우리는 각각 Sciara coprophila 및 Ilyanassa obsoleta에 대한 인 - 생체내의 원심 분리를 테스트하는 자료를 공급 수잔 Gerbi, 하이디 스미스, 데이비드 램버트 감사드립니다. 우리는 기술과 원고에 대한 의견에 대한 Welte 실험실 구성원 감사합니다. 인 - 생체내 원심 분리 분석의 개발 및 개선을 모우에 NIGMS 부여 GM64687에 의해 지원되었다. 이미지가 그림에 표시됩니다. 1 그림. 5E, F는 이전에 다음 ID로 2를 출판 및 권한과 함께 reprinted 있습니다.

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	<li>Wieschaus, E., N&#252;sslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).</li><li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot.">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li><li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpublished+Observations.">Unpublished Observations.</a> , .</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+XXII:+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging.">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , (1927).</li><li>Welte, M. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

중요 단계 한천 농도가 충분히 높지되어 있는지 확인합니다. 너무 낮으면, 한천은 원심 분리하는 동안 분해되며, 태아가 파열하거나 임의로 지향합니다. 한천 농도 단지 약간 한천이 (단계 4.3에서 초과하는 TSS의 충분 건조 또는 불충 분한 제거) 젖었거나 너무 낮은 경우 경우 태아는 원심 분리하는 동안 그들의 구멍에서 부동과 부적 절한 중심이 될 것입니다. 한천 너무 얇게 부어있다면, 그것은 또한 축소 또는 원심 분리하는 동안 균열 것입니다. organelles 개별 수천개의 세포 내에 분리된 될 것입니다 때문에 배아는 cellularization 단계 이상의 고급 않았는지 확인합니다. 그렇지 않으면, organelles의 분리 (그림 5C) 작동하지 않습니다. 한 세포 단계에서 젊은 배아에서 organelles 큰 거리를 마이 그 레이션하는 무료이며 자신의 특성 밀도에 따라 축적. 너무 오래 배아를 분석 방지하기 위해, 확실하게 (I)은 암컷은 오래된 달걀 (단계 2.4), (II) (단계 2.5) 3 시간 또는 더 적은을위한 배아를 수집, (III)를하다 수 있도록 미리 컬렉션을 포함 시각 한천에 삽입을위한 cellularization 단계 전에 배아를 선택합니다 (단계 4.2), (IV) cellularization (단계 4.6)의 끝 부분을 통해 개발을 방지하기 위해 짧은 시간을 포함 유지하고, (V) (단계 5.6) 정확하게 레이어 않았 배아를 폐기 . 원심 분리 시간에 날림으로하다하지 마십시오. 배아 중 일부는 심지어 원심 분리의 불과 10 분 후에 좋은 겹겹이 표시되지만, 분리는 배아로부터 배아에 일관성이있다. 30 분 놀이는 매우 일관성있는 결과를 제공합니다. 원심 분리가 끝난 후 또한, 더 이상 원심 분리 시간은 더 이상 레이어는 안정됩니다. 이것은 사용하기 전에 추가로 배아를 처리하는 데 시간이 걸립니다 어떤 이들 응용 프로그램에 중요합니다 (예를 들어, 그들은 이식 실험에 대한 처리 또는 공촛점 분석을 위해 장착해야하는 경우). 가능한 수정 에그 수집 및 chorion 제거 대부분의 다른 프로토콜은 2 단계와 3 단계 1, 3, 9 존재하고, 사용되는 배아는 어릴 같은 것들은 오랫동안 여기에 설명뿐만 아니라 작동합니다, 달걀 수율이 높다, 그리고 분수 잘못 개최 배아가 최소화됩니다. 앞쪽에 - 사후 정렬 프로토콜은 뒷부분 끝이 한천에 묻힌과 앞쪽에 끝이 접속 (그림 3)이다 그러한 모든 배아를 orients. 그것이 원심 분리 (그림 1, 5) 동안 지적 결국 랜드마크로 micropyle을 사용할 수 있습니다 있도록이 방향은 일관성을 위해 좋다. 그러나, 연습, 그것은 밝은 - 필드 현미경에 의한 지질 - 비말와 노른자 레이어의 독특한 외모로 centrifuged 태아의 방향을 선택하기 쉽습니다. 그런 다음 양쪽 끝에와 배아를 탑재 가능됩니다, 이러한 유연성은 설치 과정을 속도. Unoriented 원심 분리 프로토콜의 가장 많은 시간과 기술적으로 도전적인 측면 한천의 배아 (4 단계)를 설치합니다. 그것은 (한 구멍에 삽입하고 한 번 원심 분리 후 복구)을 두 번 각각의 배아를 감동 필요합니다. 대안으로, 하나는 TSS 가득 microcentrifuge 튜브에 4.1 단계에서 배아를 전송할 수 있습니다. 이러한 튜브는 microcentrifuge (13,000 RPM, 10-30 분)에 centrifuged 때, 배아 것입니다 역시 일반적으로 계층 10-13. 이것은 유사 하나가 매우 빠르게 동시에 배아의 수백을 처리하실 수 있습니다. 그러나, 겹겹이은 일관성이 없다는 것입니다, 배아의 일부가 위의 프로토콜에 적용보다 훨씬 높은 원심 분리 세력 (~ 1만6천그램)에도 불구하고 서로 다른 레이어를 개발하지 않습니다. 더 많은 도전 태아의 방향이 변수이고, 하나는 주요 배아 축에 다양한 각도에서 분리를 볼 수있다는 사실입니다. 이 변화는 실험자가 특정 배아가 원심 튜브에 정렬 방식을 원심 분리 후에 정렬해야합니다. 그것이 안정적으로 그것을 할 많은 연습과 더 많은 판단을 필요로하지만 배아의 가장 밀도 부분 마커로 노른자의 autofluorescence의 사용과 함께, 이것은 종종 가능합니다. 