1. عرف عملية ZFN التصميم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للإسراع في عملية تصميم ZFN، وينبغي أن محقق توفر ما يلي: </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلومات عن الجينات المستهدفة مثل اسم الجينات والأنواع والجينات، وعدد الشرح / تحديد الهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبوضوح أكثر من كل شيء الهدف من التجربة (على سبيل المثال، الضربة القاضية أو Knockin) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أي من العوامل المحددة للهدف الجينات التي تشمل شاذة بنية الجينات والبيولوجيا خاص المتورطين في مكان وراثية، أو أي مناطق متماثلة في مكان آخر في الجينوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نطاق معين من تسلسل الحمض النووي لالاصبع الزنك nucleases لاستهداف. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فريق المعلوماتية الحيوية سيغما تجري في تصميم ZFN السيليكو الأولية لتطوير المواقع المستهدفة الزنك الاصبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم الأولية المواقع المستهدفة ZFN إلى مستشار ZFN التقنية والعلمية. لمشاريع أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، هذا عالم سيغما يعمل مع المحققين لوضع استراتيجية المشروع. </li><lأنا&gt; فريق المعلوماتية الحيوية سيغما تجري تحليلا مع خوارزميات لتوليد ZFN في التصاميم ZFN السيليكو. ويشمل هذا البحث الجينوم للخارج الهدف المواقع، اخفاء، كرر الحزب الوطني الاسكتلندي وتحليل لكل موقع ZFN هدفا محتملا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعلوماتية الحيوية ويوفر هدف ZFN أعلى المواقع إلى محقق للمراجعة. بناء على موافقة من المواقع ZFN هدفا محتملا، وتقدم هذه المعلومات إلى فريق الإنتاج ZFN للبدء في عملية تصنيع ZFN. </li></ol> 2. عرف ZFN الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم الأرشيف سيجما من وحدات الاصبع الزنك لتجميع التصاميم ZFN المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجميع كل تصميم ZFN وتسلسل التحقق من على منصة عالية الإنتاجية الاستنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إرسالها مرة واحدة انتاج جميع التصميمات ZFN يتم استكمال كل ZFN إلى التحقق من الصحة. </li></ol> 3. التحقق من ZFNs مخصص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاريع في ZFNيتم التحقق من صحة الإنسان، والجرذان والفئران أو CHO الأنواع في خطوط الخلايا تتميز أيضا لكل نوع، يتم استخدام فحص خميرة القائم للكائنات الحية الأخرى أو أنواع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم البنى ZFN في خط الخلية المناسبة من قبل nucleofection وأعرب ZFNs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حصاد الحمض النووي من تجمع لخلايا ZFN transfected والمنطقة من الفائدة هو تضخيم PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجري بعد ذلك فحص-1 سل على المنتج PCR. يتم تشغيل هلام إستشراد على فحص-1 سيل إلى نشاط ZFN التحقق من صحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم بعد ذلك ZFN أعلى نشاط تصميم كما أكده فحص سيل-1 إلى العميل. يتم تسليم ZFNs في مرنا والحمض النووي البلازميد مع بادئات PCR لفحص الجوف (1) والحمض النووي الجيني كعنصر تحكم إيجابية. </li></ol> 4. تسليم ZFNs المصادق عليها من قبل Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2x10 5 خلية / مل في اليوم السابق nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم nucleofection،اخراج الخلية الخط Nucleofector كيت الخامس وترك الحارة إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ملحق للNucleofection الخامس الحل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا. يجب أن تكون كثافة الخلايا بين الخلايا 5 2.5-5x10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل لوحة 6 جيدا مع 2ml من المتوسط ​​في كل جيدا، وقبل الدافئة في حاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة 2x10 6 خلايا في ترنسفكأيشن (8X10 6 المجموع) في 200xg لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 20 مل من محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب التجريبية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الإعلام من الخطوة (6.5) من الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 400 ميكروليتر (100 ميكروليتر / رد فعل) من الحل Nucleofection V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل واحد في وقت واحد، أضف 100 ميكروليتر من الخلايا إلى كل DNA أو الرنا التي تحتوي على أنبوب. Transfإيه هذا المزيج على كوفيت مم electroporation 2 و nucleofect على Nucleofector مع البرنامج المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد nucleofection من كل عينة، واستخدام ماصة نقل لإضافة ~ 500 ميكرولتر من متوسط ​​prewarmed من لوحة 6 جيدا في الخطوة (6.9) إلى كوفيت. ثم، بعناية نقل الخلايا من كفيت والمتوسطة في prewarmed المتبقية في لوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من كل ردود الفعل والعودة لوحة 6 جيدا للحاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية. </li></ol> 5. حصاد الحمض النووي الجينوم بعد التسليم من ZFNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 كذلك لوحة - لا حصاد كافة الخلايا المجمعة. من المهم للحفاظ على الثقافة من أجل الحصول على الخلايا وحيدة الخلية إلى استنساخ تخفيف بعد