1) Preparazione della giunzione Drosophila melanogaster neuronale muscolare (NMJ) <ol><li> Preparare standard di Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM saccarosio, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 Hepes mM, pH 7.3 4. </li><li> Sezionare la preparazione in soluzione salina (1,1). Le larve di Drosophila si struggeva dorsale laterale in un piatto Sylgard, il lato dorsale è sezionato longitudinale, e gli organi interni vengono rimossi. La preparazione è poi allungato e si struggeva. Diversi muscoli ventrali possono essere poi utilizzati. </li></ol> 2) La stimolazione e colorazione FM <ol><li> Si consiglia di fare tutte le seguenti operazioni in condizioni di scarsa illuminazione, al fine di proteggere coloranti FM da sbiancamento. </li><li> Per la stimolazione chimica dei nervi, buffer di potassio alto viene utilizzato. Preparare Drosophila salina (cfr. punto 1.1) contenente 90 mM di KCl e 10 mM di FM1-43 colorante. Tenere la soluzione al riparo dalla luce. </li><li> Bagno la preparazione con il buffer precedentemente preparato per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Lavare con standard di Drosophila salina (1,1) per rimuovere extracellulare FM1-43 colorante. Procedere rapidamente alla fissazione. </li></ol> 3) di fissaggio <ol><li> Bagno la preparazione con glutaraldeide al 2,5% in PBS (PBS) per 45 minuti a temperatura ambiente. Per la buona conservazione delle caratteristiche morfologiche, glutaraldeide è preferito a paraformaldeide. </li><li> Lavare una volta con PBS e poi lasciare la preparazione sommerso per 15 minuti in 100 mM di NH 4 Cl. Questo passo è fatto al fine di estinguere i gruppi aldeidi libera del fissativo glutaraldeide rimanenti. </li><li> Lavare i 4 soluzione Cl NH con normale PBS. </li></ol> 4) fotoconversione <ol><li> Incubare la preparazione NMJ per 30 minuti a 4 ° C in PBS contenente 1,5 mg ml-1 di diaminobenzidina (DAB). </li><li> Posizionare il campione al microscopio a fluorescenza. Trovare e mettere a fuoco il segnale fluorescente con un relativamente basso dell&#39;acqua obiettivo ingrandimento immersione (20x 0,5 NA). </li><li> Illuminare il campione con la massima intensità della lampada fino a quando il colorante FM è completamente sbiancato (Figura 1C). Per controllare se fotoconversione si è verificato, è consigliabile verificare presso il campione sotto la luce di trasmissione prima e dopo la tintura, candeggio FM passo. Se fotoconversione avviene, un precipitato marrone scuro è atteso (Figura 1C). Il tempo di illuminazione è variabile, a seconda della illuminazione e forza anche sulla penetrazione DAB nella preparazione. Per la maggior parte preparati, abbiamo trovato i tempi di illuminazione di circa 30-45 minuti per essere ottimale quando si utilizza un obiettivo 20x. Illuminazione periodi più brevi sono utilizzate per gli obiettivi di ingrandimento superiore (60x). </li><li> Per l&#39;illuminazione preferiamo usare una lampada al mercurio, con una lampada contenente uno specchio posteriore, che raccoglie il back-sparsi fasci di luce, e quindi aumenta l&#39;intensità totale. </li></ol> 5) Elaborazione del campione per EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Preparare una soluzione con un volume di tetrossido di osmio albero dei volumi di acqua (circa 300 ml per campione). Lavoro con tetrossido di osmio deve essere fatto sotto il cofano, usando guanti e aye dispositivi di protezione. </li><li> Incubare la preparazione della soluzione osmio tetrossido per 1 ora a temperatura ambiente (Sotto il cofano). </li><li> Lavare a lungo con PBS (4-5 volte 5 minuti) e trasferire ogni campioni da una bottiglia di vetro pulito. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol class="lalpha"><li> Preparare soluzioni separate contenenti 30, 50, 70 90, 95 e 100% di etanolo. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 30% per ogni campione per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 50% per ogni campione per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% per ogni campione per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 90% per ogni campione per 5 minuti. