ברצוננו להודות לד&quot;ר ס &#39;רסלר (המחלקה לביולוגיה מולקולרית תאית, ביילור לרפואה) עבור מציע את השימוש של ריכוז החלבון כדי להגביר את ריכוז MMPs ב supernatants תרבית תאים. פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מקרן קליפורד הגברת אלדר גרהם הלבן מחקר נתרמו ואת NIAMS NIH / (AR059838) ל CB. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIH.

1. טוען והפעלה של ג&#39;ל האלו ורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הדגימות חייב להיות מוכן כראוי כדי לשמור על תפקוד האנזימים בשימוש מיד לאחר איסוף או מאוחסנים קפוא ב -80 ° C. דוגמאות לא חייב להכיל סוכני צמצום (כגון β-mercaptoethanol) או להרתיח לפני טעינת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שקיק המכיל ג&#39;ל בתוך קלטת, יש לשטוף את הקלטת עם מים deionized. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט המגן מהחלק התחתון של הקלטת ואת מסרק מהחלק העליון של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים בארות עם חיץ ריצה (מדולל במים כדי 1X deionized). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל לתוך תא ה-Mini-, להבטיח כי הצד קטן יותר של קלטת הפנים פנימה. נעל למקום עם וודג את המתח ג&#39;ל. ה-Mini-Cell מאפשרת להריץ אחד או שניים ג&#39;לים במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר העליון (בפנים) עם חיץ 1X פועל מעל פני בארות, לבדוק אם קיימת דליפה כלשהי. במקרה של דליפה, להסיר את החיץ למקם את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר התחתון עם חיץ 1X פועל. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μL של חלבון סמן מולקולרי אחד טוב. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמות שווה של חיץ ג&#39;ל העמסה של מדגם לטעון לתוך הבארות של ג&#39;ל בעזרת ג&#39;ל טעינת טיפים (השתנה בין כל דגימה). בארות אלה יכולים להיות עמוסים עד לסך 20 μL. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכסה על תא ה-Mini-ולחבר את מיתרי אלקטרודה לאספקת חשמל. החלף את אספקת החשמל על ולהגדיר אותו לרוץ 125 V קבוע במשך 90 דקות. בדוק את היווצרות של בועות קטנות על חוט של החדר התחתון, המציין במחזור הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הרצת הג&#39;ל הראשון שלך, לעקוב אחר ההתקדמות של הגירה כל 15 דקות, באמצעות כחול bromophenol כלול למאגר טעינת אינדיקטור. תנו לרוץ ג&#39;ל עד צבע אינדיקטור מגיע לתחתית הג&#39;ל. </li></ol> 2. Renaturing ופיתוח ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ג&#39;ל, להכין 100 מ&quot;ל של חיץ 1X renaturing ו -200 מ&quot;ל של denaturing חיץ, הן מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צבע bromophenol מעקב כחול מגיע לתחתית הג&#39;ל, לעבור את אספקת החשמל כבוי, לפתוח את תא מיני, ולהסיר את הג&#39;ל. הפרד את שני הצדדים של הקלטת באמצעות סכין ג&#39;ל (או מרית במשקל). גזור פינה כדי לסמן כיוון של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את הג&#39;ל מתוך קלטת והמקום לתוך מיכל עם חיץ renaturing 100 מ&quot;ל. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ renaturing ולהוסיף 100 מ&quot;ל של פיתוח המאגר על הג&#39;ל. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ בפיתוח להוסיף 100 מ&quot;ל יותר חיץ מתפתחות הג&#39;ל. דגירה לילה (16-18 שעות) בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ בפיתוח לשטוף שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) עם מים deionized תחת תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל להציל את המיקום המדויק של להקות תקן חלבון כפי שהם יהיו פחות או אינם גלויים לאחר צביעת הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל על ידי הוספת 20 מ&quot;ל של SimplyBlue Safestain על הג&#39;ל. דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את SafeStain SimplyBlue ו-de הכתם ג&#39;ל 100 מ&quot;ל מים או deionized יותר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות טובות יותר, להחליף מים deionized דגירה טרי עוד שעה או יותר בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את הג&#39;ל מהמים ומניחים מגן יריעת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל עם רזולוציה של 300 dpi ומעלה. שמור את התמונה בפורמט TIFF (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת עוצמות הלהקה עם ImageJ (או תוכנה דומה אחרת). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ TIFF ב ImageJ (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו בשחור לבן על ידי בחירת &quot;תמונה&gt; סוג&gt; 8 סיביות&quot; (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי בחירה מלבני מתאר את הלהקה הראשונה, ציור מלבן לפחות פעמיים גבוה יותר מאשר זה הוא רחב (זוהי דרישה תוכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש &quot;1&quot; או לבחור &quot;נתח&gt; ג&#39;ל&gt; בחר מסלול ראשון&quot; הלהקה יפורטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלבן חדש יופיע, להעביר אותה הלהקה בא ונבחר &quot;נתח&gt; ג&#39;ל&gt; בחר בנתיב הבא&quot;. חזור על הפעולה עד שכל הלהקות שנבחרו (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על &quot;3&quot; או לבחור &quot;נתח&gt; ג&#39;ל&gt; נתיבי מגרש&quot; כדי ליצור את העלילה פרופיל עבור כל הלהקה (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הבחירה בקו ישר (צריך להיות כבר נבחר אוטומטית) כדי לצייר קווים בסיס כך שיא של עניין הוא אזור סגור לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בכלי מטה ולחץ בתוך כל שיא כדי לבחור בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;נתח&gt; ג&#39;ל&gt; פסגות לייבל&quot; להשיג שולחן עם אזור השיא עבור כל נבחרת. נתונים אלה ניתן להתוות ככזה (F1D igure) או יכול להיות מנורמל לערך של הלהקה שנבחר. נורמליזציה זה חשוב במיוחד כאשר איחוד ערכים ג&#39;לים לשכפל מספר כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית של התוצאות. </li></ul></li></ol> 4. נציג תוצאות אנחנו מראים ג&#39;ל עם 11 בארות עמוסה שונה תרבות supernatants התא המכיל כמויות שונות של MMP-2 (איור 1 א). תצפית ישירה של ג&#39;ל זה מראה הבדלים ברורים MMP-2 ריכוזים בין כמה בארות. לדוגמה, ברור כי בארות # 4 ו -5 מכילים הרבה יותר MMP-2 # 11 טוב יותר, או אפילו טוב # 10. עבור כימות אובייקטיבי של להקות השתמשנו צפיפות עם התוכנה ImageJ (איור 1B-D), המאשר את ההבדל כ -4 של פי MMP-2 כמויות בין טוב # 11 ובארות # 4 ו 5 ו כ -2 הפרש של פי MMP-2 כמויות בין טוב # 10 ובארות # 4 ו -5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. איתור של MMP-2 על ידי zymography ג&#39;לטין. התמונה, סרוקות של ג&#39;ל ג&#39;לטין. ובכן המספרים מצוינים בחלק העליון של הג&#39;ל. B, ג&#39;ל זהה המוצג בשחור לבן של צפיפות. הלהקה נבחרה עם כל מלבן ב ImageJ. C, שתי דוגמאות של פרופילים עבור צפיפות ג&#39;ל המוצג A ו-B (להקות # 4 ו - # 11). קו ישר נמשך בבסיס שיא כל ליצור שטח סגור. ד &#39;, מגרש האזורים השיא ג&#39;ל המוצג נורמליזציה A ו-B (מימין) לפני (משמאל) לאחר לצפיפות של הלהקה מס&#39; 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. נתון זה מדגים כיצד zymography יכול לשמש טכניקה וכמותיות. יש לנו טעון דילולים סדרתי (מדרגות 01:01 דילולים) ב -7 בארות רצופים מדדו את צפיפות הלהקה הן הפרו MMP-2 ו - MMP-2.