샘플에 충분한 배아가있다면, 하나는 배아는 그림처럼 배열하는 일이있는 해당 인스턴스를 정렬하실 수 있습니다. 1. 자신의 알 껍질에서 배아의 원심 분리가 chorion 처음 2를 제거하지 않고 단계 4 한천의 배아를 포함시킬 수도 있습니다. 이 방법에서 수집 접시 배아는 할로 카본 오일 대신 단계 3.2 (할로 카본은 chorion의 투명한 세가)의 50 % 표백제 덮여있다. 해당 단계의 배아가 선택되고 핀셋을 사용하여 새 한천 플레이트로 전송되며, 핀셋, 손상만을 계란 필라멘트를 잡아서배아 적절한는 피할 수 있습니다. 배아는 앞쪽에 계란 필라멘트가 한천에있는 구멍까지 붙어서, 4.8을 통해 단계 4.4로 내장하고 있습니다. 배아가 centrifuged 및 단계 5.4에서와 같이 한천 밖으로 파고되고 난 후에 알 껍질은 50 % 표백 처리에 의해 제거됩니다. 계란 껍질의 존재에 원심 분리는 고정 후 devitellinization의 속도 (단계 6.2) 향상지만, 원심 분리에 대한 올바른 단계의 선택 (단계 4.2) 자세한 도전입니다. 애플 리케이션 특정 단백질이 특정 주요 organelle에 localizes 경우 colocalization 실험, 즉, 테스트를위한 배아의 원심 분리가 특히 유용합니다. 예를 들어, Klar 단백질이 초기 배아 지질 방울에 존재이며, 아직이 지방화는 그대로 태아에서 보여주는 도전이다. Klar puncta 및 지질 방울 모두 열심히 가짜 colocalization은 배제하고, 배아 주변 10 풍부하기 때문에 일부에서는이 있습니다. 그러나, 원심 분리는 별개의 레이어로 지질 방울을 집중하고, 따라서, Klar 신호 colocalization 10 명백한됩니다. 비슷한 분석 unambiguously 특정 histones 같은 놀라운 사례를 포함한 지질 방울 8, 13-15, 2와 단백질 ubiquitously 존재하는 경우에는 다른 단백질의 지방화를 보여주지만, 지질 방울 8 풍부했다. 배아가 발달 단계 (단계 4.2)에 의해 시각적으로 선택할 수 있듯이, 그것은 지질 방울 8, 15 단백질의 발달 규제 채용을 감지도 가능합니다. 지질 방울은 시각적으로 뚜렷한 &quot;모자&quot;에 축적 이후 지질 방울과 colocalization에 대한 테스트하는 것이 특히 쉽게, 아니 더 이상 마커 때문에 또는 얼룩이 레이어를 확인하기 위해 필요합니다. 사실, 때문에 간편하고 잠재적으로 눈에 띄는 시각적인 결과를 (그림 1, 그림 5. D, E), 우리의 실험실은 후보 단백질이 지질 방울로 지역화된 여부를 첫 번째 테스트로 지금은 정기적으로이 기술을 사용합니다. 원칙적으로 유사한 colocalization 연구 그림에 표시된 다른 organelles를 위해 작동합니다. 1, 그의 가능성 유통 centrifuged 배아에서 다른 (세포내 기생충 포함) 문서로 아직 가지고 있죠. 원심 분리가 꽉 밴드로 organelles을 집중하고 있기 때문에 이러한 organelles의 풍부한 소수의 고립을 용이하게합니다. 이 접근법은 이미 기증 배아 이식이에 대한 지질 방울을 복구하는 데 사용되었습니다. 또한 화학적으로 농축 분율 (예, 고정 15 일 이후에 배아에서 레이어를 절단하여) 분석하는 것이 가능해 질 수 있습니다. 원심 분리는 16 일 (개구리, nematodes, tunicates, annelids, 성게, mollusks, 그리고 Cnidarians 포함) 여러 종류의 달걀을 계충화하다하는 데 사용할 수있는 방법은 여기 Drosophila의 배아 이상의 응용 프로그램을 설명했다. 우리 자신의 연구실에서, 우리는 집파리 무스카 domestica 2의 태아에 대한 이상의 프로토콜을 사용하고 곰팡이 냇 Sciara coprophila 17 달팽이 Ilyanassa obsoleta 17 태아의 분석에 unoriented 원심 분리를 고용했습니다. 마지막으로,이 방법은 태아에 제한되지 않습니다 원심 분리 또한 oocytes (예 : Drosophila 2, 18 밀크 위드 버그 Oncopeltus fasciatus 17) 등 다른 대형 세포를 계충화하다에 유용할 수 있습니다. 다른 표본에 대한, 정확한 원심 분리 조건은 최적화할 필요가있다 : 예를 들어, 3,000g 10 분 효율적으로 무스카 domestica 2 배아를 계충화하다 충분한이며, 더 이상 centrifuged 경우, 태아는 고정 및 immunostaining 동안 떨어져 휴식하는 경향이있다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60x15 mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>#35-1007</td>
<td>From Falcon</td>
</tr>
<tr>
<td>Wire mesh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150</td>
<td>stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Tungsten needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10130-10</td>
<td>0.25 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26016-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fly Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific</td>
<td>59-100 or 59-101</td>
<td>For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively</td>
</tr>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8773</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in-vivo centrifugation of drosophila embryos

