Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri, Kanada, British Columbia Merkezi Üniversitesi İnovasyon, Kan Araştırma ve Kuzey M.Ö. Üniversitesi Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

1. Reaktif Hazırlama <ol><li> Deney boyunca kullanılacak Reaktifler cerrahi protokolü başlamadan önce hazırlanmalıdır. Tüm çözümler, steril tekniği kullanılarak yapıldı. </li><li> Serum fizyolojik solüsyonu (PSS) en iyi iki bileşenden hazırlanır: temel tuz solüsyonu ve sodyum bikarbonat çözeltisi. 20X konsantrasyon ve mağaza 4 ° C hem de çözümleri hazırlayın 20X az sodyum bikarbonat 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) ve 20X konsantrasyonu temel tuz çözeltisi 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) ve 23,4 MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Çözüm sonraki kimyasal ekleyerek önce netleşene kadar Çözümler, bir defada bir eklenmelidir dH 2 O ve kimyasallar hazırlanır ve karıştırılır olmalıdır </li><li> Sodyum bikarbonat ve temel tuz çözeltisi eşit hacimlerde seyreltilmesi ve konsantrasyonu 1X (dH 2 O her sodyum bikarbonat ve temel tuz çözeltisi iki PSS 2L seyreltik 100 ml için seyreltilmesi PSS 2L hazırlayın </li><li> Yeri 2L ölçülü balona PSS ve PSS içeren 37 ° C su banyosu. Cerrahi işlem başlatmak için önce 1hr için 5% CO 2 / denge azot gazı ile çözüm dengelenmesi. </li><li> Vazoaktif kimyasallar (örneğin Fenilefrin, asetilkolin, sodyum nitroprussid) -20 ° C&#39;de dH2O 1M konsantrasyonu en iyi hazırlanmış ve 100μl alikotları depolanan </li></ol> 2. Hayvan Hazırlık <ol><li> Farenin ağırlığını belirlemek ve intraperitoneal 90mg/kg pentobarbital sodyum başlangıç ​​dozu yönetmek. Prosedürü boyunca fare anestezi uçak için, ayak tutam ve solunum hızı dikkatli muayenesi ile sürekli izlenir. Pentobarbital sodyum Ek enjeksiyonları 20mg/kg anestezi düzlemde korumak için gerektiği şekilde uygulanmalıdır. Kuzey M.Ö. Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanan hayvan bakımı protokolde belirtildiği gibi anestezi cerrahi düzlemine federal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak korunur. </li><li> Saç tıraş makinesi ile karın ve böğür / kalça bölgesi çıkarın. Alkollü bez gevşek saç kalan alan ve bant ile okşamaya çıkarın. Bu deneysel işlem terminali olarak yeterlidir. </li><li> Yatar pozisyonda net bir cerrahi kurulu fare yerleştirin ve yönetim kurulu her Kapkaççı taping kuruluna fare takmak. Vücut sıcaklığı, harici bir ısı lambası ile korunur ve bu hipotermi anestezik bir sonucu olarak ortaya çıkmaz sağlamak için rektal termometre ile takip edilir. </li></ol> 3. Cerrahi Prosedür <ol><li> Tüm cerrahi işlem sırasında maruz kalan doku dengelenmiş ısıtılmış PSS çözümü ile her zaman superfused tutulur emin olun. Çevrelerindeki yağ dokusu ve bağ dokusu manipüle ederek onlara çok kuvvet koyarak ilgi damar cerrahi aletler ile temas veya damarlarının zarar hiç de önemlidir. </li><li> Diseksiyon kapsamında fare yerleştirin. Karın boşluğunun ventral orta hat boyunca bir kesi yapın ve farenin spinal kolon doğru cilt geri çekin. </li><li> LN deride kolaylıkla görülebilir, böylece geri çekilene sonra, şeffaf Sylgard 184 bir kaide üzerine cilt pin. </li><li> LN çevresindeki alan kaplanacağı bağ dokusu ince bir tabaka çıkarın </li><li> Adipoz doku kaplanacağı temizleyin ve mikrovasküler yatakta maruz kadar lenf nodu çevreleyen. Ana arter segment LN bitişik bırakır ve yaygın venule tarafından yerleştirilmiştir. Tüm cerrahi, yaklaşık 30 dakika sürer. </li></ol> 4. Görüntüleme ve Damar Analizi <ol><li> Diseksiyon kapsamında ilgi damar segment ortaya