1) Elaboração de Drosophila melanogaster junção neuronal muscular (MNJ) <ol><li> Prepare padrão Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Dissecar a preparação em solução salina (1,1). As larvas Drosophila é pined dorsal lateral-up em um prato Sylgard; o lado dorsal é seccionado longitudinal, e os órgãos internos são removidos. A preparação é então esticada e pined. Vários músculos ventral pode ser então utilizado. </li></ol> 2 Stimulation) e coloração FM <ol><li> É aconselhável fazer todas as etapas a seguir em condições de pouca luz, a fim de proteger corantes FM de branqueamento. </li><li> Para a estimulação química dos nervos, tampão de potássio alta é usado. Prepare Drosophila salina (ver 1.1), contendo 90 mM de KCl e 10 mM de FM1-43 corante. Manter a solução protegido da luz. </li><li> Banho de preparação com o buffer previamente preparado por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Lavar com solução salina padrão Drosophila (1.1) para remover a tintura FM1-43 extracelular. Proceder rapidamente à fixação. </li></ol> 3) Fixação <ol><li> Banho de preparação com glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato (PBS) por 45 minutos em temperatura ambiente. Para boa preservação das características morfológicas, o glutaraldeído é preferível a paraformaldeído. </li><li> Lavar uma vez com PBS e em seguida, deixar a preparação submerso por 15 minutos em 100 mM de NH 4 Cl. Este passo é feito a fim de saciar os grupos aldeído livre do fixador glutaraldeído restantes. </li><li> Lavar a solução de NH 4 Cl com PBS normal. </li></ol> 4) fotoconversão <ol><li> Incubar a preparação MNJ por 30 minutos a 4 ° C em PBS contendo 1,5 mg ml-1 de diaminobenzidina (DAB). </li><li> Posição da amostra sob o microscópio fluorescente. Encontrar e concentrar o sinal fluorescente usando um relativamente baixo ampliação da objetiva de imersão em água (20x 0,5 NA). </li><li> Iluminam a amostra com a intensidade de luz máxima até o corante FM é totalmente branqueada (Figura 1C). Para controlar se fotoconversão ocorreu, é aconselhável verificar na amostra sob a luz de transmissão antes e depois da tintura de branqueamento FM passo. Se fotoconversão ocorre, um precipitado marrom escuro é esperado (Figura 1C). O tempo de iluminação é variável, dependendo da força de iluminação e também sobre a penetração DAB na preparação. Para a maioria das preparações, encontramos vezes a iluminação de aproximadamente 30-45 minutos para ser o ideal quando se usa um objetivo 20x. Períodos mais curtos de iluminação são usadas para objetivos maior ampliação (60x). </li><li> Para iluminação nós preferimos usar uma lâmpada de mercúrio, com uma lâmpada contendo um espelho de volta, que recolhe os feixes espalhados back-luz, e, portanto, aumenta a intensidade total. </li></ol> 5) Processamento de amostra para o EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Prepare uma solução com um volume de tetróxido de ósmio em volumes de árvore de água (cerca de 300 mL por amostra). Trabalho utilizando tetróxido de ósmio deve ser feito sob a capa, usando luvas e equipamentos de proteção aye. </li><li> Incubar a preparação da solução de tetróxido de ósmio por 1 hora à temperatura ambiente (Sob o capô). </li><li> Lavar exaustivamente com PBS (4-5 vezes 5 minutos) e de transferência de cada amostra para um frasco de vidro limpo. </li></ol></li><li> Desidratação <ol class="lalpha"><li> Prepare soluções separadas contendo 30, 50, 70 90, 95 e 100% de etanol. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol 30% para cada amostra por 5 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol 50% para cada amostra por 5 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol 70% para cada amostra por 5 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol 90% para cada amostra por 5 minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol a 95% para cada amostra por 5 minutos (3x). </li><li> Adicionar 1 ml de etanol a 100% a cada amostra por 5 minutos (3x). </li></ol></li><li> Incorporação e posterior processamento <ol class="lalpha"><li> Misturar 1 volume de resina Epon com um volume de etanol. Adicioná-lo para a preparação sob rotação contínua (04/02 horas). </li><li> Coloque a preparação em Epon 100% em frascos abertos, permitem que o etanol restantes para evaporar (4-6 horas). </li><li> Coloque a preparação em moldes a 60 ° C por 