التأكد من أن لديك منتجات سيل-1 الهضم. واحد إلى ثلاثة أيام بعد nucleofection جمع الخلايا لإعداد الحمض النووي الصبغي باستخدام الحمض النووي الجيني GenElute الثدييات Miniprep كيت. </li></ol> 6. CEL-1 الفحص </P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تضخيم الحمض النووي الجيني من العينات transfected ZFN والجينومية مراقبة إيجابية الحمض النووي المنصوص عليها في عدة، وذلك باستخدام بادئات الموردة. تم تعيين رد فعل PCR مع الشروط التالية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد heteroduplexes من homoduplexes PCR تستغرق 10 ميكرولتر من رد فعل PCR من كل عينة ZFN المعالجة بالاضافة الى مراقبة واستخدام البرنامج التالي على thermocycler: 95 درجة مئوية، 10 دقائق 95 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية، -2 درجة مئوية / 2 85 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية، -0،1 درجة مئوية / 2 4 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من محسن و 1 ميكرولتر من S Nuclease (من رقم الكتالوج Transgenomic 706025) على كل رد فعل واحتضانها في 42 درجة مئوية لمدة 20-40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الهضم على جل الصفحات TBE 10٪ مع علامات السليم، مثل الحمض النووي سلم DirectLoad WideRange (رقم الكتالوج D7058) (انظر النتائج في نشرة مخصصة التقنية ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيتم الكشف عن CE إشارة إيجابية في ZFN المعاملة من قبل السكان CEL-I فحص، والمضي قدما إلى العزلة نسيلي والتوصيف. </li></ol> 7. نسيلي عزل وتوصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحيدة الخلية استنساخ نماذج ZFN المعالجة بالطرق العادية بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والاستنساخ التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للاستنساخ لتوسيع بما فيه الكفاية، ثم انشق بعض نسبة من الخلايا لحصاد الحمض النووي الجيني، وتجميد ما تبقى كما ظهر هذه المواد المخزونة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة باستخدام بادئات الجوف أنا وتحليل amplicon بواسطة سيل-I فحص (مع وبدون الحمض النووي WT ارتفعت في)، أو بدلا من استخدام هذه amplicon إلى الانتقال مباشرة إلى التنميط الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ مرشح الوراثي التي تم تحديدها على أنها الأليلات قديم الأسلوب المفضل. </li></ol> 8. ممثل النتائج ويقدم مثالا على سير العمل كله ZFN CompoZr في الشكل 2. يتم تسليم ZFNsإلى الخلايا حيث ربط ويلتصق تسلسل الحمض النووي المناسبة مما يؤدي إلى كسر مزدوج الجديلة (DSB). عملية الإصلاح الطبيعية، وغير المتجانسة انهاء انضمام (NHEJ)، وإصلاح جهاز تسوية المنازعات. في بعض الحالات نتائج NHEJ الشاذة في الإدراج أو الحذف أو الاستبدال من النيوكليوتيدات. PCR التضخيم من حصاد نتائج الحمض النووي الجيني في تشكيل مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل بعد تمسخ / خطوة الصلب للتفاعل PCR. علاوة على ذلك من نتائج انزيم سيل-1 في شق من أي جزيئات مضاعف متغاير. يتم حل CEL-1 النتائج وفقا لتحليل PAGE لتأكيد الانقسام ZFN. الشكل (3) يوفر التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج المتوقعة. وترد ممثل سيل-1 النتائج في الأرقام 4 و 5 الشكل 4 يحتوي على النتائج من زوج نشطة جدا من ZFNs (21٪) في K562 الخلايا؛. الشكل (5) يحتوي على النتائج من زوج أقل نشاطا (2.4٪) من ZFNs فيK562 الخلايا. ويؤكد ZFN النشاط في كل من الأرقام عن وجود شظايا PCR 2 أدناه جزء PCR الوالدين. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صممت تمثيل متجهة nucleases إصبع الزنك. ZFNs البروتينات تتألف من إصبع الزنك الحمض النووي ملزم نطاق تنصهر فيها إلى المجال انشقاق في نوكلياز داخلية تقييد FokI. عندما ملزمة باعتبارها مثنوي مغاير، ZFNs إنشاء فاصل المزدوج تقطعت بهم السبل في تسلسل الحمض النووي المستخدم المحدد. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التخطيطي لسير عمل مخصص خدمة ZFN. التمثيل البياني لسير العمل لإنشاء خط خلية المعدلة وراثيا باستخدام ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الشكل 3. التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج. A) ZFN س البلازميد<html> يتم تسليم ص مرنا للخلايا. ب) أعربت عن ZFNs ربط وقطع تسلسلها الهدف خلق فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في جزء من الخلايا. C) إصلاح الشاذة من بعض DSBs بواسطة مثلي عدم انهاء انضمام النتائج في النوكليوتيدات الإدراج أو الحذف. D) يتم حصاد الحمض النووي الجيني من تجمع transfected من الخلايا وتضخيمها في موضع الاهتمام. EF) PCR المنتج هو التشويه والتحريف وإعادة تشكيل مطوع خلق مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل. ز) عدم تطابق نتائج فحص نوكلياز داخلية سيل-1 في شق من الجزيئات مضاعف متغاير. يتم حل H) سل-1 إنزيم يساعد على هضم بواسطة PAGE. الملاحظ أن نسبة من الناتج الانقسام إلى فرقة بالحقن، التي تحددها البرمجيات يماغيج، يدل على قطع جزء وكفاءة ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. CEL-1 النتائج من ZFNs نشط 21٪ يماغيج البرنامج متاح في:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. CEL-1 النتائج من 2.4٪ ZFNs نشط يماغيج البرنامج متاح على العنوان التالي:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol>
	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

