ويتم دعم KO AC بمنحة وزمالة من جمعية القلب الاميركية. ويتم اعتماد الميزانية العادية SIB من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">انقر هنا لعرض لمحة عامة عن الإجراءات نبضات شبه الآلي (سهى) التحليل.</a> شبه الآلي تحليل نبضات ضوئية 1. Preprocess -- هذه الخطوة توفر معلومات عن القلب الانبساطي وبأقطار الانقباضي. ويتم تحديد حواف القلب وملحوظا خلال انبساط وانقباض الأقصى. يمكن أن تكون التسجيلات البصرية المتطورة بسرعة بطيئة وإطار واحد ، حتى في الوقت الذي تسمح بتحديد دقيق للإطارات حيث تقلص القصوى والاسترخاء للقلب تحدث. مصنوعة زوج واحد من علامات التعرف على حواف الانبساطي وزوج واحد تحديد حواف الانقباضي. ويمكن أيضا أن تكون علامات المحرز في مكررة في مواقع مختلفة على طول الأفقي القلب. وتستخدم أيضا في أقطار القلب في هذه الخطوة التي تم الحصول عليها لحساب القياس الإضافية التي تقدم تقديرا للانقباض القلب. هذا الاجراء هو تقصير في المئة كسور (٪ FS) ، وأنها تمثل مدى حواف القلب التحرك نحو بعضهما البعض خلال الانكماش. الصيغة المستخدمة لحساب FS ٪ هو : (((الانبساطي قطر -- قطر الانقباضي) / قطر الانبساطي) × 100) علما -- وتستخدم النقاط المحددة في هذه المجموعة فقط لقطر والقياسات وكسور تقصير لا تستخدم للكشف عن الحركة. على سبيل المثال : (. Cammarato ، وآخرون 2008) في ذبابة الفاكهة ، والطفرات نقطة في المجال محول الميوسين السلسلة الثقيلة ، وهي المنطقة المعروفة لتعديل النشاط الحركي والأنزيمية ، النتيجة في القلوب التي هي متسعة أو مقيدة اعتمادا على ما إذا كانت تقمع أو تعزيز الميوسين وأتباز النشاط . لا تستطيع هذه الأنواع من القياسات تكون في الذباب على حالها كما هي عادة لا يمكن تحديد حواف القلب على طول الأنبوب القلب عن طريق بشرة والدهون ، (قارن Wildtype ، D45 وMhc5 M - أوضاع في &quot;M - وضع الرقم &quot;أدناه) التي تحيط عادة القلب. وتقتصر عادة القياسات التي أجريت عند تصور القلب في الذباب على حالها مع غيرها من الأساليب المستخدمة عادة في الجزء الأمامي من معظم القلب ، وغرفة المنطقة المخروطية. كما أنه ليس من الممكن الحصول على هذا القياس الحيوي في الأنسجة الثابتة. 2. الكشف عن الحركة تتم هذه الخطوة تلقائيا من قبل البرنامج ويستخدم اثنين من خوارزميات مختلفة لتحليل الحركة في كل فيلم. لفترة وجيزة ، الخوارزمية الأولى ، &quot;الظلام الثانية متوسط&quot; يستخدم خوارزمية الإطار بواسطة نهج الإطار. هذه المعدلات الخوارزمية شدة الظلام لإطار الفيلم بأكمله ، ويسوي القيمة إلى الفاصل الزمني بين 0 و 1 ، والمؤامرات المتوسط ​​لتطبيع كل إطار في الفيلم أكثر من مرة. النهج الثاني ، &quot;بكسل بكسل&quot; الخوارزمية ، ويحلل تغيير في الظلام من كل خلية فردية من إطار واحد إلى التالي. تتلخص بكسل الذي يحمل تغيرات كثافة أعلى من عتبة محددة مسبقا لكل إطار ، وخططت لكل إطار في الفيلم أكثر من مرة. 3. الاختيار فواصل - يتم عرض الإخراج من خوارزميات الكشف عن اثنين في حركة هذه الوحدة مع &quot;متوسط ​​الظلام&quot; الإخراج المعروضة في إطار فوق &quot;بكسل بكسل&quot; إطار الإخراج. من أجل أن تكون على يقين من أن الكشف عن فترات يتفق مع الحركة في الفيلم الفعلية التي نعرضها على حافة تعقب أو M - وضع مصنوعة من إطارات يجري تحليلها مباشرة تحت النوافذ الإخراج الخوارزمية. وأدلى M - الوضع عن طريق خفض رقميا شرائح واسعة من خلال بكسل واحد في القلب من كل إطار في الفيلم ومواءمتها أفقيا لتوفير لقطة من الحركات حافة القلب مع مرور الوقت. في &quot;بكسل بكسل&quot; نافذة يشار إلى الفترات المحددة الانبساطي بواسطة خط أفقي الخضراء مع عدد من الأطر التي تسهم في تلك الفترة أعلاه مباشرة. ويتم تحديد فترات الانقباضي والفاصل الزمني بين اثنين من الإنبساط المتعاقبة. يشار إلى بداية انقباض في وضع - M بواسطة خط عمودي والأزرق هو مبين في نهاية طريق خط أحمر عمودي. مع هذا العرض من السهل نسبيا لمعرفة ما إذا كان الإخراج الخوارزمية تتفق مع حركات القلب الفعلية. يجب أن يتم إجراء الكشف على الرغم من أن الحركة تلقائيا يتم التحقق الإخراج للتأكد من دقتها. هناك عدة أسباب لذلك ، واحد هو أن هناك كثيرا ما الكامنة ، وتقلبات الموجة البطيئة في ضوء المستويات لا علاقة لحركة القلب. يمكن أن يتم القضاء على هذه العادة عن طريق استخدام المدمج في تصفية تمرير عالية. والسبب الثاني أن تفعل مع حساسية &quot;بكسل بكسل&quot; النهج. الإخراج من هذه الخوارزمية هو عادة يتتبع حركة اثنين ، واحد للحركة والتقلص واحد للحركة الاسترخاء. في كبار السن في بعض الذباب والمسوخ طول الفترة الزمنية بين هاتين الحركتين<html> تصبح طويلة نسبيا ، وبرنامج يحاول تفسير الحركتين باعتبارهما يدق منفصلة. يمكن تصحيح هذا عن طريق طرح برنامج للمقارنة بين مخرجات بكسل بكسل مع الخوارزمية التي من الخوارزمية الثانية متوسط ​​الظلام ، من خلال النقر على مربع &quot;استخدم الظلام&quot;. على سبيل المثال (راجع الفيديو) : و5-7 الاسبوع القديمة الذباب فترات الانقباضي