1. Processo de Design personalizado ZFN <ol><li> Para agilizar o processo de design ZFN, um investigador deve fornecer: </li><ul><li> Informação sobre o gene alvo, tais como o nome do gene, a espécie, e número de genes de anotação / identificação. </li><li> Um declarou claramente sobre-tudo objetivo do experimento (por exemplo, Knockout, ou Knockin) </li><li> Quaisquer factores específicos do gene alvo que incluem estrutura do gene atípico, biologia especial implicada no locus genético, ou quaisquer regiões homólogas em outras partes do genoma. </li><li> O intervalo específico de seqüência de DNA para o dedo de zinco nucleases atingir. </li></ul><li> A Sigma equipe de bioinformática conduz in silico projeto ZFN desenvolver iniciais de zinco sítios-alvo do dedo. </li><li> Sítios-alvo iniciais ZFN são fornecidos com um consultor científico ZFN técnica. Para projetos mais complexos tecnicamente, este cientista Sigma trabalha com os investigadores a desenvolver a estratégia do projecto. </li><li&gt; A Sigma equipe de bioinformática realiza uma análise com algoritmos para gerar ZFN em projetos silico ZFN. Isso inclui uma pesquisa do genoma inteiro para fora do alvo sites, mascaramento, repetição e análise de SNP para cada site ZFN potencial alvo. </li><li> Bioinformática fornece os sites de destino top ZFN ao investigador para revisão. Após a aprovação dos locais alvo potenciais ZFN, essa informação é fornecida para a equipe de produção ZFN para iniciar o processo de fabricação ZFN. </li></ol> 2. Produção ZFN personalizado <ol><li> O arquivo Sigma de módulos de dedo de zinco é usado para montar os projetos aprovados ZFN. </li><li> Cada projeto ZFN é montado e seqüência verificada em uma plataforma alta taxa de clonagem. </li><li> Uma vez que a produção de todos os projetos ZFN é completar todos os ZFN é enviado para validação. </li></ol> 3. Validação de ZFNs personalizados <ol><li> Projetos em ZFNespécie humana, ratinho, rato ou CHO são validados em linhas de células bem caracterizadas para cada espécie, um ensaio baseado em levedura é usado para outros organismos ou tipos de células. </li><li> Construções ZFN são entregues para a linha celular apropriada por nucleofection e os ZFNs são expressos. </li><li> O DNA é colhido a partir do pool de células transfectadas ZFN e da região de interesse é amplificado por PCR. </li><li> O Cel-1 ensaio é então conduzida sobre o produto de PCR. Eletroforese em gel é executado no-1 Cel ensaio para atividade ZFN validado. </li><li> A concepção mais elevada ZFN actividade como confirmado pelo ensaio Cel-1 é então fornecida ao cliente. ZFNs são entregues em ARNm e ADN de plasmídeo, juntamente com iniciadores de PCR para o ensaio Cel-1 e DNA genómico como um controlo positivo. </li></ol> 4. Entrega de ZFNs validados pelo Nucleofection <ol><li> Semente as células a uma densidade de 2x10 células / ml 5 o dias antes nucleofection. </li><li> No dia da nucleofection,tirar Linhagem Celular Nucleofector Kit V e deixe aquecer à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar o suplemento ao Nucleofection Solução V de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Contar as células. Densidade de células deve ser entre 2,5-5x10 5 células / ml. </li><li> Encher uma placa de 6 poços com 2 ml de meio em cada poço e pré-aquecido em um incubador de CO2 a 37 ° C durante pelo menos 20 minutos antes da nucleofection. </li><li> Centrifugar 2x10 células por transfecção 6 (total 8x10 6) em 200xg durante 5 minutos. </li><li> Lave as células duas vezes com 20 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> Prepare os tubos experimentais: (ver tabela em Custom boletim técnico ZFN) </li><li> Remova a placa de 6 poços contendo meio a partir do passo (6,5) da incubadora. </li><li> Ressuspender as células em 400 uL (100 uL / ​​reacção) de solução de Nucleofection V. </li><li> Uma reacção a uma hora, adicionar 100 uL de células para cada DNA ou mRNA contendo-tubo. Transfer a mistura para uma cuvete de electroporação 2 milímetros e nucleofect sobre uma Nucleofector com o programa apropriado. </li><li> Imediatamente após nucleofection de cada amostra, utilizar uma pipeta de transferência para adicionar ~ uL de meio de 500 pré-aquecido a partir da placa de 6 poços no passo (6,9) para a cuvete. Em seguida, transferir cuidadosamente a partir de células da cuvete para o meio restante pré-aquecido na placa de 6 poços. </li><li> Terminar todas as reacções e retornar a placa de 6 poços para a incubadora de CO2 a 37 ° C. </li></ol> 5. Colheita DNA genômico após a entrega do ZFNs <ol><li> 6-bem placa - não colher todas as células em pool. É importante manter a cultura, a fim de ter células para clone de célula única diluição depois de confirmar que você tem produtos Cel-1 de digestão. Uma a três dias após a nucleofection recolher as células para preparar DNA cromossómico usando o GenElute Mammalian DNA genómico Kit Miniprep. </li></ol> 6. Cel-1 Ensaio </p&gt; <ol><li> PCR amplificar o