1. Özel ZFN Tasarım Süreci <ol><li> ZFN tasarım sürecini hızlandırmak için, bir araştırmacı vermelidir: </li><ul><li> Bu tür gen adı, tür ve gen açıklama / kimlik numarası olarak hedef geni hakkında bilgi. </li><li> Deney A açıkça ifade üzerinde tüm nesnel (örneğin, Knockout veya Knockin) </li><li> Atipik gen yapısı, genetik odağına karışmış özel biyolojisi veya başka herhangi bir genomu homolog bölgeleri içerir geninin hedef herhangi bir spesifik faktörler. </li><li> Çinko parmak için DNA sırası aralığını hedef nükleazlar. </li></ul><li> Sigma biyoinformatik ekibi ilk çinko parmak hedef siteleri geliştirmek için siliko ZFN tasarım yapar. </li><li> İlk ZFN hedef siteleri ZFN bilimsel, teknik danışman verilmektedir. Teknik açıdan daha karmaşık projeler için bu Sigma bilim Proje stratejisi geliştirmek için araştırmacılar ile çalışır. </li><li&gt; Sigma biyoinformatik ekibi silico ZFN tasarımlar üretmek için ZFN algoritmaları ile bir analizini yapar. Bu, her bir potansiyel ZFN hedef site için bir bütün off-hedef siteler için genom arama, tekrar maskeleme ve SNP analizleri içerir. </li><li> Biyoinformatik inceleme için araştırmacı için üst ZFN hedef siteleri sağlar. Potansiyel ZFN hedef siteleri onayı üzerine, bu bilgiler ZFN imalat işlemine başlamak için ZFN Üretim ekibimiz sağlanır. </li></ol> 2. Özel ZFN Üretim <ol><li> Çinko parmak modüllerinin Sigma arşiv onaylanmış ZFN tasarımlar monte etmek için kullanılır. </li><li> Her ZFN tasarım ve montajı dizisi yüksek kapasite klonlama platformda doğrulanır. </li><li> Tüm ZFN tasarımları üretimi her ZFN tamamlandıktan sonra doğrulama gönderilir. </li></ol> 3. Özel ZFNs Geçerliliği <ol><li> Içinde ZFN projelerinsan, fare, sıçan veya CHO türlerin her bir tür için iyi karakterize hücresi hatlarında doğrulanır, bir maya bazlı analiz diğer organizmalara veya hücre tipleri kullanılır. </li><li> ZFN yapıları nucleofection tarafından uygun bir hücre çizgisi içine dağıtılır ve ZFNs ifade edilir. </li><li> DNA ZFN Transfekte hücre havuzu hasat ve faiz bölge PCR amplifiye olduğu edilir. </li><li> Cel-1 deney daha sonra, PCR ürünleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Jel elektroforez valide ZFN aktiviteye Cel-1 testi çalıştırın. </li><li> Cel-1 testi ile doğruladı, en yüksek aktivite ZFN tasarım daha sonra müşteriye sunulmaktadır. ZFNs bir pozitif kontrol olarak Cel-1 deneyi ve genomik DNA için PCR primerleri ile birlikte mRNA ve plazmid DNA ile temin edilir. </li></ol> 4. Nucleofection tarafından geçerliliği ZFNs teslim <ol><li> 2x10 5 hücre / ml nucleofection bir gün önce bir yoğunlukta tohum hücreleri. </li><li> Nucleofection gününde,Hücre Hattı Nucleofector Takımı V çıkarıp oda sıcaklığına getirin sağlar. </li><li> Üreticinin protokolüne göre Nucleofection Çözelti V takviyesi ekleyin. </li><li> Hücreleri hesaplama. Hücre yoğunluğu 2,5-5x10 5 hücre / ml arasında olmalıdır. </li><li> Önceden nucleofection için en azından 20 dakika süreyle 37 ° C &#39;de bir CO2 inkübatöründe her oyuğa ve pre-ılık orta 2ml sahip bir 6-kuyucuklu plak doldurun. </li><li> 5 dakika 200xg az transfeksiyon başına 2x10 6 hücre (8x10 6 toplam) santrifüjleyin. </li><li> Hank&#39;in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 20 ml ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> Deney tüpleri hazırlayın: (Özel ZFN teknik bülten tabloya bakınız) </li><li> Inkübatör gelen adım (6.5) medya içeren 6-iyi plaka çıkarın. </li><li> Nucleofection Çözüm 400 ul (100 ul / reaksiyon) hücreleri yeniden süspanse edin V. </li><li> Her seferinde bir reaksiyon, her bir DNA veya RNA içeren tüp hücreleri 100 ul ilave edin. Transfuygun bir program içeren bir Nucleofector bir küvet 2 mm ve elektroporasyon nucleofect için er karışımı. </li><li> Hemen her numunenin nucleofection sonra küvetine adımda 6-iyi plaka (6.9) den önceden ısıtılmış orta ~ 500 ul eklemek için bir transfer pipet kullanın. Sonra, 6-kuyucuklu plak içinde kalan önceden ısıtılmış orta küvet hücreleri dikkatli bir şekilde transfer. </li><li> Bütün reaksiyonlar bitirmesini ve 37 ° C&#39;de 2 CO inkübatöre 6-kuyulu plakalı dönmek </li></ol> 5.. ZFNs teslimi sonrası Genomik DNA Hasat <ol><li> 6-iyi plakası - toplanmış bütün hücre hasat yoktur. Bu size Cel-1 sindirim ürünlerinin olduğunu onayladıktan sonra tek hücre seyreltme klon hücreleri olması için kültürü korumak için önemlidir. Bir ila üç gün sonra nucleofection GenElute Memeli Genomik DNA kit&#39;i kullanılarak Miniprep kromozomal DNA hazırlamak için hücreler toplanır. </li></ol> 6. Cel-1 Testi </p&gt; <ol><li> PCR primerleri kullanılarak sağlanan, ZFN transfekte örnekleri ve kiti içinde sağlanan pozitif kontrol genomik DNA&#39;dan genomik DNA&#39;yı çoğaltmak. (Özel ZFN teknik bülten tabloya bakınız): PCR reaksiyonu aşağıdaki koşullar ile kurulur. </li><li> PCR homoduplexes gelen heteroduplexes oluşturmak için her ZFN tedavi numune artı kontrolünden PCR reaksiyonu 10 ul almak ve bir termalcycler aşağıdaki programı kullanabilirsiniz: 95 ° C&#39;de, 10 dakika 95 ° C ila 85 ° C, -2 ° C / dakika 85 ° C ila 25 ° C, -0.1 ° C / dakika 4 ° C, süresiz </li><li> 42 her bir reaksiyon ve inkübe ° C&#39;de 20-40 dakika için artırıcı madde 1 ul ve Nükleaz S 1 ul (Katalog No: 706.025 Transgenomic gelen) eklenir. </li><li> Böyle DirectLoad widerange DNA Ladder (Katalog No: D7058) gibi uygun belirteçler, (Özel ZFN teknik bülteninde sonuçları görmek) ile% 10 SAYFA-TBE jel sindirimler çalıştırın. </li><li> Üzerindece pozitif sinyal cel-I testi ile ZFN tedavi edilen nüfus tespit edilmiş, klonal izolasyonu ve karakterizasyonu geçin. </li></ol> 7. Klonal İzolasyonu ve Karakterizasyonu <ol><li> FACS ve seyreltme klonlama gibi standart yöntemlerle Tek hücreli klon ZFN tedavi örnekleri. </li><li> Klonlar öbekli malzemesi olarak geri kalanı dondurma, genomik DNA hasat için bazı hücrelerin oranı bölmek, sonra yeterince genişletmek için izin verin. </li><li> Cel-I primerler kullanılarak klonlar genomik DNA&#39;yı çoğaltmak ve Cel-I assay (in çivili WT DNA olan ve olmayan) tarafından amplikon analiz, veya alternatif genotipleme doğrudan devam etmek için bu amplikon kullanın. </li><li> Genotipine aday klonlar tercih edilen bir yöntemine göre düzenlenmiş allelleri sahip olarak tanımlanır. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Tüm CompoZr ZFN akışı için bir örnek, Şekil 2&#39;de verilmiştir. ZFNs teslim edilirbunlar, çift-damarlı sonu (DSB) oluşturur uygun bir DNA sekansı ve bağlama çatlatma hücrelere. Doğal onarım sürecini, homolog olmayan (NHEJ), onarım DSB katılmadan bitirmek. Silme, ekleme veya nükleotidlerin yerine bazı durumlarda anormal NHEJ sonuçlarında. Denatürasyon / PCR reaksiyon tavlama aşamasından sonra vahşi tip ve modifiye amplikonlar arasındaki heteroduplex oluşumu hasat genomik DNA sonuçlarının PCR amplifikasyonu. Herhangi bir heteroduplex moleküllerin yarılması in Cel-1 enzim sonuçlar eklenmesi. Cel-1 sonuçları ZFN bölünme onaylamak için PAGE analizi ile çözümlenir. Şekil 3 Cel-1 testi ile beklenen sonuçlar şematik sağlar. Temsilci Cel-1 sonuçları Şekil 4 ve 5&#39;te bulunur Şekil 4 K562 hücrelerinin ZFNs çok aktif bir çift (21%) elde edilen sonuçlar içerir;. Şekil 5&#39;te ZFNs daha az aktif bir çift (% 2.4) elde edilen sonuçlar içerirK562 hücrelerinde. ZFN aktivitesi ebeveyn PCR fragmanı aşağıdaki iki PCR parçaları varlığı ile iki şekil ile teyit edilir. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Bağlı çinko parmak nükleazlar gösterimi. ZFNs FokI restriksiyon endonükleaz arasında bölünme etki kaynaşmış DNA bağlayan bir çinko parmak oluşan proteinler tasarlanmıştır. Heterodimerleri olarak bağlandığında, ZFNs bir kullanıcı belirtilen DNA dizisinin bir çift sarmallı sonu yaratmak. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Özel ZFN Hizmet İş Akışı şematik. CompoZr ZFNs kullanarak genetiği değiştirilmiş hücre dizisi oluşturmak için iş akışı grafik gösterimi. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Cel-1 testi ve sonuçların şematik. A) ZFN plazmid o<html> r mRNA hücreleri teslim edilir. B) ZFNs bind ifade ve hücrelerin bir kısmı bir çift sarmallı sonu (DSB) oluşturarak hedef sahnelerini kestiler. C) homolog olmayan bazı DSBs aberran onarım nükleotid ekleme veya silme sonuçları katılmadan bitirmek. D) Genomik DNA hücrelerin transfekte havuzundan hasat ve ilgi odağı olarak yükseltilir. EF) PCR ürünü denatüre olduğu ve yabani tip ve modifiye amplikonlar arasındaki heteroduplex formasyonu oluşturarak yeniden tavlanır. G) heteroduplex moleküllerin yarılması in Cel-1 uyumsuzluğu endonükleazlar deneyi sonuçları. H) Cel-1 enzimi digests SAYFA çözümlenir. ImageJ yazılım tarafından belirlenir parenteral bandına ayrışma ürünü oranı gözlemlenmiş, fraksiyon kesilmiş ve ZFNs etkinliğini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. % 21 aktif ZFNs gelen Cel-1 sonuçları ImageJ yazılım mevcuttur.:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. % 2.4 aktif ZFNs gelen Cel-1 sonuçları ImageJ yazılım mevcuttur. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol>
	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

Araştırmacılar standart Araştırma Lisans Sözleşmesi kapsamında işbirlikçilerine ZFN değiştirilmiş hücreler veya hayvan sağlayabilir. Bu durumda Sigma bir materyal transfer anlaşması Sigma, ZFN müşteri ve onların işbirlikçisi arasında yerine koymak olduğunu sorar. : Araştırma license adresinde görülebilir <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . ZFN modifiye hücreleri Sigma kullanarak bir ticari uygulama için potansiyel varsa daha sonra bir ticari lisans yerine koymak olduğunu sorar. Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Sigma, Inc tarafından desteklenmektedir