وعادة ما تكون أطول بكثير مما كان عليه في الذباب الشباب. في البداية يتم الكشف عن هذه فترات طويلة عن اثنين من تقلصات منفصلة مفصولة انبساط قصيرة. يمكن تصحيح هذا عن طريق اختيار &quot;استخدم الظلام&quot; خانة الاختيار. في هذه الحالة سيقوم البرنامج مقارنة الفاصل الانبساطي التي حددها بكسل خوارزمية بكسل مع الإخراج الثانية متوسط ​​الظلام. إذا كان الظلام الثانية متوسط ​​الانتاج لديها قيمة موجبة ، ثم سيتم تجاهل أي الفاصلة الانبساطي المحددة في خوارزمية بكسل بكسل وسيتم تحديد الفواصل الزمنية بشكل صحيح. يمكن مسحها الفيلم بأكمله في 10 قطاعات الثانية وقبلت (انقر على زر &quot;موافق بيانات&quot;) أو رفض (انقر على زر &quot;تجاهل البيانات&quot;). يمكن أن يكون مرحبا والحساسيات تمرير مرشح لو ضبطها يدويا للمساعدة في تحديد أدق فترات الانكماش عند استخدام الخوارزمية الظلام. 4. الإخراج الاحصاء مرة واحدة وقد تم قبول الإخراج لفيلم معين سيقوم البرنامج استخدام هذه المعلومات لحساب تلقائيا عددا من المعلمات. وتشمل هذه الفترة الانبساطي والانقباضي ، وفترة القلب ومعدل ضربات القلب والتوجيه وسرعة من FS موجة الانكماش ، بأقطار القلب ، و٪. بالإضافة إلى ذلك ، أن البرنامج قد أساليب متعددة لقياس arrhythmicity يعكس انكماش غير موحدة ودورات الاسترخاء (انظر فينك وآخرون ، 2009). يتم توفير الإخراج الإحصائية عن كل فيلم على حدة وعلى مجموعة البيانات بالكامل في شكل قيمة مفصولة بفواصل (CSV) ملف التي يمكن فتحها في برامج جداول البيانات مثل Microsoft Excel. الجدول 1 -- <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1" /> مثال الإخراج التي تم إنشاؤها بواسطة شبه الآلي برنامج التحليل البصري القلب. 5. تحديث المدرج الإحصائي. هذا الجزء من البرنامج بعرض جميع البيانات الموجودة على فترات القلب لمجموعة البيانات في شكل رسم بياني. منذ معدل ضربات القلب ومتغير ونحن تطبيع بيانات الإخراج الرسم البياني. ومع ذلك ، لأن توزيع فترات ليست متماثلة حول يعني أننا نستخدم قيمة الفاصل الزمني وسيطة لتطبيع لدينا. على سبيل المثال (راجع فيديو) : الذباب التي متحولة للقناة البوتاسيوم KCNQ تظهر عدم انتظام فترات غاية الانبساط والانقباض. عادة فترات أطول بكثير الانقباضي ومزيد من عدم انتظام مما كانت عليه في سن المطابقة wildtype الذباب. ويمكن رؤية ذلك بوضوح من خلال عرض البيانات في شكل رسم بياني (انظر أيضا Ocorr آخرون 2007). 6. M - اسطة هذه الوحدة يولد M - أوضاع التي يمكن أن تكون مصنوعة من أي موقف على طول القلب في إطار الفيلم. ويمكن أيضا طول النمط - M تحددها. M - صيغ مفيدة لإظهار نوعيا ما يقوم به القلب في الفيلم. على سبيل المثال (راجع فيديو) : الفيلم من قلب الزرد القديمة لمدة 3 أيام اليرقات تظهر البطين الأمامية التي يتم استخدامها لإنشاء M - وضع. يشار إلى شريحة الرأسي للخلية التي سيتم رفعه الكترونيا من كل إطار الفيلم بواسطة خط أحمر. M - وضع الشكل : أمثلة من طراز M - سائط من ذبابة الفاكهة والزرد. واحدة من الطفرات التي تمت مناقشتها في الميوسين نتائج الخطوة Preprocess في المحركات الجزيئية مع حركية أسرع الانزيم مما يؤدي إلى تقييد القلب وأحيانا كتلة التوصيل. يمكن أن تظهر كل من المعلمات باستخدام نوعي M - وسائط. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M - أمثلة وسائط" /> M - سائط المحرز في نفس الجزء من القلب في كل من wildtype والذباب متحولة تظهر بوضوح النمط الظاهري مقيد في متحولة 5 MHC وبأقطار المتوسعة ودورات الانكماش عدم اتساق نبضات القلب من متحولة D45 (الذي يعبر عن حركية إنزيم الميوسين مع الاكتئاب) (تعديل من Cammarato وآخرون 2008 ، AL). M - وضع مصنوعة من قلب يرقات اسماك الزرد تبين البطين الأمامي (نفس الفيلم القلب كما هو موضح في التظاهرة ، فينك et.al. 2009). 7. النقطة الحمراء السينما وتنتج هذه الوحدة تلقائيا تباطأ (1:4) ، 20 الإصدار الثاني من فيلم يظهر تحليل كل بكسل التي يتم تحديدها والمتغيرة في الحمراء. يتم استخدام هذه الميزة في المقام الأول لأغراض التوضيح. الفيلم 1 -- A &quot;فيلم نقطة حمراء&quot; تظهر بكسل التي يتم تحديدها بأنها تغييرات شدة الظلام خوارزميات البرنامج في الحمراء. وتباطأت سرعة الفيلم الأصلي من قبل عامل من 4. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi &quot;&gt; اضغط هنا لتحميل الفيلم 1. 8. تطبيقات إضافية بدأنا في تطبيق هذا النظام التحليلي لأفلام عالية السرعة من نماذج أخرى بقلوب الصغيرة التي غالبا ما يصعب تحليلها باستخدام المنهجية التقليدية. لقد طبقنا بنجاح هذا التحليل لقلوب كل من اليرقات الزرد والفأر الجنينية قلوب (فينك وآخرون ، 2009). الفيلم 2 -- ماوس القلب بالإضافة إلى الفيلم شخصية مع فواصل تحقق مع إخراج البيانات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">انقر هنا لتحميل الفيلم 2.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="الاختيار فواصل القلب ماوس" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

