l de la cultura durante la noche. En general las tres culturas SC se preparan para cada cepa para proporcionar la replicación triplicado biológica de los análisis de ciclo de vida de cada cepa se está examinando. </li><li> Mantener los cultivos a 30 ˚ C con agitación constante en un tambor durante todo el experimento (por lo general dos o más semanas). </li></ol> Parte 2: Tomar una viabilidad edad de punto Después de dos días de la cultura en SC medios de comunicación, las células deben estar en la fase estacionaria y la primera edad de punto está listo para ser tomado. Con posterioridad la edad puntos se deben tomar cada 2-3 días durante un mínimo de dos semanas. Para cada punto de la edad: <ol><li> Preparar el Bioscreen 100 y placas de nido de abeja para la inoculación, llenando cada pozo con 145 l de YEPD. Asegúrese de dejar al menos un pozo lleno de sólo YEPD y no las células para el análisis de los datos más tarde. </li><li> Eliminar los cultivos de envejecimiento de la incubadora. </li><li> Agitar brevemente la primera cultura que se inocula en la placa de nido de abeja, teniendo cuidado de no derramar de la cultura. </li><li> Tomar 5 l de la cultura mestiza y la pipeta que en el primer pocillo de la placa de panal. Llama la boca de cada tubo de ensayo antes y después de la eliminación de la alícuota de 5 mL. </li><li> Repita este procedimiento para cada cultura del envejecimiento estar seguro de tener en cuenta la posición, así que corresponde a cada cultura. Idénticas posiciones y se debe utilizar para cada edad subsiguiente puntos durante todo el experimento. </li><li> Vuelva a colocar la cultura en la incubadora de 30 ˚ C cuando haya terminado con las inoculaciones. </li></ol> Parte 3: Carga de la máquina Bioscreen C MBR <ol><li> Exponer el compartimiento de la incubadora por levantar la tapa y retire la tapa de la bandeja de muestras. </li><li> Inserte la placa recién inoculado de nido de abeja en la bandeja de la muestra (el uso de la ranura de la izquierda si sólo estás leyendo una placa). </li><li> Vuelva a colocar la tapa de la bandeja de muestras y bajar la tapa del compartimiento de la incubadora. </li><li> Asegúrese de que el fluido de transferencia de calor está por encima del nivel mínimo de llenado. Si está bajo, agregue más con una pipeta 1.000 l con el fluido de transferencia de calor siempre. </li><li> Usando el software Bioscreen &quot;EZExperiment&quot;, establecer los parámetros siguientes para obtener curvas de crecimiento adecuadas para Saccharomyces cerevisiae: <ul><li> Número de muestras: Escriba el número de pozos con los medios de comunicación o 200 </li><li> Filtro: 420-580nm, de banda ancha </li><li> Temperatura: 30 ˚ C </li><li> Duración experimento: un día, 0 horas, 0 segundos </li><li> Intervalo de medición: 30 minutos </li><li> Temblando: On, agitación continua, de alta </li></ul></li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; para comenzar las lecturas. </li></ol> Parte 4: Análisis de Datos Por lo general, de seis años a los puntos se toman en el transcurso de dos semanas. Los puntos de la edad se toman en los días 2, 4, 6, 9, 11 y 13. Dependiendo del diseño experimental y tensiones a que está probado, puede ser conveniente tener la edad puntos más o menos frecuencia o por más de 2 semanas. Es importante que la carga de la placa de nido de abeja en el mismo orden para todas las edades-tal punto que cada cultura se corresponde con el envejecimiento de la misma posición y en todas las edades-punto, ya que esto hará que el análisis de datos mucho más fácil. <ol><li> Obtener los archivos de salida de la máquina Bioscreen C MBR. El software &quot;EZExperiment&quot; la salida de los datos Bioscreen como un archivo delimitado por tabuladores que es compatible con Microsoft Excel, así como otros programas. La primera columna muestra a qué hora de la medición de OD fue tomada durante el experimento, con columnas posteriores en representación de cada bien en el Bioscreen placas alveolares (Figura 1). </li><li> Eliminar la primera lectura de DO de cada columna. Esta lectura es &quot;ruido&quot;. </li><li> Normalizar los datos al restar el valor de la DO del pozo con YEPD solo de todos los valores de DO de cada columna. Esto elimina la absorbancia de fondo por los medios de comunicación. </li><li> Trazar las curvas consecuencia. Las curvas se desplazarán en función de la edad (Figura 2). Por ejemplo, mediante el trazado de las curvas de extensión de la columna 1 (y uno de la placa de nido de abeja) durante los seis puntos de momento, no hay un cambio claro hacia la derecha de las curvas en el tiempo. </li><li> Calcular el tiempo de duplicación (δ) para cada bien sobre la base de la cinética de crecimiento de la edad de 2 días-punto. La ecuación utilizada para calcular el tiempo de duplicación is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Ecuación" /> donde OD 1 y 2 representan OD sucesivas mediciones de OD y t 1 y t 2 es el tiempo entre las mediciones. Calcular tiempos de duplicación sólo entre los valores de DO de 0,2 a 0,5. El promedio de estos valores es el tiempo de duplicación para ese bien. Calcular tiempos de duplicación sólo entre los valores de DO de 0,2 a 0,5. El promedio de estos valores es el tiempo de duplicación para ese bien. La mayoría de las cepas salvajes de levadura debe dar un valor duplicada en un tiempo entre 85 a 90 minutos. </li><li> Para cada edad puntos, calcular el cambio de tiempo (T) en las curvas