Bir kez ZFN modifiye hücreleri bunlar kalıcı olması ve DNA değişiklikler kalıtsal izole edilmiştir. Araştırma yapmak için istenilen genetik değişiklikler ile stabil bir şekilde değiştirilmiş hücre hatları veya ırk hayvanlar oluşturma yeteneği ile sonuçlanır. CompoZr Özel ZFNs genom hücre tipleri çok çeşitli düzenleme için sağlam bir yöntem sağlar. ZFNs ile düzenleme başarılı genomunun Yayın oluşturmak için yeteneği vardır ama insan hücre hatları, fare, sıçan, Zebra balığı, kurbağa, domuz ve CHO araştırma modelleri ile sınırlı değildir. 3,4,5,6,7,8,9 ZFNs düzgün bir hücreye ulaştığında Belirtilen hücre tipinde istenen hedef yerinde çift sarmallı mola sağlanır. Bir hücrenin içinde birden fazla genetik modifikasyon sahip olmak için bir hücreye sıralı çinko parmak değişiklikler yapmak da mümkün. 10 belirli bir hedef sırası seçin ve yalnızca o belirli odağı birden yaratma yeteneği için birincil nedenidir değiştirme yeteneği modifikatyonlar. Analiz CompoZr Özel ZFN belgesi böylece kiti tüm bileşenleri iyice müşteri başarı için onaylanmıştır güvence altına kiti sağlanan çok reaktifleri ile oluşturulur. Başından sonuna kadar, iş akışının önemli adımlar aşağıda sunulmuştur: Hücre klonlama Belirli bir hücre hattı izole etmek ve genişletmek için yeteneği herhangi bir ZFN deneyler başlamadan önce test edilmelidir. Tek hücreleri izole edilmiş ve bir klon-türevi nüfusu mümkün olduğundan emin olmak için genişletilmiş edilmelidir. Bazı hücre hatları bu konuda inatçı, ve bu şartlı medya ile düzenlenmiş klonlar için zenginleştirme, ya da kültür gibi hileler bu zorlukları aşmak için yardımcı olabilir. Uygulama randımanına Teslimat verimlilik Optimizasyonu ZFNs tesliminden önce bir zorunluluktur. Pek çok yöntem lipid bazlı transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofecti dahil olmak üzere kullanılabileceküzerinde. İdeal dağıtım yöntemi uygulama randımanına ve hücre canlılığı en optimal bir karışım elde edildi oluşur. Bu verimlilikler miktarlarının görsel denetim veya FACS 24-48hrs teslimat sonrası bir GFP kontrolü plazmid ve miktarlarının sunarak tahmin edilebilir. Cel-I testi Bu Cel-I PCR testi, sindirim ve elektroforezi parametreleri ZFN deneyi yorumlanması engel olmayacak emin olmak için uygun kontrollerin paralel olarak yapılır şarttır. Her kit analiz sertifikası Cel-I görüntü oluşturmak için kullanılan kontrolü genomik DNA içerir. Cel-I testi ile takip sağlanan primer ile kontrol DNA Amplifikasyon kullanıcı Analiz Sertifikası (CofA) görüntü kaydıyla birlikte sonuçları karşılaştırmak için, izin ve bir deneme bu açıdan herhangi bir potansiyel verimsizlik izole olacaktır. Böyle bir sahte veya GFP gibi uygun bir negatif kontrol hücre muameleÖrnek aynı zamanda herhangi bir spesifik olmayan parçalanma ürünleri ile aydınlatılması izin verilmelidir. Tek hücreli klon Nicel / nitel analizi ZFN tedavisi ve tek bir hücre Klonlamadan sonra, hücrelerin popülasyonlarının bir dizi yöntem ile, ilgilenilen loküsündeki düzenleme bakımından uygun şekilde taranabilmektedir. Cel-I tayini daha genotipleme için aday klonlar belirlenmesi amacıyla klonlar genomik DNA üzerinde yapılabilir. Bu, bir uygulamadan önce 1:01 oranında Örnek amplikonlar içine spike WT PCR amplikon önemlidir Cel-I homozigot mutant molekülleri klonlar homojen içerecek