لقد أثبت نموذج ذبابة الفاكهة إلى أن تكون أداة قوية الجينية التي تم استخدامها لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة العلمية التي تتراوح بين التنمية الجنينى على التعلم والذاكرة. وقد تم مؤخرا استخدام هذا النموذج الحي تنوعا للتحقيق في علم الوراثة وظيفة القلب. وقد اعتمد عدد م...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

طورنا طريقة لتحليل تسجيلات عالية السرعة الضوئية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; ، الزرد والفأر الجنينية قلوب (فينك ، وآخرون ، 2009). لدينا شبه أوتوماتيكي نبضات التحليل البصري (سهى) يستخدم للكشف عن حركة الرواية الخوارزمية التي هي قادرة على الكشف عن حركات القلب المرتبطة مقلص الأحداث الفردية والاسترخاء. ويوفر البرنامج مجموعة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة بما فيها قراءات ضغط الدم الانقباضي والانبساطي فترات ، معدل ضربات القلب ، فضلا عن اتخاذ تدابير النوعي والكمي لarrhythmicity ضربات القلب. البرنامج أيضا بحساب قياسات قطرها القلب أثناء انقباض وانبساط كلا من تقصير التي تحسب كسور والتغيرات منطقة كسور. يتم توفير الإخراج كملف رقمية متوافقة مع معظم برامج جداول البيانات. يتم إجراء قياسات لكل نبضة في سجل زيادة القدرة الإحصائية للإخراج. نظهر كل خطوة من الخطوات التي تتطلب إدخال المستخدم وتظهر لدينا تطبيق منهجية لتحليل وظائف القلب في جميع النماذج الثلاثة القلب لين العريكة وراثيا.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts at JoVE.com