يمكن للباحثين تقديم ZFN خلايا معدلة أو الحيوانات للمتعاونين في إطار اتفاق للبحوث الترخيص القياسية. في هذا الظرف سيغما يطلب أن يتم وضع اتفاق لنقل المواد في مكان ما بين سيجما، والعملاء والمتعاونين ZFN بهم. ويمكن الاطلاع على الترخيص بحث في: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . إذا كان هناك إمكانية لتطبيق التجارية باستخدام الخلايا المعدلة ZFN سيجما ثم يطلب أن يتم وضع رخصة تجارية في المكان. وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل سيغما، وشركة

يتم عزل مرة ZFN المعدلة الخلايا لديهم دائم وراثية التعديلات الحمض النووي. هذه النتائج في القدرة على توليد خطوط الخلايا المعدلة ثابت أو الحيوانات تولد مع بعض التعديلات الوراثية المطلوبة لإجراء البحوث. CompoZr ZFNs مخصص توفير وسيلة قوية لجينوم التحرير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. نشر الخريطة الجينية الناجحة مع تحرير ZFNs يشمل لكن لا يقتصر على خطوط الخلايا البشرية، الفأر، الجرذ، الزرد، الضفادع، الخنازير ونماذج البحوث CHO. 3،4،5،6،7،8،9 والقدرة على خلق وأكد المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع في موقع الهدف المنشود في نوع من الخلايا المحددة عندما يتم تسليمها بشكل صحيح ZFNs في خلية. ومن الممكن أيضا لأداء تسلسلي التعديلات إصبع الزنك إلى خلية من أجل أن يكون أكثر من التعديل الوراثي داخل الخلية. (10) القدرة على تحديد تسلسل هدف محدد وتعديلها فقط أن مكان معين هو السبب الرئيسي للقدرة على إنشاء عدة modifiالكاتيونات. يتم إنشاء شهادة CompoZr ZFN مخصص للتحليل مع الكواشف جدا المنصوص عليها في عدة وبذلك يضمن أنه تم جميع مكونات عدة التحقق من صحة تماما للنجاح العملاء. وتعرض الخطوات الحاسمة في سير العمل من البداية الى النهاية أدناه: استنساخ الخلية وينبغي اختبار القدرة على عزل وتوسيع خط خلية معينة قبل البدء في أي تجارب ZFN. ينبغي عزل الخلايا وحيدة وتوسيعها لضمان أن سكان clonally المستمدة من الممكن. بعض خطوط الخلايا هي المتمردة في هذه المسألة، والحيل مثل تخصيب اليورانيوم لاستنساخ التعديل، أو الثقافة مع وسائل الاعلام في ظروف يمكن أن تساعد في التغلب على هذه التحديات. تسليم كفاءة الاستغلال الأمثل للكفاءة تسليم أمر لا بد منه قبل تسليم ZFNs. ويمكن استخدام العديد من الأساليب بما في ذلك الدهون مقرها ترنسفكأيشن، electroporation، وnucleofectiفي. طريقة التسليم المثالي يتكون من احد ان يعطي مزيج معظم الأمثل للكفاءة تسليم وبقاء الخلية. قد Quantitating هذه الكفاءات أن يقدر من خلال تقديم سيطرة GFP البلازميد وquantitating بالمعاينة البصرية أو نظام مراقبة الأصول الميدانية 24 48hrs بعد التسليم. CEL-I مقايسة لا بد من أن يتم تنفيذ سيل-I فحص بالتوازي مع الضوابط المناسبة لضمان PCR، والهضم، والكهربائي المعلمات لن تتدخل في تفسير التجربة ZFN. كل مجموعة تضم الحمض النووي تحكم الجيني التي يتم استخدامها لخلق صورة سيل-I في شهادة التحليل. والتضخيم من الحمض النووي السيطرة مع الاشعال المقدمة تليها الجوف أنا الفحص تسمح للمستخدم لمقارنة النتائج مع تلك المنصوص عليها في شهادة التحليل (CofA) صورة، وعزل أي أوجه القصور المحتملة في هذا الجانب من تجربة. تعامل عنصر تحكم المناسبة السلبية مثل وهمية، أو خلية GFPوينبغي أيضا أن تدرج عينة للسماح للتوضيح أي من منتجات الانقسام غير محددة. نوعي / التحليل الكمي وحيدة الخلية المستنسخة بعد العلاج ZFN واحد استنساخ الخلية، قد يتم فحص السكان من الخلايا للتحرير في موضع الاهتمام من جانب عدد من الطرق. ويمكن إجراء CEL-I فحص الحمض