Nos gustaría agradecer al Dr. S. Ressler (Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Medicina Baylor) por sugerir el uso de concentradores de proteínas para aumentar la concentración de MMP en los sobrenadantes de cultivo celular. Este proyecto fue apoyado por subvenciones del Fondo de la señora Clifford pastor White Investigación Graham Dotado y el NIH / NIAMS (AR059838) al CB. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

1. Cargar y ejecutar el Gel <ol><li> Todas las muestras deben prepararse adecuadamente para mantener la función de las enzimas y se utiliza inmediatamente después de la recolección o congelarse a -80 ° C. Las muestras no deben contener agentes reductores (por ejemplo, una β-mercaptoetanol) o ser hervida antes de cargar el gel. </li><li> Abrir la bolsa que contiene un gel interior de un cassette, el cassette de enjuague con agua destilada. <ul><li> Quitar la cinta protectora de la parte inferior de la cinta y el peine de la parte superior del gel. </li><li> Lave los pocillos tres veces con tampón de (diluida a 1X en agua destilada). </li><li> Colocar el gel en la Mini-célula, asegurando que el lado más pequeño de la cinta se enfrenta hacia el interior. Encaje en su sitio con la Cuña tensión Gel. El Mini-celular permite ejecutar uno o dos geles en paralelo. </li><li> Llene la parte superior (interior) de cámara con 1X tampón de pozos por encima del nivel, comprobar que no existen fugas. En caso de fugas, quitar el tampón y la posición del gel. </li><li> Llenar la cámara baja con amortiguador 1X en funcionamiento. </li></ul></li><li> Carga de 10 l de marcador molecular de la proteína en un pozo. <ul><li> Mezcle una cantidad igual de buffer de gel de carga y de la muestra y la carga en los pocillos del gel con carga de gel-tips (cambia entre cada muestra). Estos pozos se puede cargar con hasta 20 l totales. </li></ul></li><li> Coloque la tapa de la célula de Mini y conectar los cables de los electrodos a la fuente de alimentación. Interruptor de la fuente de alimentación y lo puso a correr a 125 V constantes durante 90 minutos. Compruebe la formación de pequeñas burbujas en el cable de la cámara baja, lo que indica la circulación actual. </li><li> Cuando se ejecuta el primer gel, monitorear el progreso de la migración cada 15 minutos, utilizando el azul de bromofenol incluido en el tampón de carga como un indicador. Deje correr el gel hasta que el colorante indicador alcanza el fondo del gel. </li></ol> 2. Renaturalización y desarrollo del Gel <ol><li> Para cada gel, preparar 100 ml de 1X buffer de renaturalización y 200 ml de tampón de desnaturalización, tanto en agua destilada. </li><li> Cuando el colorante azul de bromofenol seguimiento llega a la parte inferior del gel, cambiar la fuente de alimentación, abra la celda Mini-, y quitar el gel. Separar los dos lados de la cinta con el cuchillo en gel (o una espátula de pesaje). Corte una esquina para marcar la dirección del gel. </li><li> Retire con cuidado el gel de la bandeja y coloque en un envase de 100 ml de tampón de renaturalización. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Eliminar el buffer de renaturalización y añadir 100 ml de buffer en el desarrollo de gel. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Quitar el tampón en desarrollo y añadir 100 ml de solución tampón más desarrollo para el gel. Incubar toda la noche (16-18 horas) a 37 ° C. </li><li> Quitar el tampón en desarrollo y enjuáguese la boca tres veces (5 minutos cada uno) con agua destilada bajo agitación suave a temperatura ambiente. </li><li> Escanear el gel para guardar la posición exacta de las bandas de proteínas estándar, ya que serán menos visibles o no después de la tinción del gel. </li><li> Tinción del gel mediante la adición de 20 ml de SimplyBlue Safestain al gel. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Retire la SafeStain SimplyBlue y de la mancha de gel de 100 ml o más agua desionizada durante una hora a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li><li> Para obtener mejores resultados, reemplace con agua fresca desionizada y se incuba durante una hora o más a temperatura ambiente bajo agitación suave. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Retire con cuidado el gel del agua y colóquelo en un protector de plástico. </li><li> Escanear el gel con una resolución de 300 ppp o más. Guardar la imagen en formato TIFF (Figura 1). </li><li> Medir intensidades de las bandas con ImageJ (u otro software similar). <ul><li> Abra el archivo TIFF en ImageJ (Figura 1). </li><li> Visualizar en blanco y negro seleccionando la opción &quot;Imagen&gt;&gt; Tipo de 8 bits&quot; (fig. 1B). </li><li> Use la herramienta de selección rectangular para delinear la primera banda, dibujando un rectángulo al menos dos veces más alta que ancha (esto es un requisito de software). </li><li> Presione &quot;1&quot; o seleccione &quot;Analizar&gt; Geles&gt; Elige primero el carril&quot; y la banda se indica. </li><li> Un rectángulo de nuevo aparecen, se mueven a la banda y seleccionar &quot;Análisis&gt; Geles&gt; Seleccione carril que viene&quot;. Repita hasta que todas las bandas son seleccionados (fig. 1B). </li><li> Presione &quot;3&quot; o seleccione &quot;Analizar&gt; Geles&gt; carriles Plot&quot; para generar el gráfico de perfil para cada banda (fig. 1C). </li><li> Utilice la selección de línea recta (ya debe estar seleccionado automáticamente) para dibujar las líneas de base, de modo que el pico de interés es un área completamente cerrada. </li><li> Seleccione la herramienta varita mágica y haga clic en el interior de cada pico para seleccionarlo. </li><li> Seleccione &quot;Analizar&gt; Geles&gt; picos Label&quot; para obtener una tabla con el área de cada pico seleccionado. Estos datos se pueden representar como tales (Figura 1D) o puede ser normalizada con el valor de una banda elegida. Esta normalización es especialmente importante cuando se agruparon los valores de varios geles replicar para determinar la significación estadística de los resultados. </li></ul></li></ol> 4. Resultados representante Se muestra un gel con 11 pozos cargados con diferentes sobrenadantes de cultivo de células que contienen diferentes cantidades de MMP-2 (Figura 1). La observación directa de este gel muestran diferencias obvias en las concentraciones de MMP-2 entre algunos de los pozos. Por ejemplo, está claro que los pozos 4 y 5 contienen mucho más que la MMP-2 y # 11, o bien hasta 10 #. Para la cuantificación objetiva de las bandas que han utilizado la densitometría con el software ImageJ (Figura 1B-D), lo que confirma una diferencia de aproximadamente 4 veces en la MMP-2 entre las cantidades y # 11 y los pozos 4 y 5 y una diferencia de aproximadamente 2 veces en MMP-2 entre las cantidades y # 10 y # pozos 4 y 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Detección de MMP-2 por zymography gelatina. Una imagen, escaneada de un gel de gelatina. Números también se indican en la parte superior del gel. B, gel Igual que en una muestra en blanco y negro de la densitometría. Cada grupo fue seleccionado con un rectángulo en ImageJ. C, dos ejemplos de los perfiles de la densitometría para el gel mostrado en A y B (bandas # 4 y # 11). Una línea recta que se elaboró ​​en la base de cada pico para crear un área cerrada. D, Parcela de las áreas de pico para el gel mostrado en A y B antes (izquierda) y después (derecha) la normalización de la densidad de la banda # 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esta cifra demuestra cómo zymography se puede utilizar como una técnica semi-cuantitativo. Hemos cargado diluciones seriadas (pasos de 1:01 diluciones) en 7 pozos consecutivos y se mide la densidad de banda para los pro-MMP-2 y MMP-2.