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 95% per ogni campione per 5 minuti (repeat 3x). </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 100% per ogni campione per 5 minuti (repeat 3x). </li></ol></li><li> Incorporare e l&#39;ulteriore elaborazione <ol class="lalpha"><li> Mescolare 1 volume di Epon resina con un volume di etanolo. Aggiungerlo alla preparazione in rotazione continua (2-4 ore). </li><li> Mettere il preparato in Epon 100% in flaconi aperti, lasciare evaporare l&#39;etanolo residuo (4-6 ore). </li><li> Mettere il preparato in stampi a 60 ° C per 36 ore. </li><li> Microscopia elettronica di elaborazione. Processo di preparazione nel 50-80 nm sezioni sottili, utilizzando le procedure ultramicrotomy standard. </li></ol></li><li> Microscopia elettronica a immagini <ol class="lalpha"><li> La preparazione è ripreso con i convenzionali procedure di EM. </li></ol></li></ol> 6) Rappresentante Risultati I risultati attesi sono descritti nelle figure 1C e 2. L&#39;illuminazione risultati della procedura nella formazione di brown precipitare DAB, che sarà visibile sia in fluorescenza e di imaging di trasmissione. Il verificarsi prima durante illuminazione è la scomparsa della fluorescenza associata alla colorazione colorante FM. La fluorescenza di fondo indotto dalla fissativo aldeide, al contrario, sarà visibile in tutto l&#39;esperimento. Lo sbiancamento avviene di solito in ~ 10-20 minuti dopo l&#39;inizio di illuminazione. Tipicamente nessun prodotto fotoconversione può osservare a questo punto del tempo. L&#39;illuminazione deve essere continuato, e dopo ~ 10 minuti i preparativi si trasformi in una tonalità marrone a causa di accumulo di DAB (Fig. 1C iv) Non è chiaro perché le precipitazioni DAB e FM colorante sbiancamento non avvengono simultaneamente, è possibile che una relativamente grande quantità di DAB ossidato ha bisogno di accumulare prima di aggregazione e precipitazione, e che quindi questa reazione è più lento il processo di sbiancamento. In questa fase, tuttavia, il preparato non è pronto per l&#39;elaborazione di microscopia elettronica, come la precipitazione DAB è probabilmente incompleto. Noi preferiamo aspettare 5-10 minuti più lunghi, durante i quali la preparazione (terminale nervoso presinaptico) assume un colore marrone scuro (o nero) a colori, indicativo di completa conversione. Una conversione leggera della superficie generale della preparazione (per esempio, delle fibre muscolari in una giunzione neuromuscolare) si possono osservare in questa fase. E &#39;molto probabilmente legati alla conversione del DAB indotta da autofluorescenza (e / o fluorescenza fissativo), e non è dannoso per la procedura. La preparazione viene poi elaborato per la microscopia elettronica, e devono essere controllati per la presenza di buio (con etichetta) vescicole. Come abbiamo dimostrato prima di 5,6, queste vescicole sono molto più denso non etichettati quelli, e sono quindi facilmente distinguibili (Figura 2B). Per aumentare la possibilità di distinguere bene i diversi tipi di vescicole, nessun contrasto di miglioramento colorazione posto di sezioni deve essere eseguita (non acetato di uranile o citrato di macchie di piombo), la colorazione osmio è sufficiente osservare elementi più cellulari, e non è così scuro come precipitare DAB. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: coloranti FM e lo uso per fotoconversione. (A) Rappresentare le fasi di un esperimento classico per il carico e sequestro vescicole usando colorante FM sotto stimolazione. (I) Incubare il campione in FM colorante contenente tampone. (Ii) Stimolare (elettricamente o chimicamente) per indurre la fusione delle vescicole in presenza di FM colorante. (Iii) Il endocitosi sottosuccessione dopo la stimolazione verrà caricato alcune vescicole con colorante FM ancora presenti nel buffer extracellulare. (Iv) Sostituire il colorante extracellulare FM con il lavaggio con soluzione tampone. (V) Un nuovo stimolo indurrà vescicole caricato per liberare la loro tintura FM su esocitosi. (B) Schema che mostra il, ponte di testa e la coda della FM1-43 colorante. (C) Esempio di un esperimento fotoconversione in Drosophila NMJ. (I) Dopo aver caricato il NMJ con FM1-43, il lavaggio esterno molecole di colorante e di fissaggio, la fluorescenza di una terminazione nervosa può essere osservato con un microscopio convenzionale epifluorescenza (63x). (Ii-iii) Sotto illuminazione continua il colorante è completamente imbiancato. (Iv) In condizioni di illuminazione continua, un colore nero sembra a causa di precipitazioni diaminobenzidina. Barra di scala rappresenta 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: EM esempi di campioni photoconverted (A) L&#39;immagine mostra un terminale nervose contenenti vescicole sinaptiche, ma non di loro sono photoconverted, questo potrebbe essere causato da non avere un&#39;illuminazione sufficiente o scarsa penetrazione diaminobenzidina nel tessuto.. (B) bouton Synaptic con diversi scura (piena) vescicole che ha attraversato fotoconversione FM. (C) Eccesso di risultati illuminazione in un terminale complessivo buio dove non vescicole o organelli sono distinguibili. Barre di scala rappresentano 200 nm.