النووي في الجينوم من الحيوانات المستنسخة لغرض تحديد استنساخ مرشح لمزيد من التنميط الجيني. من المهم أن amplicon ارتفاع PCR WT في amplicons عينة بنسبة 1:1 قبل تنفيذ سيل-I هضم مثل الحيوانات المستنسخة طافرة متماثل سوف تحتوي على جزيئات متجانسة، وبالتالي نقل سلبي سيل-I فحص النتيجة. طريقة بديلة لفحص هذه الحيوانات المستنسخة مرشح هو تصميم واحد هبوط التمهيدي PCR مباشرة على موقع الهدف ZFN. تستخدم جنبا إلى جنب مع واحدة من الاشعال السيطرة، نتيجة الفحص سلبية تشير إلى فقدان تسلسل WT. وهناك نسخة متخالف التي تحتوي على واحد على الأقل الأليل WT ذويمكن فصل درع PCR إشارة، ولكن من الحيوانات المستنسخة WT تماما قبل تنفيذ PCR في سياق qPCR SYBR. مرة واحدة وقد تم تحديد مرشح استنساخ بواسطة الطرق المذكورة أعلاه، قد تكون مرمزة من قبل pyrosequencing القياسية، وتسلسل عميق، أو تسلسل أساليب أخرى. لجميع طرق التسلسل، ينبغي إنشاء amplicon إنشاؤها من الحمض النووي الجيني نسيلي. ويمكن فصل لالأليلات pyrosequencing التقليدية بواسطة TA-PCR الاستنساخ المنتج، والتسلسل المستعمرات الفردية. لأساليب مثل التسلسل عميق هذه الخطوة ليست ضرورية. إصلاح تناظر إخراج (تقرير) يتيح هذا البروتوكول طريقة للخروج المغلوب ZFN بوساطة الجينات عبر NHEJ. ويمكن أيضا دمج الجينات المحورة سيجريه مقدمة من إحدى الجهات المانحة البلازميد مع الأسلحة التي تناظر الجناح موقع قطع ZFN. 11 في هذا السيناريو، ZFN خلقت يتم إصلاح المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع بواسطة HDR بدلا من NHEJ. توجه تقرير التنمية البشرية الأولويمكن تأكيد ntegration من الجينات المحورة باستخدام أساليب مماثلة للإجراءات المنصوص عليها في جميع أنحاء هذا البروتوكول. استكشاف الأخطاء وإصلاحها تسليم ZFNs ويمكن السيطرة على تسليم ZFN والتعبير التسليم عن طريق التسليم من GFP أو غيرها. هذا البلازميد و / أو التصور تحديد الكميات ويمكن التغلب على التعبير منخفضة نظرا لعدم توافق المروج مع نوع من الخلايا في المصالح عن طريق التسليم من ZFNs في شكل مرنا. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم استخدام أسلوب الصدمة الباردة لزيادة فعالية ZFNs في الخلايا. 12 إذا تم استخدام مرنا لا بد من أن تغسل الخلايا قبل التسليم لضمان أن يتم نقل جميع Rnases المصل المشتقة. بل هو أيضا من الحكمة أن ذوبان الجليد ومرنا على الجليد، وإضافة إلى هذه الخلايا في آخر لحظة جدا للحد من أي فرصة للتحلل. CEL-I مقايسة تأسيس آسا سيل-Iy هو التضخيم محددة وافرة من موضع الاهتمام. إذا لاحظت منتجات التضخيم غير محددة استخدام معيار PCR إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة خصوصية مثل الاستفادة المثلى من كمية القالب، وتركيز التمهيدي، وركوب الدراجات المعلمات. لتحليل PAGE في مقابل الكهربائي الاغاروز معيار كأسلوب الأخير لا يوفر القرار الملائم وحساسية. ويمكن أيضا CEL-I ظروف هضم يكون الأمثل في حال ملاحظة أي منتج هضمها أو تلطيخ المفرطة. ويمكن معاير معايرة كمية سيل-1 / وnuclease أو طول الفترة الزمنية الهضم لتحسين هذه الجوانب.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Nuclease S (CEL-1 إنزيم) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> توسيع الدقة العالية PCR النظام </td><td> روش </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> خلية الخط Nucleofector كيت الخامس </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP سم داخلي المنشأ خالية البلازميد Maxiprep كيت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

