1. Custom ZFN Proceso de Diseño <ol><li> Para acelerar el proceso de diseño ZFN, el investigador debe proporcionar: </li><ul><li> La información sobre el objetivo de genes tales como el nombre de genes, especies y el número de genes anotación / identificación. </li><li> Un declaró claramente por encima de todo-objetivo del experimento (por ejemplo, o el golpe de gracia Knockin) </li><li> Los factores específicos de la diana de genes que incluyen la estructura de genes atípica, biología especial implicado en el locus genético, o cualquier regiones homólogas de otras partes del genoma. </li><li> La gama específica de la secuencia de ADN para el dedo de zinc nucleasas para apuntar. </li></ul><li> El equipo de Sigma bioinformática lleva a cabo in silico de diseño para desarrollar ZFN iniciales de zinc sitios de destino de los dedos. </li><li> Iniciales de los sitios objetivo ZFN se proporcionan a un ZFN consultor técnico científico. Para los proyectos de mayor complejidad técnica, este científico Sigma trabaja con los investigadores para desarrollar la estrategia del proyecto. </li><li&gt; El equipo de bioinformática Sigma lleva a cabo un análisis de algoritmos para generar ZFN in silico diseños ZFN. Esto incluye una búsqueda completa del genoma de los sitios fuera de objetivo, la máscara de la repetición, y el análisis de SNP para cada sitio ZFN objetivo potencial. </li><li> Bioinformática ofrece los mejores sitios ZFN objetivo para el investigador para su revisión. Tras la aprobación de los lugares de destino potenciales ZFN, esta información se proporciona al equipo de producción ZFN para comenzar el proceso de fabricación ZFN. </li></ol> 2. Producción personalizada ZFN <ol><li> El archivo de los módulos de Sigma dedo de zinc se utiliza para montar los diseños ZFN aprobados. </li><li> Cada diseño ZFN está montada y secuencia verificada sobre una plataforma de rendimiento clonación alta. </li><li> Una vez que la producción de todos los diseños ZFN se completa cada ZFN se envía a la validación. </li></ol> 3. Validación de ZFNs personalizados <ol><li> ZFN proyectos enespecies humano, ratón, rata o CHO se validan en líneas celulares bien caracterizadas para cada especie, un ensayo basado en la levadura se utiliza para otros organismos o tipos de células. </li><li> Construcciones ZFN se entregan en la línea celular apropiada por nucleofection y los ZFNs expresan. </li><li> ADN se extrae de la piscina de las células transfectadas ZFN y la región de interés es amplificado por PCR. </li><li> El Cel-1 ensayo se llevó a cabo entonces en el producto de PCR. La electroforesis en gel se ejecuta en el Cel-1 ensayo a la actividad ZFN validado. </li><li> El diseño de la actividad más alta ZFN como se confirma por el ensayo de Cel-1 A continuación se proporcionan para el cliente. ZFNs son entregados en el ARNm y ADN plásmido junto con los cebadores de PCR para el ensayo de Cel-1 y ADN genómico como un control positivo. </li></ol> 4. La entrega de ZFNs Validado por nucleofection <ol><li> Semillas de las células a una densidad de 2x10 5 células / ml el día antes de nucleofection. </li><li> En el día de nucleofection,sacar Línea Celular nucleofector Kit V y deje calentar a temperatura ambiente. </li><li> Agregue el complemento de la solución nucleofection V de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Cuenta las células. La densidad celular debe estar entre 2,5-5x10 5 células / ml. </li><li> Llenar una placa de 6 pocillos con 2 ml de medio en cada pocillo y se pre-calentamiento en una incubadora de CO 2 a 37 ° C durante al menos 20 minutos antes de nucleofection. </li><li> Centrifugar 2x10 6 células por transfección (8x10 6 total) a 200xg durante 5 minutos. </li><li> Lavar las células dos veces con 20 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> Preparar los tubos experimentales: (véase el cuadro personalizado ZFN boletín técnico) </li><li> Retirar la placa de 6 pocillos que contienen los medios de comunicación desde el paso (6,5) de la incubadora. </li><li> Resuspender las células en 400 l (100 l / reacción) de la solución de nucleofection V. </li><li> Una reacción a la vez, añadir 100 ml de