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו הדגימו כיצד לבצע ניתוח zymographic של MMP-2 ב supernatants תרבית תאים. כמות המדגם כדי לטעון את הג&#39;ל צריכה להיקבע באופן אמפירי בהתאם למקור ו MMP ​​של עניין. טעינת מעט מדי ימנע גילוי בעת טעינת מדי עלול להוביל הרוויה כפי שיש כל כך הרבה רק המצע פרוטאז יכולים לעכל באזור של הלהקה. במידת הצורך, את המדגם יכול להיות מדולל במים deionized לפני ערבוב עם חיץ העמסה או הזמן לפתח יכולות מופחת דה מן לילה עד 4 שעות. אפשר גם לרכז חלבונים בתמיסה באמצעות ריכוז (למשל קטלוג Millipore # UFC803024). אם להקות להישאר בקושי נראה, זה עשוי להיות נחוץ כדי לפתח את הג&#39;לים לתקופה ארוכה של זמן, אפילו עד 48 שעות. בעת הכנת דגימות supernatants בתרבית רקמה, יש לציין כי בסרום שור העובר (וסרה אחרים) מכיל MMPs שיכולים להשפיע על התוצאות. מסיבה זו, אנו אוספים את כל supernatants שלנו לאחר התרבות בינוני בסרום חינם. שוטף המתוארים בסעיפים 2.9 ו - 2.10 של פרוטוקול נחוצים כדי להסיר את הרקע מכתים של להקות מעוכל. פעמים לשטוף ארוכים תסיר את הרקע יותר, אבל יהיו גם כתמים עמומים של המצע לאורך הג&#39;ל. אם כבר לשטוף פעמים יש צורך, מומלץ לסרוק את הג&#39;ל כל כמה שעות כדי לבחור את הסריקה עם ניגודיות את הטוב ביותר. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות MMPs אחרים. לדוגמה, MMP-9 ניתן להבחין על ג&#39;לים ג&#39;לטין, וגם במידה נמוכה MMP-1, MMP-8, ו - MMP-13 כמו ג&#39;לטין אינו המצע המועדף עליהם. MMP-1 ו - MMP-13 מזוהים הטוב ביותר zymography קולגן תוך קזאין הוא המצע המועדף MMP-11 וגם מאפשר זיהוי של MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, ו - MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) ו collagenases (MMP-1 ו - MMP-13) קשה לזהות כאשר נוכח רמות נמוכות של קזאין או ג&#39;לים ג&#39;לטין. תוספת של הפרין המדגם בזמן הטעינה ג&#39;ל משפר באופן משמעותי את גבול הגילוי של MMP-7. עבור MMP-1 ו-MMP-13, הפרין צריך להוסיף ג&#39;ל לאחר ריצה electrophoretic כבר בעיצומן 12. מאז zymography אמצעים הפעילות האנזימטית לאחר denaturation ו renaturation של אנזימים, זה יהיה למדוד את הפעילות של כל MMPs הנוכחית במדגם. זה כולל אנזימים, הפרו אנזימים, ואנזימים חייב מעכבי אנדוגני (למשל TIMP-2). זה אפשרי אך כדי לקבוע את רמת ההפעלה MMP במדגם על ידי השוואת צפיפות הלהקה של האנזים פעיל מזה של הפרו האנזים, אשר יהיה בעל משקל מולקולרי גבוה מעט יותר. Zymography הוא לעתים קרובות לא מספיק כדי לזהות MMP. השוואה של רמת ההגירה של MMP עם ידוע סטנדרטים משקל מולקולרי עוזר בזיהוי אך יש לציין כי חלק תקנים אלה מכילים סוכן צמצום וכי כאשר נעשה שימוש תחת אי - הפחתת התנאים הם עשויים להצביע משקולות מולקולריים שונים 9. אופציה היא לטעון MMP מסיס רקומביננטי על ג&#39;ל זהה דגימות הבדיקה. MMPs עשויה להיות קשורה אך עם חלבונים אחרים, גרימת שינוי משקל מולקולרי לעין. מעכבי MMP סלקטיבי ניתן להוסיף ג&#39;ל (או חלק לחתוך ג&#39;ל במחצית) במהלך הדגירה של חיץ ככלים לפיתוח תרופתי זהות MMP של הטכניקה interest.A השני (המערבי כתם, immunocytochemistry, או ELISA) מומלץ עזרה בזיהוי של MMP של עניין. יצוין, כי מגבלות זיהוי כתמים המערבי הם לעתים קרובות נמוכים בהרבה מאלה של ג&#39;לים zymographic, שעלול כדי שווא שלילי תוצאות בעת שימוש בטכניקה זו.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