çıktığında, intravital mikroskop hazırlık güvenli. Hayvan deney süresi boyunca intravital mikroskop sırasında açık cerrahi gemide kaldığını unutmayın. Cerrahi bölümünde sırasında açıklandığı gibi, vücut ısısı, ısı lambası ile korunur ve rektal termometre ile ölçülür. Bölüm 2.1 &#39;de anlatıldığı gibi anestezi düzlemde de deney boyunca izlenir. </li><li> Superfusion ve emiş hatları ayarlayın. PSS Superfusion% 5 CO 2 dengeli azot ile perfüze olan su ceketi ısıtmalı rezervuar (su ceketi dolaşan su banyosunda dolaşan ve ısıtmalı), 10ml bir oranında bir damla satır aşağı, bir rezervuar gravite besleme ile gerçekleşir / dak. Emiş hattı, hazırlık uzak superfused PSS çekin devam etmek için kullanılmalıdır. Not deney emiş hatları ve su ceketi önce iyice temizlenmeli ve her bir deney sonrası saklanan. Bu sonraki deneyde önce sterilite sağlar. </li><li> Superfusing PSS sıcaklığını kontrol edin. Sıcaklığı ayarlayın~ 37 ° C hazırlık çapında bir sıcaklık elde etmek için su banyosu ve / veya PSS superfusion oranı dolaşan. </li><li> Damarsal en az 60 dakika süreyle PSS ile dengelenmesi ve video kumpas kullanarak damar çapı ölçmek için izin verin. Tipik olarak, damar çapı, damar stabilize sağlamak için (örneğin, 40, 50, ve 60 dakika) birden fazla noktada tespit edilmelidir. </li><li> Damar düz kas spesifik agonist (örn. Fenilefrin, PE) ve endotel spesifik agonist (örneğin asetilkolin, ACh) kullanarak sağlık değerlendirin. Agonist konsantrasyonu agonist bağlı olarak ayarlanabilir olmalıdır, ancak PE ve Ach gemi superfusate (10 9A 10-5M) kümülatif Ayrıca her konsantrasyonda değerlendirilmelidir. Her agonisti uygulaması gemi dinlenme çapı dönene kadar PSS kullanılarak yıkama aşamasında (genellikle 30 dakika) ayrılmalıdır. </li><li> Gemi sağlık izleme deneyler, sonraki vazoaktif ilaçlar, floresan etiketleme ve hücre aşağıdaki değerlendirme yapılabilir. </li><li> Deneyin sonunda hayvan pentobarbital sodyum aşırı dozda verilir. Hayvan, sonra ayak tutam ve kalp atışı, solunum hareketi veya olmaması için hiçbir yanıt var olduğundan emin olmak için takip edilmektedir. Böyle bir zamanda bu servikal dislokasyon tarafından takip edilmektedir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Dengelenme döneminin ardından hazırlık, arteriol ve kasık lenf nodu sağlayan venule hem belirlenmesi için izin veren bir net bir görüntü elde edilmelidir. Minimum yağ hücreleri arteriol ve damar çapını hesaplamak için üst üste video kaliperler için açıkça gözlenebilir venule duvarları olanak sağlamak için damarları çevreleyen olmamalıdır. Başarılı bir hazırlık ayrılmaz noktası arteriyol lümen yoluyla ve vasküler sesi önemli ölçüde (yani arteriyol vasoconstrict ve sırasıyla düz kas ve endotel özel agonistleri vasodilate yeteneğine sahiptir) olduğunu hareket kan zengin bir ürün yelpazesine sahiptir. . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1, lenf nodu, fizyolojik tuzlu su solüsyonu ve yan boyunca ana venule (yeşil ok) çalıştıran ile dengelenmiş beslenme kasık lenf nodu besleme arteriyol (kırmızı ok) intravital mikroskopi görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 kümülatif Ayrıca serum fizyolojik konsantrasyonları superfused fenilefrin (PE) Normal vazoaktif yanıt 10 -9 M 10 M. -5 Sağlam bir vazokonstriksiyon varlığı arteriyol normal düz kas fonksiyonu düşündüren. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3 konsantrasyonları serum fizyolojik kümülatif Ayrıca superfused asetilkolin (Ach) Normal vazoaktif yanıt 10 -9 M 10 M. -5 Sağlam bir vazodilatasyon arteriyol normal endotelyal fonksiyon mevcut varlığını düşündürür.