세포 organelles의 다른 유형의 정화 및 분리를위한 주요 전략은 낙관적인 밀도의 차이에 따라 서로에서 분리하는 것입니다. 그러나, 세포가 이전 원심 분리, 단백질이 아닌 모국어 환경에서 organelles을 방해하는 경우 종종 부적절하게 서로 붙어. 여기 우리는 그대로, 살아있는 Drosophila의 배아에서 밀도에 의해 별도의 organelles하는 방법을 설명합니다. cellularization 전에 초기 배아는 인구 케이지에서 수확하고, 자신의 외부 달걀 껍질은 50 % 표백제와 함께 치료에 의해 제거됩니다. 배아는 다음 한천의 작은 수직 구멍에 먼저 작은 한천 플레이트 및 삽입, 사후 최종으로 전송됩니다. 임베디드 배아가 포함된 플레이트는 3,000그램 30 분 centrifuged 있습니다. 한천은 배아를 지원하며 정의된 방향에서 그들을 유지합니다. 후에, 배아는 뭉툭한 바늘로 한천 밖으로 파고있다. 원심 분리는 밝은 - 필드 현미경으로 충화 쉽게 볼, 층이으로 주요 organelles를 분리합니다. 형광 마커의 숫자는 살아있는 배아의 성공 충화을 확인하실 수 있습니다. 특정 organelles와 연관된 단백질이 colocalization을 보여주는 특정 계층에 풍부한 것입니다. 개별 레이어는 기증자의 난자에 생화 학적 분석 또는 이식을위한 복구할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 종류의 계란과 oocytes 등 다른 대형 세포에 organelle 분리에 대해 적용됩니다.

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

우리 삶의 밀도에 의해 별도의 organelles하는 방법을 설명<em&gt; Drosophila</em&gt; 배아. 배아는 한천에 포함된하고 centrifuged 있습니다. 이 기법은 앞쪽에 - 후부 배아 축을 따라 주요 organelles의 재현성 분리 산출. 이 방법은 생화 학적 분석 및 이식 실험에 대한 colocalization 실험 및 수율 organelle의 분수를 용이하게합니다.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

18.3K 조회수.  University of Rochester. 우리 삶의 밀도에 의해 별도의 organelles하는 방법을 설명 Drosophila 배아. 배아는 한천에 포함된하고 centrifuged 있습니다. 이 기법은 앞쪽에 - 후부 배아 축을 따라 주요 organelles의 재현성 분리 산출. 이 방법은 생화 학적 분석 및 이식 실험에 대한 colocalization 실험 및 수율 organelle의 분수를 용이하게합니다.