Wir bedanken uns bei Susan Gerbi, Heidi Smith und David Lambert für die Versorgung Material in-vivo-Zentrifugation auf Sciara coprophila und Ilyanassa obsoleta, verglichen. Wir danken Mitglieder der Welte-Labor für die Kommentare auf die Technik und Handschrift. Entwicklung und Verfeinerung der in-vivo-Assay wurde durch Zentrifugation NIGMS gewähren GM64687 zu MAW unterstützt. Die Bilder in Abb.. 1 und Abb.. 5E wurden F bisher 2 veröffentlicht und sind hier mit freundlicher Genehmigung abgedruckt.

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Kritische Schritte Stellen Sie sicher, dass der Agar-Konzentration hoch genug ist. Wenn es zu niedrig ist, wird der Agar während der Zentrifugation zerfallen, und die Embryonen platzen oder zufällig orientiert. Wenn der Agar-Konzentration ist nur etwas zu niedrig ist oder wenn der Agar ist nass (unzureichend getrocknet oder unzureichende Entfernung von überschüssigem TSS in Schritt 4,3), werden die Embryonen float aus ihren Löchern während des Laufs und werden falsch ausgerichtet. Wenn der Agar zu dünn gegossen ist, wird es auch zusammenbrechen oder Crack während der Zentrifugation. Stellen Sie sicher, dass Embryonen nicht über Zellularisierung Stadien fortgeschritten. Anderenfalls wird die Trennung von Organellen nicht funktioniert (Abb. 5C) seit Organellen wird sequestriert in Tausenden von einzelnen Zellen. In jüngeren Embryonen auf der einen Zell-Stadium sind Organellen frei, um große Strecken wandern und reichern sich entsprechend ihrer charakteristischen Dichte. Um zu vermeiden, zu analysieren Embryonen, die zu alt sind, stellen Sie sicher, (i) eine Pre-Collection, damit Frauen, alte Eier (Schritt 2,4), (ii) zu sammeln Embryonen für 3 Stunden oder weniger (Schritt 2,5), (iii) lagen visuell auswählen Embryonen vor Zellularisierung Stadien für die Einbettung in Agar (Schritt 4,2), (iv) halten die Einbettung der Zeit kurz ist, um die Entwicklung bis zum Ende des Zellularisierung (Schritt 4,6) zu verhindern, und (v) zu verwerfen Embryonen, die nicht korrekt Schicht (Schritt 5,6) . Sie sparen nicht auf die Zentrifugationszeit. Obwohl einige der Embryonen schöne Schichtung auch nach nur 10 Minuten Zentrifugation zeigen, ist die Trennung inkonsistent vom Embryo zum Embryo. 30 min dreht geben sehr konsistente Ergebnisse. Auch, desto länger die Zentrifugation Zeit, je länger die Schichten stabil sind nach der Zentrifugation wurde beendet. Dies ist für diejenigen Anwendungen, bei denen es braucht Zeit, um die Embryonen weiter verarbeiten vor Gebrauch wichtig (z. B., wenn sie für die Transplantation Versuche verarbeitet werden oder angebracht zum konfokalen Analyse benötigen). Mögliche Änderungen Eiersammlung und Chorion Entfernung Viele verschiedene Protokolle gibt es für die Schritte 2 und 3 1, 3, 9, und wird ebenso wie Arbeiten der hier beschriebenen, solange die Embryonen verwendet jung sind, ist Ei Ausbeute hoch, und der Anteil der mis- inszeniert Embryonen wird minimiert. Anterior-posteriore Ausrichtung Das Protokoll orientiert alle Embryonen, so dass das hintere Ende in der Agar ist begraben und am vorderen Ende ist (Abb. 3). Diese Orientierung ist gut für die Konsistenz, so dass es möglich ist, die Mikropyle als Landmarke, die am Ende während der Zentrifugation (Abb. 1, 5) wies verwenden. Doch mit der Praxis ist es einfach, wählen Sie die Ausrichtung des zentrifugiert Embryonen durch die unterschiedliche Aussehen der Lipid-Tröpfchen und Eigelb Schichten von Hellfeld-Mikroskopie. Dann wird es möglich, Embryonen mit einem Ende auffahren; diese Flexibilität beschleunigt die Montage-Prozess. Unorientierten Zentrifugation Die-zeitaufwendig und technisch anspruchsvollen Aspekt des Protokolls ist die Montage des Embryos in Agar (Schritt 4). Es erfordert berühren Embryo zweimal (einmal, um sie in das Loch und einmal, um es nach der Zentrifugation zu erholen). Als Alternative kann man Embryonen im Schritt 4.1 Transfer in Reaktionsgefäßen mit TSS gefüllt. Wenn diese Rohre in einer Mikrozentrifuge (13.000 rpm, 10-30 min) werden zentrifugiert, Embryonen wird in der Regel