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

Hemos demostrado cómo realizar el análisis zimográfico de MMP-2 en el sobrenadante de cultivo celular. La cantidad de muestra a la carga en un gel debe ser determinada empíricamente en función del origen y MMP de interés. Carga demasiado poco evitar su detección durante la carga en exceso puede conducir a la saturación, ya que es único sustrato tanto una proteasa pueden digerir en el área de la banda. Si es necesario, la muestra se puede diluir en agua desionizada antes de mezclarse con tampón de carga o el tiempo de desarrollo puede reducirse de la noche a 4 horas. También es posible concentrar las proteínas de una solución a base de concentradores (por ejemplo, catálogo Millipore # UFC803024). Si las bandas siguen siendo apenas visible, puede ser necesario el desarrollo de los geles durante un largo periodo de tiempo, incluso hasta 48 horas. En la preparación de las muestras de los sobrenadantes de cultivo de tejidos, cabe señalar que el suero fetal bovino (y otros sueros) contiene MMPs que pueden afectar los resultados. Por esta razón, recogemos todas nuestras sobrenadantes después de la cultura en el medio libre de suero. Los lavados se describe en los párrafos 2.9 y 2.10 del protocolo es necesario para eliminar el fondo de tinción de las bandas de digerir. Veces más tiempo de lavado se eliminan más de fondo, pero se atenúa también la coloración del sustrato a través del gel. Si ya los tiempos de lavado son necesarias, se recomienda escanear el gel a cada rato para seleccionar el escaneo con el mejor contraste. Esta técnica puede utilizarse para detectar otras MMP. Por ejemplo, la MMP-9 puede ser detectada en geles de gelatina, y también en menor medida MMP-1, MMP-8 y MMP-13 como la gelatina no es el sustrato preferido. MMP-1 y MMP-13 se detecta más fácilmente en zimografía colágeno, mientras que la caseína es el sustrato preferido para la MMP-11 y también permite la detección de MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, y MMP-13 9. MMP-7 (matrilisina) y colagenasas (MMP-1 y MMP-13) son difíciles de detectar cuando están presentes en bajas concentraciones en caseína o geles de gelatina. Además de la heparina a la muestra en el momento de carga de gel mejora significativamente el límite de detección de MMP-7. De MMP-1 y MMP-13, la heparina se debe agregar el gel después de la electroforesis ya está en marcha 12. Dado que las medidas de zymography actividad enzimática después de la desnaturalización y renaturalización de las enzimas, se medirá la actividad de todas las MMPs presente en la muestra. Esto incluye las enzimas, las enzimas pro-, y enzimas ligadas a los inhibidores endógenos (por ejemplo, TIMP-2). Sin embargo, es posible determinar el nivel de activación de MMP en la muestra mediante la comparación de la densidad de banda de la enzima activa y de la de la pro-enzima, que tendrá un peso molecular ligeramente superior. Zymography a menudo no es suficiente para identificar un MMP. Comparación del nivel de migración de un sistema de RPP con estándares de peso molecular conocido le ayuda en la identificación, pero hay que señalar que algunas de estas normas contienen un agente reductor y que cuando se usa bajo condiciones no reductoras pueden indicar diferentes pesos moleculares 9. Una opción es cargar una MMP recombinante soluble en el mismo gel, como las muestras de prueba. MMPs sin embargo puede estar asociada con otras proteínas, induciendo un cambio en el peso molecular aparente. Los inhibidores selectivos de MMP se pueden añadir al gel (o parte de un recorte en gel por la mitad) durante la incubación en buffer de desarrollo como herramientas farmacológicas para la identidad de la MMP de la técnica interest.A segundo (Western Blot, inmunocitoquímica, o ELISA) se recomienda ayudar en la identificación de la MMP de interés. Cabe señalar que los límites de detección por Western Blot son a menudo mucho más bajos que los de los geles de zimográfico, que puede conducir a resultados falsos negativos cuando se utiliza esta técnica.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