de extensión en relación con el punto inicial de la edad (día 2). Una manera fácil de hacer esto es determinar la diferencia en la cantidad de tiempo que le tomó a cada pocillo para llegar a un diámetro exterior de 0,3 entre el primer punto de la edad, y en cada edad de punto. El tiempo que un determinado pozo alcanzó una DO de 0,3 se puede calcular a partir de la ecuación de regresión lineal correspondiente a ln (DO) en función del tiempo que transcurre entre la puesta entre paréntesis OD dos puntos de tiempo = 0,3. </li><li> Calcular la fracción superviviente en cada punto de la edad con el fin de generar una curva de supervivencia (Figura 3). Definir el punto inicial de la edad (día 2) al 100% de viabilidad. Para cada edad sucesivos puntos de calcular el porcentaje de supervivencia mediante la ecuación: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="Segunda ecuación" width="245" height="115" /> s, donde n es el porcentaje de supervivencia, Dt n es el cambio de hora, y δ n es el tiempo de duplicación. </li><li> Generar las curvas de supervivencia (Figura 3B) como se desee para cada bien (o pozos de replicar) por el trazado de la fracción (o porcentaje) de células viables en función de la edad. </li><li> Calcular la supervivencia integral (SI) para cada pozo. SI se define como el área bajo la curva de supervivencia y se puede estimar mediante la fórmula: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="La ecuación 3" width="400" height="79" /> donde la edad es la edad n puntos (por ejemplo, 2, 4, 6, 9, 11 y 13) y s n es el valor de supervivencia a esa edad-punto. </li><li> Determinar los parámetros estadísticos de los pozos de replicar los datos de la SI y la supervivencia. Común los parámetros estadísticos de interés, como media, mediana y la varianza para cada conjunto de réplicas biológicas. Un t-test o análisis similar puede ser utilizado para la comparación de pares de SI con fines experimentales y grupos control. También puede ser deseable para generar las curvas de supervivencia, como se describe en 4.8 de promedio réplicas biológicas. </li></ol> Parte 5: Los resultados representativos Al finalizar el experimento, se han trazado la curva de supervivencia y el análisis realizado de datos suficientes para determinar el potencial de envejecimiento cronológico de diferentes cepas o condiciones. Si se realiza correctamente, las curvas de crecimiento obtenidas de la máquina Bioscreen C MBR debe ser similar a los que se muestran en la Figura 2 y las curvas de supervivencia resultante debe ser similar a los que se muestran en la Figura 3. Por lo general, de tipo salvaje células cultivadas en las condiciones descritas aquí, tendrá un período cronológico la vida media del orden de 7 días. Variación sustancial en la supervivencia se observa en las diferentes cepas y bajo ciertas condiciones, tales como el crecimiento en los medios de la glucosa al 0,05%, la mediana de supervivencia puede exceder de 30 días. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Figura 1. Salida de datos desde el programa Bioscreen &quot;EZExperiment&quot;. Una columna muestra la hora en que se tomó una lectura de absorbancia. Sucesivas columnas representan los pozos de la placa de nido de abeja inoculados con células obtenidas de cultivos de envejecimiento. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Figura 2. Curvas consecuencia de una réplica biológica única en el transcurso de un experimento. Hay un cambio notable en las curvas con el tiempo, las células en la cultura del envejecimiento pierden su viabilidad. El tiempo transcurrido entre el momento inicial (día 2) y un punto de tiempo sucesivos que determina la viabilidad a esa edad en particular. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Figura 3. A) una curva de supervivencia generado con los datos fruto de la Figura 1. El día 2 punto de tiempo se establece como el punto de viabilidad del 100%. B) Curvas de supervivencia final de las dos cepas analizadas en el mismo experimento. Estas curvas de supervivencia representan las viabilidades promedio de tres réplicas biológicas de cada cepa. Las barras de error representan la desviación estándar dentro de réplicas biológicas. El área sombreada bajo la curva de supervivencia representa la supervivencia integral (SI) para la cepa 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tabla 1. Medio sintético definidos que se utilizan para estudios de envejecimiento cronológico (cepa backgrouª BY4743) </td></tr><tr><td> Componente </td><td> Concentración (g / L) </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Levadura base de nitrógeno (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> Ácido L-aspártico </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-ácido glutámico </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-histidina </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-lisina </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-Metionina </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L-Treonina </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-triptófano </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Uracilo </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> Nota: Esta receta explica auxotrophies en BY4743 cepa diploide. Auxotrophies aminoácidos deben ser compensados ​​mediante la adición de una concentración final de 5 veces el medio completo sintético.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