auch Schicht gut 10-13. Diese Variante ermöglicht es, Hunderte von Embryonen zur gleichen Zeit sehr schnell zu verarbeiten. Allerdings ist Schichtung nicht so konsequent, nur einen Bruchteil der Embryonen nicht entwickeln unterschiedliche Schichten trotz wesentlich höheren Zentrifugalkräften (~ 16.000 g) als in dem Protokoll über aufgetragen. Anspruchsvoller ist die Tatsache, dass die Ausrichtung der Embryonen Variable ist, und man kann die Trennung in verschiedenen Winkeln zu den großen Embryo Achse zu beobachten. Diese Variabilität erfordert die Versuchsleiter zu klären, nach der Zentrifugation, wie ein bestimmter Embryo im Zentrifugenglas wurde angeordnet. Mit dem Einsatz des Dotters Autofluoreszenz als Marker für die-dichte Teil des Embryos, ist dies oft möglich, obwohl es viel Übung und mehr Urteil, um es sicher zu tun erfordert. Wenn es genügend Embryonen in der Probe vorhanden sind, kann man in der Lage sein zu klären, die Fälle, in denen Embryonen geschehen, wie in Abb. arrangiert werden. 1. Zentrifugation von Embryonen in ihren Eierschalen Es ist möglich, Embryonen in Agar für Schritt 4 einzubetten, ohne den Chorion ersten 2. In diesem Ansatz werden Embryonen für die Sammlung Platte mit Halocarbonöl anstelle von 50% Bleichmittel in Schritt 3,2 (Halogenkohlenwasserstoff wird das Chorion transluzent) abgedeckt. Embryonen von geeigneten Stufen gewählt werden und auf eine neue Agarplatte mit einer Pinzette, durch Greifen nur das Ei Filamente mit der Pinzette, Schäden ander Embryo richtige ist vermieden. Die Embryonen werden wie in Schritt 4.4 durch 4,8 eingebettet, mit der vorderen Ei Filamente ragte aus dem Loch in der Agar. Die Eierschale ist um 50% Bleichmittel Behandlung entfernt werden, nachdem die Embryonen zentrifugiert wurde und aus dem Agar als in Schritt 5.4 gegraben. Zentrifugation in der Gegenwart der Eischale kann zur Verbesserung der Rate von devitellinization nach der Fixierung (Schritt 6.2), aber die Auswahl der richtigen Stadien für die Zentrifugation (Schritt 4.2) ist eine größere Herausforderung. Anwendungen Embryo Zentrifugieren ist besonders nützlich für Kolokalisation Experimente, dh zu testen, ob ein bestimmtes Protein lokalisiert zu einem gewissen wichtigen Organellen. Zum Beispiel der Klar-Proteins an der frühen Embryonalentwicklung Lipidtröpfchen wird, ist noch dieser Lokalisation eine Herausforderung, in intakten Embryonen zu demonstrieren. Zum Teil ist dies, weil sowohl Klar puncta und Fetttröpfchen in den Embryo Peripherie 10 sind reichlich vorhanden, so dass störende Kolokalisation schwer auszuschließen. Allerdings konzentriert sich Zentrifugation Fetttröpfchen in eine deutliche Schicht, und somit wird Kolokalisation mit Klar-Signal auf der Hand 10. Ähnliche Analyse hat eindeutig die Lokalisierung von anderen Proteinen zu Lipidtröpfchen 8, 13-15, darunter überraschende Beispiele wie bestimmte Histone 2 und in Fällen, in denen ein Protein vorhanden ist ubiquitär nachgewiesen, sondern bereichert auf Lipidtröpfchen 8. Als Embryonen können optisch durch Entwicklungsstadium (Schritt 4,2) gewählt werden, ist es sogar möglich, entwicklungsregulierten Rekrutierung von Proteinen an Lipidtröpfchen 8, 15 zu erkennen. Testing für Kolokalisation mit Fetttröpfchen ist besonders einfach, da die Fetttröpfchen in eine optisch deutliche &quot;cap&quot; akkumulieren, so dass keine weiteren Marker oder Flecken ist erforderlich, um diese Schicht zu identifizieren. In der Tat, wegen seiner Leichtigkeit und potenziell auffälligen optischen Ergebnisse (Abb. 1, Abb.. 5 D, E), beschäftigt unser Labor diese Technik nun routinemäßig als ein erster Test, ob ein Kandidat Protein Lipidtröpfchen lokalisiert ist. Im Prinzip sollte ähnlich Kolokalisation Studien für die anderen Organellen in Abb. arbeiten. 1, und wahrscheinlich für andere (einschließlich intrazelluläre Parasiten), deren Verteilung in zentrifugiert Embryonen ist noch nicht dokumentiert werden. Da Zentrifugation konzentriert Organellen in engen Bändern, erleichtert es Isolierung einer Fraktion in dieser Organellen angereichert. Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um die Fetttröpfchen zur Transplantation in Spender Embryonen 2. Datenwiederherstellung. Es kann auch möglich sein, biochemisch analysieren die angereicherte Fraktion (zB durch Abschneiden Schichten aus Embryonen nach der Fixierung 15). Die hier beschriebene Methode hat Anwendungen jenseits Drosophila-Embryonen, wie Zentrifugation kann verwendet werden, um die Eier der vielen verschiedenen Arten (einschließlich Frösche, Nematoden, Manteltiere, Ringelwürmer, Seeigel, Muscheln und Nesseltiere) 16 schichten werden. In unserem eigenen Labor haben wir das Protokoll oben für Embryonen von der Stubenfliege Musca domestica 2 verwendet und eingesetzt unorientierten Zentrifugation in der Analyse von Embryonen aus der Trauermücke Sciara coprophila 17 und die Schnecke Ilyanassa obsoleta 17. Schließlich ist diese Methode nicht für Embryonen beschränkt: Die Zentrifugation kann auch sinnvoll sein, andere große Zellen, wie Oozyten (zB in Drosophila 2, 18 und die milkweed bug Oncopeltus fasciatus 17) schichten. Für verschiedene Muster, müssen die genauen Zentrifugation Bedingungen optimiert werden: Zum Beispiel ist 10 Minuten bei 3000 g ausreichend ist, um effizient zu schichten Embryonen von Musca domestica 2, und wenn zentrifugiert viel länger, neigen die Embryonen auseinander zu brechen während der Fixierung und Immunfärbung.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

Eine wichtige Strategie zur Reinigung und Isolierung verschiedener intrazellulären Organellen ist, sie voneinander zu trennen basierend auf Unterschieden in Schwebedichte. Allerdings, wenn die Zellen vor der Zentrifugation, Proteinen und Organellen in dieser nicht-native Umgebung gestört werden oft fälschlicherweise aneinander kleben. Hier beschreiben wir eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in intakten, lebenden Drosophila-Embryos. Frühe Embryonen vor Zellularisierung sind aus Käfigen Bevölkerung geerntet, und ihre äußeren Eierschalen werden durch Behandlung mit 50% Bleichmittel entfernt. Die Embryonen werden dann zu einem kleinen Agarplatte und eingefügt, hinteren Ende zuerst, in kleinen vertikalen Löcher in den Agar übertragen. Die Platten mit eingebetteten Embryonen werden für 30 min bei 3000g zentrifugiert. Der Agar unterstützt die Embryonen und hält sie in einer definierten Orientierung. Anschließend werden die Embryonen aus dem Agar mit einer stumpfen Nadel gegraben. Zentrifugation trennt wichtigsten Organellen in verschiedene Schichten, eine Schichtung gut sichtbar von Hellfeld-Mikroskopie. Eine Reihe von fluoreszierenden Markern zur Verfügung stehen erfolgreiche Schichtung in lebenden Embryonen zu bestätigen. Proteine ​​mit bestimmten Organellen assoziiert wird in einer bestimmten Schicht angereichert werden, zeigt Kolokalisation. Einzelne Schichten können zur biochemischen Analyse oder Transplantation in gespendeten Eizellen gewonnen werden. Diese Technik ist für Organelle Trennung in anderen großen Zellen, einschließlich der Eier und Eizellen von verschiedenen Arten.

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Wir beschreiben eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in lebenden<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen. Die Embryonen werden in Agar eingebettet und zentrifugiert. Diese Technik liefert reproduzierbare Trennung von wichtigen Organellen entlang der anterior-posterior Embryo-Achse. Diese Methode erleichtert die Kolokalisation Experimente und liefert Organelle Fraktionen für die biochemische Analytik und Transplantation Experimente.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K Aufrufe.  University of Rochester. Wir beschreiben eine Methode zur Trennung von Organellen Dichte in lebenden Drosophila Embryonen. Die Embryonen werden in Agar eingebettet und zentrifugiert. Diese Technik liefert reproduzierbare Trennung von wichtigen Organellen entlang der anterior-posterior Embryo-Achse. Diese Methode erleichtert die Kolokalisation Experimente und liefert Organelle Fraktionen für die biochemische Analytik und Transplantation Experimente.