الجينوم التحرير هي تقنية قوية التي يمكن استخدامها لتوضيح وظيفة الجين والأساس الجيني للمرض. الجينات التقليدية أساليب تحرير مثل المواد الكيميائية القائمة على الطفرات أو التكامل عشوائية من تسلسل الحمض النووي تمنح التغييرات الجينية العشوائية بأسلوب غير فعال الشاملة وتتطلب إدراج تسلسل الاصطناعية غير مرغوب فيه أو استخدام الظروف الشاذة ثقافة، يحتمل أن تكون مربكة دراسة بيولوجية. على النقيض من ذلك، يمكن للعابر التعبير ZFN في زنزانة تسهيل دقيق، الموروثة التحرير الجين بطريقة ذات كفاءة عالية دون الحاجة لإدارة المواد الكيميائية أو التكامل من الجينات المحورة الاصطناعية. nucleases إصبع الزنك (ZFNs) هي الانزيمات التي تربط وقطع متواليات متميزة من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA). وظيفي من وحدة ZFN CompoZr يتكون من البروتينات 2 أحادى الفردية التي تربط الحمض النووي &quot;نصف موقع&quot; ما يقرب من 15-18 النيوكليوتيدات (انظر الشكل 1). عندما اثنين ZFN أحاديةالسائدة &quot;الوطن&quot; على مواقعهم الهدف المتاخمة المجالات الحمض النووي انشقاق dimerize وإنشاء فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في الحمض النووي. 1 مقدمة من ZFN بوساطة DSBs في الجينوم يضع أساسا للتحرير الجينوم كفاءة عالية. يمكن إصلاح ناقص من DSBs في خلية عن طريق المنظمات غير المتجانسة في نهاية الانضمام (NHEJ) والحمض النووي مسار الإصلاح يؤدي إلى الإدراج الصغيرة والحذف (indels). ويمكن إنشاء indels ضمن تسلسل الجينات ترميز خلية يؤدي إلى انزياح الإطار، وبالضربة القاضية الفنية لاحق من مكان الجين على كفاءة عالية. 2 في حين أن هذا البروتوكول يصف استخدام ZFNs لخلق بالضربة القاضية جين، والتكامل من الجينات المحورة ويمكن أيضا أن تتم عن طريق تناظر الموجهة إصلاح في موقع قطع ZFN. مخصص CompoZr ZFN الخدمة يمثل نهج منتظم وشامل، وكذلك تتميز إلى تحرير الجينات المستهدفة للأوساط العلمية مع التكنولوجيا ZFN. العلماء سيجما العمل بشكل وثيق مع المحققين إلى 1) perfoRM تحليل العناية الواجبة بما في ذلك تحليل بنية الجينات ذات الصلة، والبيولوجيا، ونظام نموذجي وفقا لأهداف المشروع، 2) تطبيق هذه المعرفة لوضع استراتيجية سليمة تستهدف، 3) ثم تصميم وبناء، والتحقق من صحة وظيفيا ZFNs عن النشاط في ذات الصلة خط خلوي. المحقق يتلقى إيجابي الحمض النووي الجيني السيطرة والاشعال، والجاهزة للاستخدام الكواشف ZFN توفيره في كل من الحمض النووي البلازميد في المختبر وتنسيق مرنا المحولة. قد ثم يتم تسليم هذه الكواشف للتعبير عابر في خط خلية المحقق أو نوع من الخلايا في الاختيار. ثم يتم اختبار عينات لتحرير الجين في موضع الاهتمام من جانب معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك التضخيم PCR، هضم الأنزيمية، والكهربائي. بعد يتم الكشف عن إشارة إيجابية لتحرير الجين في عدد السكان الأولية، الخلايا وحيدة الخلية المستنسخة ومرمزة لتحديد من الحيوانات المستنسخة طافرة / الأليلات.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