ADN genómico a partir das amostras ZFN transfectadas eo DNA genómico positivo de controlo fornecidos no kit, utilizando os iniciadores fornecidos. A reação de PCR está configurado com as seguintes condições: (ver tabela em Custom boletim técnico ZFN). </li><li> Para gerar heteroduplexes dos homoduplexes PCR tomar 10 ul de reacção de PCR a partir de cada amostra tratada ZFN mais o controle e utilizar o seguinte programa no termociclador: 95 ° C, 10 minutos 95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / segundo 85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / segundo 4 ° C, indefinidamente </li><li> Adicionar 1 ml de enhancer e 1 uL de Nuclease S (a partir de Número de Catálogo Transgenomic 706.025) a cada reacção e incubar a 42 ° C durante 20-40 minutos. </li><li> Executar as digestões em um 10% gel TBE-PAGE com marcadores apropriados, tais como DirectLoad Ladder DNA WideRange (Número de catálogo D7058) (ver resultados em boletim técnico personalizado ZFN). </li><li> Emce sinal positivo foi detectado em ZFN tratados com populações por cel-I ensaio, proceder ao isolamento e caracterização de clones. </li></ol> 7. Isolamento e Caracterização Clonal <ol><li> De uma única célula de clones das amostras ZFN-tratadas por métodos padrão, incluindo FACS e clonagem de diluição. </li><li> Permita que os clones para expandir o suficiente, então, dividir alguma proporção de células para a colheita do DNA genômico, o congelamento de volta o restante como material depositado. </li><li> Amplificar o ADN genómico a partir dos clones utilizando os primers Cel-I e analisar o fragmento amplificado por Cel-I de ensaio (com e sem ADN WT enriquecida em), ou alternativamente utilizar este fragmento amplificado para seguir directamente para a genotipagem. </li><li> Clones candidatos Genótipo identificados como tendo alelos editado por o método preferido. </li></ol> 8. Os resultados representativos Um exemplo de todo o CompoZr ZFN fluxo de trabalho é apresentado na Figura 2. ZFNs são entreguespara as células onde eles se ligam e clivar a sequência de ADN adequada que cria uma quebra de cadeia dupla (DSB). O processo de reparação natural, não-homóloga acabam unindo (NHEJ), os reparos do DSB. Em alguns casos resultados aberrantes NHEJ em inserção, deleção ou substituição de nucleótidos. A amplificação por PCR de ADN genómico colhidas resultados na formação de heteroduplex entre tipo selvagem e amplicões modificados após a desnaturação / etapa de recozimento da reacção de PCR. Além dos resultados Cel-1 enzima na clivagem de quaisquer moléculas de heteroduplex. Cel-1 resultados são resolvidos por análise de PAGE para confirmar a clivagem ZFN. A Figura 3 fornece um diagrama esquemático do ensaio Cel-1 e os resultados esperados. Representativos Cel-1 resultados estão contidos nas Figuras 4 e 5 A Figura 4 contém os resultados de um par muito activa de ZFNs (21%) em células K562;. Figura 5 contém resultados de um par menos activo (2,4%) de ZFNs emCélulas K562. Actividade ZFN é confirmada em ambas as figuras pela presença de dois fragmentos de PCR abaixo do fragmento de PCR parental. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. ZFNs representação de nucleases de dedo de zinco ligados. São concebidos proteínas compostas de um dedo de zinco de ligação do ADN do domínio fundido com o domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI. Quando ligado como um heterodímero, ZFNs criar uma quebra de cadeia dupla em uma seqüência de DNA do usuário especificado. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Esquema do fluxo de trabalho personalizado Serviço ZFN. Representação gráfica do fluxo de trabalho para gerar uma linhagem de células geneticamente modificadas utilizando ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Esquemática do ensaio Cel-1 e os resultados. A) ZFN o plasmídeo<html> mRNA r é entregue a células. B) Expressa ligam ZFNs e cortar sua seqüência alvo a criação de uma ruptura de fita dupla (DSB) em uma porção de células. C) reparação aberrante de alguns DSBs por não-homóloga acabar juntando resultados na inserção de nucleotídeo ou eliminação. D) O ADN genómico é colhido a partir do pool de células transfectadas e amplificado no locus de interesse. EF) produto de PCR é desnaturado e re-recozida a criação de formação heteroduplex entre tipo selvagem e amplicões modificados. G) Os Cel-1 de desadaptação resultados de endonucleases de ensaio na clivagem de moléculas de heteroduplex. H) Cel-1 enzima digere são resolvidos por PAGE. A proporção observada de produto de clivagem a banda parentérica, determinada por ImageJ software, indica a fracção de corte e da eficiência das ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Cel-1 resultados de 21% ZFNs ativos software ImageJ está disponível em.:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> Figura 5. Cel-1 resulta de 2,4% ZFNs ativos software ImageJ está disponível em:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