şekilde sindirilmesi, ve böylece bir negatif Cel-I test sonucu iletir. Bu aday klonlar taranması için alternatif bir yöntem doğrudan ZFN hedef site üzerinde bir PCR primer iniş tasarlamaktır. Kontrol primerler biri ile birlikte kullanılan bir negatif assay sonucu WT sekansı kaybına göstermektedir. En az bir WT alel içeren bir heterozigot klonu y olacaktırield PCR sinyali, fakat SYBR qPCR bağlamında PCR yapılarak tamamen WT klonlar ayrılacaktır olabilir. Aday klonlar yukarıdaki yöntemleri ile tespit edilmiş olan bir kez, standart pyrosequencing, derin sekans, ya da diğer yöntemler ile sekans genotyped edilebilir. Tüm sekanslama için yöntemlerle, klonal genomik DNA oluşturulan bir amplikon oluşturulan edilmelidir. Geleneksel pyrosequencing allelleri için TA-klonlama PCR ürünü ile ayrı ve tek tek koloniler sıralama olabilir. Derin bu adımı sıralama gibi yöntemler için gerekli değildir. Homoloji Yönetmen Onarım (HDR) Bu protokol, NHEJ yoluyla ZFN aracılı gen boşaltma için bir yöntem sağlar. Transgenlerin entegrasyonu da kanadında bir kesim ZFN sitesi. 11. Bu senaryoda, ZFN çift sarmallı mola HDR yerine NHEJ ile tamir edilir oluşturduğunuz homoloji silah ile plazmid bir donör tanıtımı tarafından yapılabilir. HDR i yönettitransgenlerin of ntegration bu protokol içinde yer alan prosedürlere benzer yöntemlerle teyit edilebilir. Sorun Giderme ZFNs teslim ZFN teslimat ve ifade teslim bir GFP veya diğer görselleştirme ve / veya kantitatif için plazmid gibi. Teslimi ile de kontrol edilebilir Ilgi ile hücre tipi organizatörü uyumsuzluğu nedeniyle Düşük ifade mRNA formatında ZFNs teslimi ile çözmek mümkün olabilir. Buna ek olarak, soğuk şok yöntem ayrıca hücreleri ZFNs etkinliğini arttırmak için kullanılabilir. 12 mRNA kullanılması durumunda bu hücreler her serum kaynaklı Rnases çıkarıldı sağlamak için gerçekleştirilmesinden önce yıkanıp şarttır. Bu buz üzerinde mRNA çözülme ve bozulmanın için herhangi bir şansı en aza indirmek için son anda hücrelere eklemek için de isabetli olmuştur. Cel-I testi Cel-I assa temeliy ilgi odağı belirli ve geniş amplifikasyon olduğunu. Non-spesifik amplifikasyon ürünleri gözlenmesi halinde bu şablonu miktarı optimizasyonu, astar konsantrasyon, ve bisiklet parametre olarak özgüllüğü artırmak için standart PCR sorun giderme yordamları kullanın. Ikinci yöntemi yeterli çözünürlük ve hassasiyet sağlamaz gibi standart agaroz elektroforez aksine PAGE analizi yapın. Herhangi sindirilmiş ürünü ya da aşırı bulaşması görülmektedir halinde Cel-I özeti koşulları da optimize edilebilir. Cel-1 nükleaz ve / veya sindirim süresi yeterli uzunluktaki bir miktarının titrasyonu bu yönleri iyileştirmek için titre edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Nükleaz S (Cel-1 enzim) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Yüksek Sadakat PCR Sistemi genişlet </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Hücre Hattı Nucleofector Takımı V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP Endotoksin-Free Plazmid Maxiprep Kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genom düzenleme gen fonksiyonu ve hastalığın genetik temeli aydınlatmak için kullanılan güçlü bir tekniktir. DNA dizilerinin kimyasal tabanlı mutajenez veya rasgele entegrasyonu