36 horas. </li><li> Eletrônica de processamento de microscopia. Processo de preparação em 50-80 nm seções finas, utilizando procedimentos ultramicrotomy padrão. </li></ol></li><li> Eletrônica de imagens de microscopia <ol class="lalpha"><li> A preparação é fotografada usando os procedimentos convencionais EM. </li></ol></li></ol> 6) Resultados Representante Os resultados esperados são descritas nas Figuras 1C e 2. A iluminação procedimento resulta na formação de broprecipitar wn DAB, que será visível em ambas as imagens de fluorescência e de transmissão. A primeira ocorrência durante a iluminação é o desaparecimento da fluorescência associada à coloração dye FM. A fluorescência de fundo induzida pelo fixador de aldeídos, em contrapartida, será visível durante todo o experimento. O branqueamento ocorre normalmente em ~ 10-20 minutos após o início da iluminação. Normalmente nenhum produto fotoconversão pode ser observado neste ponto do tempo. Iluminação deve ser continuado, e depois de ~ 10 minutos os preparativos vai virar uma sombra marrom, devido à acumulação de DAB (Fig 1C iv) Não está claro porque DAB precipitação e FM corante clareamento não ocorrem simultaneamente, é possível que uma relativamente grande quantidade de DAB oxidada precisa acumular antes de agregação e precipitação, e que, portanto, esta reação é mais lenta do que o processo de branqueamento. Nesta fase, no entanto, a preparação não está pronto para o processamento de microscopia eletrônica, como a precipitação DAB é provável incompleta. Nós preferimos esperar mais 5-10 minutos, durante o qual a preparação (terminal nervoso pré-sináptico) assume uma cor castanho-escuro (ou preto), indicativo de conversão completa. A conversão ligeiro de superfície geral da preparação (por exemplo, das fibras musculares em uma junção neuromuscular) podem ser observados nesta fase. Ele está provavelmente relacionado a uma conversão de DAB induzida por autofluorescência (e / ou fixador de fluorescência), e não é prejudicial para o procedimento. A preparação é então processada para microscopia eletrônica, e deverá ser verificada a presença de escuro (rotulado) vesículas. Como demonstramos antes de 5,6, essas vesículas são muito mais denso do que os não-rotulados queridos, e por isso são facilmente distinguíveis (Figura 2B). Para aumentar a chance de distinguir bem os diferentes tipos de vesículas, sem contraste de reforço pós coloração das seções devem ser realizados (sem acetato de uranila e citrato de chumbo coloração), a coloração de ósmio é suficiente para observar elementos mais celular, e não é tão escuro como precipitar DAB. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: corantes FM e usar para fotoconversão. (A) Representar os passos de uma experiência clássica para o carregamento e distaining vesículas usando corante FM sob estímulo. (I) incubar a amostra em FM corante contendo buffer. (Ii) Estimular (eletricamente ou quimicamente) para induzir a fusão das vesículas na presença de FM corante. (Iii) A endocitose subsequence após a estimulação vai carregar algumas vesículas com FM dye ainda presente no tampão extracelular. (Iv) Substituir o corante extracelular FM por lavagem com tampão. (V) A estimulação novo induzir vesículas carregadas para liberar sua tintura FM sobre exocitose. (B) Esquema mostrando a cabeça de ponte, e na cauda do corante FM1-43. (C) Exemplo de um experimento fotoconversão em Drosophila MNJ. (I) Depois de carregar o MNJ com FM1-43, a lavagem externa moléculas de corante e fixação, a fluorescência de um terminal de nervo pode ser observado com um microscópio convencional de epifluorescência (63x). (Ii-iii) Sob iluminação contínua do corante é completamente branqueada. (Iv) Quando a iluminação continua, a cor preta aparece devido à precipitação diaminobenzidina. Barra de escala representa 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: EM exemplos de amostras photoconverted (A) A imagem mostra um terminal nervoso contendo vesículas sinápticas, mas não deles são photoconverted; isso pode ser causado por não ter iluminação suficiente ou penetração diaminobenzidina pobres no tecido.. (B) bouton Synaptic com vários escuro (cheia) vesículas que passou por fotoconversão FM. (C) Excesso de iluminação resulta em um terminal geral escuros, onde não vesículas ou organelas são distinguíveis. Barras de escala representam 200 nm.