<ol>
	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

Burada sunulan inguinal lenf nodu intravital mikroskopi lenf nodu in vivo görüntü mikrodolaşımını yeteneği sağlar. Bu nedenle, doğrudan, gerçek zamanlı gözlem aracı kolaylaştırır. LN mikrodolaşımını Görüntüleme bir immün yanıt ve damarsal arasındaki arayüz çalışma sağlayan benzersiz bir site. Bu preparatın kullanarak, bağışıklık yanıtı, damarsal değişiklikler, ya da ikisi arasındaki etkileşimi odak özellikle yönlendirilmiş olabilir. Tüm deneysel yaklaşımlar olduğu gibi, standart intravital mikroskopi hem avantajları ve sınırlamaları vardır. Hazırlanması burada açıklandığı gibi Standart IVM, kolayca değiştirilebilir, ve daha önce, tanıtım veya floresan tracer boyalar etiketli hücre popülasyonlarının üzerinden epifluorescent mikroskobu izin yazarlar tarafından ortaya konmuştur. Standart IVM, üç boyutlu görüntüleme olanağı vermek ve iki foton mikroskopi veya anjiyografi ile verilecekti gibi izleme rağmen, hücre izleme hücre-hücre ve hücre-vasküler bir etkileşim olmasını sağlayan iki boyutlu olarak elde edilir gözlenen ve rakamsal ve floresan antikorlar in vivo yönetimi ve daha sonraki boyama ile birlikte, gerçek zamanlı olarak protein / işaretleyici ifade veri vermek için kullanılabilir . Özellikle, görüntüler için alternatif görüntüleme teknikleri statik bir ortam gerektirir; sık cerrahi alan veya düz bir hazırlık lamel ek sıkma tabi. Bu sınırlar, değilse aktif vasküler bütünlüğü ve fizyoloji vb veya IVM hazırlığı içinde yapılan vazodilatasyon deneyleri gibi diğer tekniklerin kullanımı değerlendirmek için hazırlık içinde vasküler veya diğer mediyatörler serpmek yeteneği ortadan kaldırır. Ayrıca, standart IVM tamamen düz bir hazırlık gerektirmez ve hayvanın nefes tarafından oluşturulan gibi hareket etkilenmez. Bu standart IVM büyük tekrarlanabilirlik ile daha fazla cerrahi alanlarda kullanılmasına izin verir. Bu, burada açıklanan kasık lenf nodu hazırlık örneklediği. Lenf nodu boyutu ve şekli göz önüne alındığında, hazırlık dokuya zarar vermeden düz yapılabilir edemez ve düğümün konumu nedeniyle önemli bir hareket hayvan solunum yol açmaktadır. Bu tür konularda diğer yöntemlerle üstesinden gelmek için zor olacağını, ancak açıklanan standart IVM hazırlık ile kolayca dağıtılır. Özet olarak, yukarıda ayrıntılı olarak hazırlanması, herhangi bir sayı ile kombine edilebilir diğer biyokimyasal, vasküler ve / veya aktive altkümelerini transferi veya etiketli hücreleri, hipoksi indüksiyonu ve vasküler arabulucular tükenmesi üzerinde ifade gibi immünolojik teknikleri. Ancak, ek uygulamalar ilk hazırlık sağlık bağlıdır. Bu nedenle, her zaman görüntülü ve değerlendirilmektedir damar sağlığını test etmek için hayati önem taşımaktadır. Bir sağlık hazırlığı ulaşmak için kilit noktaları hazırlanması sürekli vücut ısısı dengelenmiş PSS ile perfüze ve ameliyat sırasında cerrahi alana yerleştirilen temas ve stresi en aza indirerek sağlamak.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Potasyum Klorür </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür dihidrat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodyum nitroprussid </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Fenilefrin </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Asetilkolin </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür heptahidrat </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Pentobarbitol Sodyum </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