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	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

Os pesquisadores podem fornecer ZFN células modificadas ou animais aos colaboradores no âmbito do Acordo de Licença de Pesquisa padrão. Nesta circunstância Sigma pede que um acordo de transferência de material é posto em prática entre Sigma, o cliente ZFN e sua colaboradora. A licença de pesquisa pode ser visto em: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Se há um potencial para uma aplicação comercial usando ZFN modificada células Sigma, em seguida, pede que uma licença comercial é colocado no lugar. Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Sigma, Inc.

Uma vez que ZFN modificados células são isoladas têm permanente e hereditárias modificações no DNA. Isso resulta na capacidade de gerar linhagens de células estavelmente modificados ou de animais da raça com modificações genéticas desejadas para realizar a investigação. ZFNs CompoZr personalizadas proporcionam um método robusto para genoma edição em uma grande variedade de tipos de células. Publicação de genoma bem sucedida edição com ZFNs inclui mas não está limitado às linhas de células humanas, ratinho, rato, peixe-zebra, rã, suínos e modelos de pesquisa CHO. 3,4,5,6,7,8,9 A capacidade de criar um ruptura de fita dupla no local alvo desejado no tipo de célula especificado é assegurada quando os ZFNs são adequadamente entregue em uma célula. É também possível realizar modificações dedo sequenciais de zinco para uma célula a fim de ter mais do que uma modificação genética dentro de uma célula. 10 A capacidade para seleccionar uma sequência alvo específica e modificar apenas que o locus em particular é uma causa primária para a capacidade de criar múltipla modificátions. O CompoZr personalizado certificado ZFN de análise é gerado com os reagentes próprios fornecidos no kit assegurando assim que todos os componentes do kit, foram exaustivamente validado para o sucesso do cliente. As etapas críticas do fluxo de trabalho do começo ao fim são apresentados a seguir: Clonagem de células A capacidade de isolar e expandir uma linha de células dada devem ser testados antes de iniciar quaisquer experiências ZFN. Células individuais devem ser isoladas e expandidas para garantir que uma população clonal derivada é possível. Algumas linhas de células são recalcitrantes nesta matéria, e os truques como o enriquecimento de clones editados ou cultura com a mídia condicionado pode ajudar a superar esses desafios. Eficiência na entrega Otimização da eficiência na entrega é uma obrigação antes da entrega das ZFNs. Muitos métodos podem ser utilizados, incluindo lípido baseado transfecção, electroporação, e nucleofectipor diante. O método de entrega ideal consiste de um que proporciona a mistura mais óptima de eficiência de entrega e sobrevivência celular. Quantificar as eficiências podem ser estimados através da apresentação de um controle GFP plasmídeo e quantificação através de inspeção visual ou FACS 24-48hrs pós-parto. Cel-I ensaio É imperativo que Cel-I ensaio é realizado em paralelo com os controlos apropriados para assegurar que os parâmetros de PCR, digestão, e electroforese não irá interferir com a interpretação da experiência ZFN. Cada kit inclui DNA genómico de controlo que é utilizado para criar a imagem Cel-I no certificado de análise. Amplificação do DNA controle com os primers fornecidos seguido por Cel-I ensaio permitirá ao usuário comparar os resultados com o previsto no Certificado de Análise (COFA), imagem e isolar todas as ineficiências potenciais neste aspecto de uma experiência. Um controle negativo adequado, como um simulacro, ou GFP tratados celularamostra deve também ser incluída para permitir a elucidação de quaisquer produtos não específicos de clivagem. Qualitativa / quantitativa análise de clones de célula única Após tratamento e ZFN clonagem única célula, as populações de células podem ser rastreados para a edição no locus de interesse, um número de métodos. Cel-I ensaio pode ser conduzido sobre o DNA genómico a partir de clones com a finalidade de identificar clones candidatos