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

A poucos passos críticos devem ser levados em conta: <ul><li> A incubação DAB deve ser realizada somente após a lavagem completa e extinção dos preparativos. Caso contrário, o glutaraldeído não reagiu irá interagir com DAB e causar a sua precipitação (tipicamente na forma de cristais de plano, que não são elétron denso). Preparações em que essa precipitação ocorre abundantemente raramente são utilizáveis ​​para microscopia eletrônica. </li><li> Vezes a iluminação deve ser otimizada, por m...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

A fusão das vesículas sinápticas com a membrana plasmática (exocitose) é uma etapa necessária na liberação de neurotransmissores e comunicação neuronal. As vesículas são então recuperados da membrana plasmática (endocitose) e agrupados com o grupo geral de vesículas dentro do terminal nervoso, até que se submetem a um exo-e novo ciclo de endocitose (reciclagem das vesículas). Esses processos têm sido estudados usando uma variedade de técnicas como microscopia eletrônica, gravações de eletrofisiologia, amperometria e medições de capacitância. Importante, durante as últimas duas décadas uma série de marcadores fluorescente etiquetado surgiram, permitindo que técnicas ópticas para acompanhar vesículas na dinâmica a sua reciclagem. Um dos marcadores mais comumente utilizado é o styryl ou FM corante 1; estruturalmente, todos os corantes FM conter uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectados através de um anel aromático e um ou mais duplas ligações (Figura 1B). Uma experiência clássica corante FM para rotular um conjunto de vesículas consiste em banhar a preparação (Fig. 1Ai) com o corante durante a estimulação do nervo (eletricamente ou com alto K +). Isto induz a reciclagem vesícula eo carregamento posterior do corante em vesículas recentemente endocytosed (Fig. 1A i-iii). Depois de carregar as vesículas com corante, uma segunda rodada de estímulo em um banho de tintura livre provocaria a liberação FM através de exocitose (Figura 1A iv-v), processo que pode ser seguido através do monitoramento da diminuição da intensidade de fluorescência (descoloração). Embora as tinturas FM têm contribuído grandemente para o campo da reciclagem de vesícula, não é possível determinar a localização exata ou morfologia das vesículas individuais por meio de microscopia de fluorescência convencional. Por essa razão, vamos explicar aqui como FM corantes também podem ser usados ​​como marcadores endocítica meio de microscopia eletrônica, através fotoconversão. A técnica fotoconversão explora a propriedade de corantes fluorescentes para gerar espécies reativas de oxigênio sob iluminação intensa. Preparações fluorescente etiquetado estão submersos em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB) e iluminado. Espécies reativas geradas pelo moléculas de corante oxidar o DAB, que forma um precipitado estável e insolúveis que tem uma aparência escura e pode ser facilmente distinguido em microscopia eletrônica 2,3. Como DAB é apenas oxidado nas imediações de moléculas fluorescentes (como as espécies reativas de oxigênio são de curta duração), a técnica garante que as estruturas só fluorescente etiquetado estão indo para conter o precipitado elétron-denso. A técnica permite, assim, o estudo da localização exata e morfologia ativamente reciclagem organelas.

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.

Estudando Pools vesículas Synaptic usando fotoconversão de Corantes Styryl

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

studying-synaptic-vesicle-pools-using-photoconversion-of-styryl-dyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K visualizações.  European Neuroscience Institute Göttingen. Corantes FM tem sido de inestimável ajuda na compreensão da dinâmica sináptica. FMs são normalmente seguidos sob o microscópio de fluorescência em condições de estimulação diferente. No entanto, fotoconversão de corantes FM combinado com microscopia eletrônica permite a visualização de distintas piscinas das vesículas sinápticas, entre outros componentes ultra-estrutura, em boutons sináptica.

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Neurociência

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...