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

A pochi passi critici devono essere presi in considerazione: <ul><li> L&#39;incubazione DAB deve essere eseguita solo dopo il lavaggio accurato e tempra dei preparativi. Altrimenti la glutaraldeide non ha reagito interagirà con DAB e provocare la sua precipitazione (in genere sotto forma di cristalli piatti, che non sono densi di elettroni). Preparativi in ​​cui questo avviene precipitazioni abbondantemente sono raramente utilizzabili per la microscopia elettronica. </li><li> Tempi di illuminazione deve essere ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

La fusione delle vescicole sinaptiche con la membrana plasmatica (esocitosi) è un passo necessario nel rilascio dei neurotrasmettitori e la comunicazione neuronale. Le vescicole sono poi recuperati dalla membrana plasmatica (endocitosi) e raggruppati con la riserva generale di vescicole all&#39;interno del terminale nervoso, fino a subire un nuovo ciclo eso-ed endocitosi (riciclo delle vescicole). Questi processi sono stati studiati usando una varietà di tecniche come la microscopia elettronica, le registrazioni elettrofisiologiche, amperometria e misure di capacità. È importante sottolineare che nel corso degli ultimi due decenni una serie di marker fluorescente emerse, consentendo tecniche ottiche per monitorare vescicole nelle loro dinamiche di riciclaggio. Uno degli indicatori più comunemente usato è il styryl o FM colorante 1, strutturalmente, tutti i coloranti FM contengono una testa idrofila e una coda lipofila collegato tramite un anello aromatico e uno o più doppi legami (Fig. 1B). Un esperimento di tintura classica FM per etichettare un pool di vescicole consiste nel fare il bagno nella preparazione (Fig. 1Ai) con il colorante durante la stimolazione del nervo (elettricamente o con elevata K +). Questo induce il riciclo delle vescicole e il caricamento successivo del colorante in vescicole di recente endocitato (Fig. 1A I-III). Dopo aver caricato le vescicole con colorante, un secondo round di stimoli in una tintura senza bagno sarebbe innescare il rilascio FM per esocitosi (Fig. 1A IV-V), processo che può essere seguita attraverso il monitoraggio della riduzione dell&#39;intensità di fluorescenza (decolorazione). Sebbene coloranti FM hanno contribuito grandemente al settore del riciclaggio delle vescicole, non è possibile determinare la localizzazione esatta o morfologia delle vescicole individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Per questo motivo, spieghiamo qui come FM coloranti possono essere utilizzati anche come marcatori endocitico usando la microscopia elettronica, attraverso fotoconversione. La tecnica fotoconversione sfrutta la proprietà di coloranti fluorescenti per generare specie reattive dell&#39;ossigeno sotto illuminazione intensa. Preparati fluorescente sono immersi in una soluzione contenente diaminobenzidina (DAB) e illuminato. Specie reattiva, generate dalle molecole di colorante ossidare il DAB, che forma una stalla, precipitato insolubile che ha un aspetto scuro e sono facilmente riconoscibili in microscopia elettronica a 2,3. Come DAB è solo ossidato nelle immediate vicinanze di molecole fluorescenti (come le specie reattive dell&#39;ossigeno sono di breve durata), la tecnica fa sì che le strutture solo fluorescente stanno per contenere l&#39;elettrone-denso precipitato. La tecnica permette quindi lo studio della posizione esatta e la morfologia del attivamente riciclaggio organelli.

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Coloranti FM sono stati di enorme aiuto nella comprensione delle dinamiche sinaptiche. FM sono normalmente seguiti sotto il microscopio a fluorescenza in condizioni di stimolazione differenti. Tuttavia, fotoconversione di coloranti FM combinato con il microscopio elettronico permette la visualizzazione di diverse piscine delle vescicole sinaptiche, tra i componenti ultrastruttura altro, in boutons sinaptica.

Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  European Neuroscience Institute Göttingen. Coloranti FM sono stati di enorme aiuto nella comprensione delle dinamiche sinaptiche. FM sono normalmente seguiti sotto il microscopio a fluorescenza in condizioni di stimolazione differenti. Tuttavia, fotoconversione di coloranti FM combinato con il microscopio elettronico permette la visualizzazione di diverse piscine delle vescicole sinaptiche, tra i componenti ultrastruttura altro, in boutons sinaptica.

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ricerca

Neuroscienze

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Modello di topo indotta da pentylenetetrazole accensione

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Un test ottico per riciclo delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni che Overexpressing proteine presinaptiche

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...