para genotipagem adicional. É importante a espiga amplicon PCR WT nas amplicões amostra com uma proporção de 1:1 antes da realização do Cel-I digerir como homozigotas clones mutantes irá conter moléculas homogéneas e, assim, transmitir um resultado Cel-I ensaio negativo. Um método alternativo para o rastreio destes clones candidatos consiste em conceber uma aterragem iniciador de PCR directamente no local alvo ZFN. Utilizado em conjunto com um dos iniciadores de controlo, um resultado de ensaio negativo indica perda da sequência de WT. Um clone heterozigótica contendo pelo menos um alelo WT irá yield PCR sinal, mas podem ser segregados a partir de clones completamente WT efectuando a PCR no contexto da SYBR qPCR. Uma vez que os clones candidatos foram identificados através dos métodos acima, eles podem ser genotipados por pyrosequencing padrão, a sequenciação de profundidade, ou outros métodos de sequenciação. Para todos os métodos de sequenciação, um fragmento amplificado criado a partir do ADN genómico clonal deve ser gerada. Para alelos pyrosequencing tradicionais podem ser segregados por TA-clonagem do produto de PCR, e sequenciação das colónias individuais. Para os métodos de sequenciação, tais como profunda este passo não é necessário. Reparação homologia Dirigido (HDR) Este protocolo fornece o método para ZFN nocaute de genes mediada via NHEJ. Integração dos transgenes também pode ser realizado através da introdução de um doador plasmídeo com braços de homologia que ladeiam um site corte ZFN 11. Neste cenário, o ZFN criado double-stranded break é reparado por HDR em vez de NHEJ. HDR dirigido iINTEGRAÇÃO de transgenes podem ser confirmados utilizando métodos semelhantes aos procedimentos estabelecidos ao longo deste protocolo. Solução de problemas Entrega de ZFNs Entrega ZFN e expressão de entrega-pode ser controlada pelo fornecimento de uma GFP ou outro tal plasmídeo para visualização e / ou quantificação. Baixa expressão devido à incompatibilidade promotor com o tipo de célula de interesse pode ser superado pela entrega de ZFNs em formato de mRNA. Adicionalmente, o método do choque térmico pode ser utilizado para aumentar ainda mais a eficácia da ZFNs nas células. 12 Se mRNA é usado, é imperativo que as células são lavadas antes da entrega para assegurar que todas as RNases de soro derivadas de ter sido removido. Também é prudente para descongelar o mRNA em gelo, e adicionar o que para as células no último momento para minimizar qualquer possibilidade de degradação. Cel-I ensaio A fundação da assa Cel-Iy é a amplificação específica e ampla do locus de interesse. Se os produtos não-específicas de amplificação são observados usar os procedimentos padrão de PCR solução de problemas para aumentar a especificidade, tais como a otimização da quantidade de modelos, a concentração dos iniciadores, e ciclismo parâmetros. Realizar a análise PAGE em oposição a electroforese em agarose padrão como o último método não proporciona resolução adequada e sensibilidade. Condições Cel-I digerir também pode ser otimizado se não houver produto digerido ou manchas excessivo é observado. Titulação da quantidade de Cel-1 nuclease e / ou duração de tempo de digestão pode ser titulada para melhorar estes aspectos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Nuclease S (Cel-1 enzima) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expandir High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Linhagem Celular Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP Endotoxinas-Free Plasmídeo Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genoma de edição é uma poderosa técnica que pode ser usado para elucidar a função do gene e da base genética da doença. Gene tradicional edição de métodos como a mutagênese química baseada ou integração aleatória de seqüências de DNA conferir as mudanças indiscriminadas genéticos de uma forma geral ineficiente e exigem a incorporação de indesejáveis ​​sequências sintéticas ou utilização de condições de cultura aberrantes, potencialmente confuso estudo biológico. Por contraste, a expressão transiente em ZFN uma célula pode facilitar