El alto rendimiento de la vida cronológica ensayo de duración se describe aquí es un método eficaz para cuantificar el potencial de envejecimiento de un gran número de cepas con alta exactitud y precisión. El principal avance de este método sobre los métodos clásicos para determinar la supervivencia de contar unidades formadoras de colonias (véase, por ejemplo 3) es el uso de un dispositivo de lectura agitador / incubadora / placa como la máquina Bioscreen C MBR para obtener alta resolución de las...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

La levadura en ciernes<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Ha demostrado ser un importante organismo modelo en el campo de la investigación sobre el envejecimiento<sup&gt; 1</sup&gt;. La replicación y abarca cronológicamente la vida son dos paradigmas establecidos utilizados para estudiar el envejecimiento en la levadura. Envejecimiento replicativo se define como el número de células hijas una célula de levadura madre soltera produce antes de la senescencia y el envejecimiento cronológico se define por la longitud de las células de tiempo puede sobrevivir en una que no se dividen, la quietud, como el estado<sup&gt; 2</sup&gt;. Hemos desarrollado un método de alto rendimiento para la medición cuantitativa de la vida cronológica. Este método consiste en el envejecimiento de las células en un medio definido con agitación ya temperatura constante. En cada edad de punto, una sub-población de las células se retira de la cultura del envejecimiento y se inoculó en medio de cultivo rico. Una curva de alta resolución de crecimiento se obtiene entonces para esta subpoblación de células envejecidas con una máquina Bioscreen C MBR. Un algoritmo se aplica para determinar la proporción relativa de células viables en cada sub-población basado en la cinética de crecimiento en cada etapa de punto. Este método requiere mucho menos tiempo y recursos en comparación con otras pruebas de vida cronológica, mientras que el mantenimiento de la reproducibilidad y precisión. La naturaleza de alto rendimiento de este ensayo debe permitir a gran escala de pantallas de genética y química para identificar nuevos modificadores de la longevidad de realizar más pruebas en organismos más complejos.

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Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Envejecimiento cronológico en la levadura se refiere a la pérdida de la viabilidad celular asociado con el tiempo en la fase estacionaria. Aquí se describe un método de alto rendimiento para determinar cuantitativamente la levadura abarcan la vida cronológica.

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K vistas.  University of Washington. Envejecimiento cronológico en la levadura se refiere a la pérdida de la viabilidad celular asociado con el tiempo en la fase estacionaria. Aquí se describe un método de alto rendimiento para determinar cuantitativamente la levadura abarcan la vida cronológica.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Una técnica rápida para la visualización en vivo de las células de levadura inmovilizada

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Investigación

Biología

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificación de las mitocondrias de las células de levadura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.