Metalloproteinases מטריקס (MMPs) הם אבץ המכיל endopeptidases. הם לבזות חלבונים על ידי המחשוף של אג&quot;ח פפטיד. יותר מעשרים MMPs זוהו מופרדות לשש קבוצות על בסיס המבנה שלהם ואת המצע סגוליות (collagenases, gelatinases, סוג קרום [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, ואחרים). MMPs לשחק תפקיד קריטי בפלישה התא, השפלה סחוס, שיפוץ רקמות, ריפוי פצעים, ועל העובר. לכן הם להשתתף בשני תהליכים נורמליים בפתוגנזה של מחלות רבות, כגון דלקת מפרקים שגרונית סרטן, או מחלת ריאות חסימתית כרונית 1-6. כאן נתמקד MMP-2 (gelatinase, סוג IV collagenase), MMP ביטוי נרחב. אנו מדגימים כיצד לזהות MMP-2 ב supernatants תרבית תאים על ידי zymography, נפוץ, טכניקה פשוטה, ובכל זאת מאוד רגיש שתוארה לראשונה על ידי ג Heussen ו EB דאודל 7-10 בשנת 1980. טכניקה זו היא חצי כמותית, ולכן הוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות MMP בדגימות מבחן כאשר הריכוזים הידועים של MMP רקומביננטי נטענים על ג&#39;ל אותו 11. פתרונות המכיל MMPs (למשל תרבית תאים supernatants, שתן, או בסרום) נטענים ג&#39;ל polyacrylamide המכיל נתרן גופרתי dodecyl (SDS, כדי linearize את החלבונים) ו ג&#39;לטין (המצע של MMP-2). חיץ מדגם נועד להגביר צמיגות מדגם (כדי להקל על טעינת ג&#39;ל), לספק צבע מעקב (כחול bromophenol; לפקח הגירה לדוגמה), לספק מולקולות denaturing (עד linearize חלבונים), וכן לשלוט על ה-pH של המדגם. חלבונים מותר אז להעביר תחת זרם חשמלי במאגר ריצה נועד לספק קצב העברה קבוע. המרחק של הגירה היא בקורלציה הפוכה עם משקל מולקולרי של החלבון (חלבונים קטנים לנוע מהר יותר מאשר באמצעות ג&#39;ל חלבונים גדולים לעשות ולכן להגר בהמשך הג&#39;ל). לאחר ההגירה, הג&#39;ל מושם חיץ renaturing לאפשר חלבונים להחזיר מבנה שלישוני שלהם, הדרושים הפעילות האנזימטית. הג&#39;ל מושם אז חיץ בפיתוח נועד לאפשר פרוטאז לעכל את המצע שלה. המאגר מכיל גם בפיתוח p-aminophenylmercuric אצטט (APMA) כדי להפעיל את הלא proteolytic הפרו MMPs לתוך MMPs פעיל. הצעד הבא מורכב מכתים את המצע (ג&#39;לטין בדוגמה שלנו). לאחר שטיפת צבע עודף את הג&#39;ל, תחומי העיכול פרוטאז יופיעו להקות ברור. ברור הלהקה, מרוכז יותר פרוטאז שהוא מכיל. מכתים עוצמת בנד אז יכול להיות נקבע על פי צפיפות, באמצעות תוכנה כגון ImageJ, המאפשרות השוואה המדגם.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography at JoVE.com

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

פרוטוקול זה מתאר assay פעילות מבוססי לאיתור metalloproteinases מטריקס supernatants תרבות או נוזלי גוף.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

83.6K Views.  Baylor College of Medicine. פרוטוקול זה מתאר assay פעילות מבוססי לאיתור metalloproteinases מטריקס supernatants תרבות או נוזלי גוף.

Video: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video