preciso, hereditárias edição gene de uma maneira altamente eficiente, sem a necessidade de administração de produtos químicos ou integração de transgenes sintéticos. Nucleases dedo de zinco (ZFNs) são enzimas que se ligam e cortar sequências distintas de ADN de cadeia dupla (dsDNA). Um funcional CompoZr unidade ZFN consiste em duas individuais proteínas monoméricas que se ligam um DNA &quot;metade&quot; local-de, aproximadamente, 15-18 nucleótidos (ver Figura 1). Quando dois ZFN monomers &quot;casa&quot; para os seus sítios-alvo adjacentes os domínios de clivagem do DNA-dimerizam e criar uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA. 1 Introdução de ZFN mediadas DSBs no genoma estabelece uma base para a edição de genoma altamente eficiente. Reparação imperfeita de LAP em uma célula através da não-homóloga final de adesão via de reparação (NHEJ) de ADN pode resultar em pequenas inserções e deleções (indels). Criação de indels dentro da sequência do gene de codificação de uma célula pode resultar em frameshift e knockout funcional subsequente de um locus do gene de alta eficiência. 2 Embora este protocolo descreve o uso de ZFNs para criar um gene knockout, a integração de transgenes podem também ser conduzida através homologia dirigido reparo no local do corte ZFN. O CompoZr personalizado ZFN serviço representa uma abordagem sistemática, abrangente e bem caracterizada a edição gene alvo para a comunidade científica com a tecnologia ZFN. Cientistas Sigma trabalhar em estreita colaboração com os investigadores a 1) perfoanálise rm diligência devida, incluindo a análise da estrutura dos genes relevantes, biologia, e um sistema de modelo de acordo com as metas do projeto, 2) aplicar esse conhecimento para desenvolver uma boa estratégia de segmentação, 3), em seguida, projetam, constroem e funcionalmente validar ZFNs para a atividade em um relevante linha celular. O investigador recebe ADN genómico de controlo positivo e os iniciadores, e pronto-a-usar reagentes ZFN fornecidos em ambos DNA de plasmídeo e in vitro formato mRNA transcrito. Estes reagentes podem então ser entregue para expressão transiente em linha do investigador célula ou tipo de célula de escolha. As amostras são então testados para a edição no locus do gene de interesse por técnicas padrão de biologia molecular, incluindo amplificação por PCR, digestão enzimática, e electroforese. Depois de sinal positivo para a edição de gene é detectado na população inicial, as células são de uma única célula clonado e genotipados para a identificação de clones mutantes / alelos.

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

O CompoZr personalizado Zinc-Finger Nuclease de Serviços (ZFN) permite edição genoma preciso em qualquer organismo ou linha de células em qualquer lugar geométrico definido pelo utilizador. Este artigo descreve o processo para a concepção, fabricação, validação e implementação do Serviço CompoZr ZFN personalizada.

Genoma Edição com CompoZr personalizados Nucleases dedo de zinco (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.2K visualizações.  Sigma Life Science. O CompoZr personalizado Zinc-Finger Nuclease de Serviços (ZFN) permite edição genoma preciso em qualquer organismo ou linha de células em qualquer lugar geométrico definido pelo utilizador. Este artigo descreve o processo para a concepção, fabricação, validação e implementação do Serviço CompoZr ZFN personalizada.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biologia

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

A Tátil Estimulador passiva-Dedo automatizada (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Medição da função cerebral Neuromagnetic Em pré-escolares Com Personalizado MEG Sized

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genoma Edição na<em&gt; Mexicanus Astyanax</em&gt; Usando Transcrição Activator-like Effector nucleases (TALENS)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

Avaliação da disponibilidade mineral em rações de peixe usando métodos complementares demonstrados com o exemplo de zinco no salmão atlântico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.