مخصص CompoZr الزنك فنجر Nuclease (ZFN) خدمة تمكن دقيق التحرير الجينوم في أي كائن حي أو خط خلية في أي مكان محدد من قبل المستخدم. توضح هذه المقالة عملية لتصميم والتحقق من صحة وتصنيع وتنفيذ الخدمة CompoZr ZFN مخصص.

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.2K Views.  Sigma Life Science. مخصص CompoZr الزنك فنجر Nuclease (ZFN) خدمة تمكن دقيق التحرير الجينوم في أي كائن حي أو خط خلية في أي مكان محدد من قبل المستخدم. توضح هذه المقالة عملية لتصميم والتحقق من صحة وتصنيع وتنفيذ الخدمة CompoZr ZFN مخصص.

Video: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

الجسيمة والجميلة تشريح الأذن الداخلية الظهارة الحسية في اسماك الزرد الكبار ( دانيو rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

A - سلبية الآلي اللمس فنجر محفز (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

قياس وظائف المخ Neuromagnetic في مرحلة ما قبل المدرسة والأطفال MEG الحجم مخصص

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

تجارب أداء مخصص ميكروأري MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

الماوس الجينوم الهندسية عن طريق Nucleases مصمم

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub&gt; 2</sub&gt; العاهل<sub&gt; 2</sub&gt; مجالات الزنك الاصبع

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

الجينوم التحرير في<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; استخدام النسخ المنشط مثل المستجيب Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

تقييم توافر المعادن في أعلاف الأسماك باستخدام أساليب تكميلية موضحة مع مثال الزنك في سمك السلمون الأطلسي

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.