Metaloproteinasas de matriz (MMP) son endopeptidasas que contienen zinc. Se degradan las proteínas de la escisión de los enlaces peptídicos. Más de una veintena de MMPs han sido identificados y se dividen en seis grupos según su estructura y especificidad de sustrato (colagenasas, gelatinasas, tipo de membrana [MT-MMP], estromelisinas, matrilysins, y otros). MMP juegan un papel crítico en la invasión celular, la degradación del cartílago, la remodelación de tejidos, la cicatrización de heridas, y la embriogénesis. Por lo tanto, participar en los procesos normales y en la patogénesis de muchas enfermedades, como la artritis reumatoide, cáncer o enfermedad pulmonar obstructiva crónica 1-6. Aquí, nos centraremos en la MMP-2 (gelatinasa A, colagenasa tipo IV), una MMP ampliamente expresada. Vamos a demostrar cómo detectar MMP-2 en los sobrenadantes de cultivo celular por zymography, uno de uso común, técnica simple, pero muy sensible describió por primera vez en 1980 por C. Heussen y EB 10.7 Dowdle. Esta técnica es semi-cuantitativo, por lo tanto, se puede utilizar para determinar los niveles de MMP en las muestras cuando las concentraciones conocidas de MMP recombinante se cargan en el mismo gel 11. Las soluciones que contienen MMPs (por ejemplo, sobrenadantes de cultivo celular, la orina o el suero) se cargan en un gel de poliacrilamida que contiene dodecil sulfato sódico (SDS, para linealizar las proteínas) y gelatina (sustrato de la MMP-2). El tampón de la muestra está diseñada para aumentar la viscosidad de la muestra (para facilitar la carga de gel), proporcionan un medio de seguimiento (azul de bromofenol, para controlar la migración de la muestra), proporcionan moléculas de desnaturalización (para linealizar las proteínas), y controlar el pH de la muestra. Las proteínas se dejan de migrar en una corriente eléctrica en un tampón de diseñado para proporcionar una tasa de migración constante. La distancia de la migración está inversamente correlacionado con el peso molecular de la proteína (proteínas pequeñas se mueven más rápido a través del gel de proteínas de gran tamaño y por lo tanto no migran más por el gel). Después de la migración, el gel se coloca en un buffer de renaturalización de las proteínas permiten a recuperar su estructura terciaria, es necesario para la actividad enzimática. El gel se coloca en un búfer de desarrollo diseñado para permitir la proteasa para digerir su sustrato. El tampón de desarrollo también contiene p-aminophenylmercuric acetato (APMA) para activar el no proteolíticas pro-MMP a MMP activas. El siguiente paso consiste en teñir el sustrato (la gelatina en nuestro ejemplo). Después de lavar el exceso de tinte el gel, las áreas de la digestión de la proteasa aparecen como bandas claras. La más clara de la banda, la mayor concentración de la proteasa que contiene. Intensidad de la banda de tinción puede ser determinada por densitometría, utilizando un software como ImageJ, que permite la comparación de la muestra.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography at JoVE.com

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Este protocolo describe un ensayo basado en actividades para la detección de metaloproteinasas de la matriz en sobrenadantes de cultivo o los fluidos corporales.

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

83.5K vistas.  Baylor College of Medicine. Este protocolo describe un ensayo basado en actividades para la detección de metaloproteinasas de la matriz en sobrenadantes de cultivo o los fluidos corporales.

Video: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Investigación

Biología

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

La detección de vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.