gibi düzenleme yöntemleri Geleneksel gen genel verimsiz biçimde gelişigüzel genetik değişiklikler görüşmek ve istenmeyen sentetik dizilerinin kuruluş gerektiren veya potansiyel biyolojik çalışmada kafa karıştırıcı, sapkın kültür koşullarının kullanın. Buna karşılık, bir hücreye geçici ZFN ifadesi, hassas kolaylaştırabilir transgenlerin sentetik kimyasalların veya entegrasyon yönetimi için gerek kalmadan çok etkili bir şekilde gen düzenleme kalıtsal. Çinko parmak nükleazlar (ZFNs) çift iplikli DNA (dsDNA), belirgin dizileri bağlanır ve kesilir enzimlerdir. Fonksiyonel bir CompoZr ZFN ünitesi yaklaşık 15-18 nükleotidlerin bir DNA &quot;yarı-site&quot; bağlamak iki ayrı monomerik proteinleri (bkz. Şekil 1) oluşur. Ne zaman iki ZFN monoDNA bölünme etki dimerize ve DNA çift iplikli sonu (DSB). genomunda ZFN aracılı DSBs 1 Giriş yüksek verimli genom düzenleme için bir temel atar oluşturmak onların bitişik hedef sitelerine mers &quot;ev&quot;. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) DNA tamir yolu ile bir hücrede DSBs kusurlu onarım küçük eklemeler ve silmeler (indellerin) neden olabilir. Bu protokolün bir gen eleme oluşturmak için ZFNs kullanımı, transgenlerin entegrasyonu tarif ederken, bir hücrenin geninin kodlayıcı dizisinin içinde indellerin yaratılması da vasıtasıyla yapılabilir frameshift ve yüksek verimle bir gen yerinin. 2 müteakip işlevsel eleme sonuçlanabilir ZFN kesim yerinde homoloji-yönettiği onarım. CompoZr Özel ZFN Servis ZFN teknoloji ile bilimsel topluluk için hedeflenen gen düzenleme için, sistematik, kapsamlı ve iyi karakterize bir yaklaşımı temsil ediyor. Sigma bilim adamları) 1 araştırmacılar ile yakın çalışmak perfoproje hedefleri, 2 uyarınca ilgili gen yapısı, biyoloji ve model sistem analizi) dahil olmak üzere rm özeni analizi daha sonra tasarım, inşa ve işlevsel ilgili bir faaliyet için ZFNs doğrulamak) bir ses hedeflemesi, 3 geliştirmek için bu bilgiyi uygulama hücre hattı. Araştırmacı pozitif kontrol genomik DNA ve astar alır ve plazmid DNA hem de hem de in-vitro transkripsiyon mRNA formatında verilen ZFN reaktifler hazır kullanın. Bu reaktifler sonra araştırıcı hücre hattı veya tercih hücre tipi geçici ifadesi için teslim edilebilir. Örnekler daha sonra, PCR, enzimatik özet ve elektroforez gibi standart moleküler biyoloji teknikleri ile ilgi odağı az gen düzenleme için test edilmektedir. Gen düzenleme için olumlu bir sinyal ilk nüfus tespit edildikten sonra, hücreler klonlanmış tek hücreli ve mutant klonlar / alel belirlenmesi için genotipleme vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.2K Görüntüleme.  Sigma Life Science. CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.

Video: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biyoloji

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

Dokunsal Otomatik Pasif-Parmak Stimülatör (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Özel Ölçekli MEG ile Okul Öncesi Çocuk Neuromagnetic Beyin Fonksiyonu Ölçümleri

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

Atlantik Somonunda Çinko Örneğiyle Gösterilen Tamamlayıcı Yöntemler Kullanılarak Balık Yemlerinde Mineral Kullanılabilirliğinin Değerlendirilmesi

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.