Vücutta bulunan lenf düğümleri (LN), bağışıklık sisteminin bir parçasıdır. Bu nedenle, adaptif bağışıklık yanıtının indüksiyonu için bir site olarak hizmet ve efektör hücrelerinin gelişimi. Bu nedenle, LN, işgalci patojenlere mücadele ve sağlığı korumak için kilit öneme sahiptir. Erişilebilirlik ve istenilen model LN çalışmaya seçimi dikte kasık lenf düğümü yer alır ve kolayca biyolojik ilgili modelleri, cilt ve genital mukoza enfeksiyon çalışmaları destekler. Inguinal LN LN gibi kan ile besleyen geniş bir mikrovasküler ağına sahiptir. Genel olarak, bu mikrovasküler ağ, yüksek endotelyal venüller (HEVs) beslemelerini daha sonra şube ve LN ana besleme arteriyol içerir. HEVs homeostazı ve enfeksiyon sırasında bağışıklık hücrelerinin LN ticareti kolaylaştırmak için uzmanlaşmıştır. HEVs Bu koşullar altında LN ticareti düzenleyen Nasıl bir alanda yoğun bir keşif. LN linki arteriyol, üzerinde doğrudan HEVs upstream etkisi vardır ve içine besin ve hücre açısından zengin kan LN ana kaynağı. Ayrıca, yem arteriyol değişiklikleri adaptif bağışıklık yanıtının indüksiyonu kolaylaştırmak sorumlu tutulmaktadır. LN mikrodolaşımını LN optimal kan kaynağının korunması ve uygun LN fonksiyonu ve daha sonra bağışıklık yanıtının önemli unsurlardır LN, bağışıklık hücre akını düzenleyen açık bir öneme sahiptir. In vivo LN mikrodolaşımını çalışma yeteneği, bağışıklık sistemi ve mikrovasküler etkileşim ve LN içinde bir başka etkisi nasıl nedenlerine açıklık anahtar . Burada, kasık lenf nodu in vivo görüntüleme için bir yöntem mevcut. Biz, sağlıklı çalışma gemilerin, birkaç saat boyunca canlı damarlarının görüntülenmesinde korumak için yeteneği ve geminin büyüklüğü ölçümü sağlamak yöntemlerine özel önem vererek, LN mikrovaskuleterini görüntüleme odaklanır. Vazoaktif ilaçlar ile mikrovasküler perfüzyon gibi hücresel trafiğini izlemek ve ölçmek için potansiyel yöntemleri de sunulmaktadır. Inguinal LN intravital mikroskopi mikrovasküler işlevsellik ve bağışıklık hücreleri, LN, mikrosirkülasyon arasında doğrudan bir arayüz, gerçek zamanlı arayüzü doğrudan değerlendirme sağlar. Bu teknik potansiyel birçok immünolojik teknikler ve yanı sıra diğer LN damarsal çalışma manipüle floresan hücre etiketleme ile kombine edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Inguinal lenf nodu (LN) intravital mikroskopi gerçekleştirmek için bir teknik özetlenmiştir. Böyle bir tekniği, gerçek zamanlı sağlar.<em&gt; In vivo</em&gt; Homeostazı ve enfeksiyon sırasında her iki lenf düğümü mikrovasküler ve yapı çalışması. Bu teknik, hücre ticareti çalışmaları ve diğer lenf nodu sitelerine adapte edilebilir.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K Görüntüleme.  University of Northern British Columbia. Inguinal lenf nodu (LN) intravital mikroskopi gerçekleştirmek için bir teknik özetlenmiştir. Böyle bir tekniği, gerçek zamanlı sağlar. In vivo Homeostazı ve enfeksiyon sırasında her iki lenf düğümü mikrovasküler ve yapı çalışması. Bu teknik, hücre ticareti çalışmaları ve diğer lenf nodu sitelerine adapte edilebilir.

Video: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Mürin Yüzeysel lenf nodu Cerrahisi

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...