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

قمنا بتطوير شبه الآلي التحليل البصري نبضات أسلوب (سهى) لتحليل تسجيلات عالية السرعة الضوئية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; ، الزرد وقلوب الماوس الجنينية. نظهر تطبيق منهجيتنا لتحليل وظيفة القلب في ذبابة الفاكهة وقلوب الماوس الجنينية.

شبه الآلي التحليل البصري نبضات القلوب الصغيرة

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. قمنا بتطوير شبه الآلي التحليل البصري نبضات أسلوب (سهى) لتحليل تسجيلات عالية السرعة الضوئية من ذبابة الفاكهة ، الزرد وقلوب الماوس الجنينية. نظهر تطبيق منهجيتنا لتحليل وظيفة القلب في ذبابة الفاكهة وقلوب الماوس الجنينية.

Video: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

وعلى النقيض من مرحلة التدخل التفاضلية المجهري التباين (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

رسم الخرائط البصرية القلوب الجرذ Langendorff - perfused

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: البرنامج المساعد ليماغيج نصف الآلي ورقة قياس الشكل

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

عزل القلب من القلب الثابتة للكيمياء المناعية وتحليل بلودي

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not only attributed to the normal variability of cells, but also to the differences in methods and models of cell response. Here, an integrated protocol using optical tweezers and defocusing microscopy is employed to obtain the rheological features of red blood cells in the frequency range of 1 Hz to 35 Hz. While optical tweezers are utilized to measure the erythrocyte-complex elastic constant, defocusing microscopy is able to obtain the cell height profile, volume, and its form factor a parameter that allows conversion of complex elastic constant into complex shear modulus. Moreover, applying a soft glassy rheology model, the scaling exponent for both moduli can be obtained. The developed methodology allows to explore the mechanical behavior of red blood cells, characterizing their viscoelastic parameters, obtained under well-defined experimental conditions, for several physiological and pathological conditions.

Here, an integrated protocol based on optical tweezers and defocusing microscopy is described to measure the rheological properties of cells. This protocol has wide applicability in studying the viscoelastic properties of erythrocytes under variable physio-pathological conditions.

التحليل الكمي للخصائص اللزجة المرنة لخلايا الدم الحمراء باستخدام ملاقط بصرية والفحص المجهري اللابؤري

The viscoelastic properties of erythrocytes have been investigated by a range of techniques. However, the reported experimental data vary. This is not ...

عزل شبه آلي للأنسجة الدهنية البيضاء للفأر

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

تسليط الضوء على المؤلف: عزل شبه آلي لجزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية البيضاء الفئران باستخدام مفكك الأنسجة  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...