células para cada ADN o ARNm tubo que contiene. Transfer la mezcla a una cubeta de electroporación de 2 mm y nucleofect en un nucleofector con el programa apropiado. </li><li> Inmediatamente después de nucleofection de cada muestra, utiliza una pipeta para añadir ~ 500 l de medio precalentado de la placa 6-bien en el paso (6,9) a la cubeta. Entonces, cuidadosamente transferir las células de la cubeta para el medio restante precalentada en la placa de 6 pocillos. </li><li> Terminar todas las reacciones y devolver la placa de 6 pocillos a la incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> 5. La recolección de ADN genómico tras la entrega de ZFNs <ol><li> 6-así placa - no recoger todas las células agrupadas. Es importante mantener la cultura a fin de que las células a solo clon de células de dilución después de confirmar que usted tiene productos Cel-1 digestión. De uno a tres días después de nucleofection recoger las células para preparar ADN cromosómico utilizando el ADN de mamífero genómico GenElute Miniprep kit. </li></ol> 6. Cel.-1 Ensayo </p&gt; <ol><li> Amplificar por PCR del DNA genómico de las muestras de ZFN transfectadas y el ADN genómico de control positivo incluido en el kit, utilizando los cebadores suministrados. La reacción de PCR se configura con las siguientes condiciones: (véase el cuadro personalizado ZFN boletín técnico). </li><li> Para generar heterodúplex de los homodúplex PCR tomar 10 l de reacción de PCR de cada muestra ZFN trata además de un control y utilizar el siguiente programa en un termociclador: 95 ° C, 10 minutos 95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / segundo 85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / segundo 4 ° C, por tiempo indefinido </li><li> Añadir 1 l de potenciador y 1 l de nucleasa S (número de catálogo de Transgenomic 706.025) a cada reacción y se incuba a 42 ° C durante 20-40 minutos. </li><li> Ejecutar las digestiones en un 10% PAGE-TBE gel con marcadores adecuados, tales como escalera DirectLoad ADN WideRange (Número de catálogo D7058) (ver resultados en Custom ZFN boletín técnico). </li><li> Ence la señal positiva se ha detectado en ZFN tratados con las poblaciones por la CEL-I de ensayo, proceder al aislamiento y la caracterización clonal. </li></ol> 7. Aislamiento y caracterización de clones <ol><li> De un solo clon de células de las muestras ZFN tratados por métodos estándar, incluyendo FACS y la clonación de dilución. </li><li> Permita que los clones para ampliar lo suficiente, a continuación, dividir una cierta proporción de las células para la cosecha de ADN genómico, congelando de nuevo el resto como material de bancos. </li><li> Amplificar el ADN genómico de los clones usando los cebadores Cel-I y analizar la amplificación por Cel-I de ensayo (con y sin ADN WT se disparó en), o, alternativamente, utilizar este amplicón de proceder directamente a la determinación del genotipo. </li><li> Genotipo clones candidatos identificados con alelos editados por el método preferido. </li></ol> 8. Los resultados representativos Un ejemplo de la totalidad del flujo de trabajo CompoZr ZFN se presenta en la Figura 2. ZFNs se entregana las células donde se unen y escindir la secuencia de ADN adecuada que crea un salto de doble hebra (OSD). El proceso de reparación natural, de extremos no homólogos (NHEJ), reparaciones del OSD. En algunos casos los resultados aberrantes NHEJ en eliminación, inserción o sustitución de nucleótidos. Amplificación por PCR del DNA genómico cosechado resultados en la formación de heterodúplex entre el tipo salvaje y amplicones modificados después de la desnaturalización / hibridación paso de la reacción de PCR. La adición de los resultados de enzimas Cel-1 en la escisión de las moléculas heterodúplex. Cel-1 resultados se resuelven mediante el análisis PAGE para confirmar la escisión ZFN. Figura 3 proporciona una vista esquemática del ensayo Cel-1 y los resultados esperados. Representativos Cel-1 resultados están contenidos en las figuras 4 y 5 Figura 4 contiene los resultados de un par muy activa de ZFNs (21%) en células K562;. Figura 5 contiene los resultados de un par menos activo (2,4%) de ZFNs enCélulas K562. Actividad ZFN se confirma en ambas figuras por la presencia de dos fragmentos de PCR por debajo del parental fragmento de PCR. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. ZFNs Representación de los plazos nucleasas de dedos de zinc. Se han diseñado compuestos por proteínas dedo de zinc de unión al ADN de dominio fusionado al dominio de corte de la endonucleasa de restricción FokI. Cuando se une como un heterodímero, ZFNs crear un salto de doble cadena en una secuencia de ADN de usuario especificado. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esquema del flujo de trabajo de servicio personalizado ZFN. Representación gráfica del flujo de trabajo para generar una línea de células modificadas genéticamente utilizando ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Esquema del ensayo Cel-1 y los resultados. A) ZFN plásmido o<html> ARNm r es entregado a las células. B) Expresó unen ZFNs y cortar la secuencia objetivo la creación de una rotura de doble cadena (DSB) en una porción de las células. C) la reparación aberrante de algunos DSBs por no unirse a fin homóloga resultados en la inserción o deleción de nucleótidos. D) El ADN genómico se extrae de la piscina de las células transfectadas y amplificada en el locus de interés. FE) del producto de PCR se desnaturaliza y se re-creación de recocido formación de heterodúplex entre el tipo salvaje y amplicones modificados. G) Los Cel-1 desajuste los resultados del ensayo de endonucleasas en la escisión de las moléculas heterodúplex. H) Cel-1 enzima digiere se resuelven por PAGE. La relación observada de producto de escisión a la banda parenteral, determinado por el software ImageJ, indica la fracción de corte y la eficiencia de los ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Cel-1 los resultados de ZFNs 21% activos de software ImageJ está disponible en:._blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Cel-1 los resultados de un 2,4% ZFNs activos de software ImageJ está disponible en:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

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Los investigadores pueden proporcionar ZFN células modificadas o los animales a los colaboradores en el marco del Acuerdo de Investigación Licencia estándar. En esta circunstancia Sigma pide que un acuerdo de transferencia de material se pone en su lugar entre Sigma, el cliente ZFN y su colaborador. La licencia de la investigación pueden consultarse en: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Si hay un potencial para una aplicación comercial que utiliza células modificadas ZFN Sigma luego le pide que la licencia comercial se ponga en marcha. La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por la empresa Sigma, Inc.

Una vez modificados ZFN células son aisladas tienen permanente y hereditaria modificaciones del ADN. Esto da como resultado la capacidad de generar líneas de células establemente modificados o animales de raza con modificaciones genéticas deseadas para llevar a cabo la investigación. CompoZr ZFNs personalizados proporcionan un método robusto para el genoma de edición en una amplia variedad de tipos de células. La publicación del genoma de la edición con éxito ZFNs incluye pero no se limita a las líneas celulares humanas, ratón, rata, el pez cebra, la rana, porcina y los modelos de CHO de investigación. 3,4,5,6,7,8,9 La capacidad de crear un bicatenario descanso en el sitio diana deseado en el tipo de célula especificada está asegurada cuando los ZFNs están debidamente entregado en una celda. También es posible realizar secuenciales modificaciones dedos de zinc a una celda con el fin de tener más de una modificación genética dentro de una célula. 10 La capacidad de seleccionar una secuencia diana específica y sólo modificar ese locus particular, es una causa principal de la capacidad de crear múltiples modificacionescationes. El certificado de ZFN CompoZr personalizado de análisis se genera con los reactivos mismos incluidos en el kit asegurando así que todos los componentes del kit han sido ampliamente validado para el éxito del cliente. Los pasos críticos del flujo de trabajo de principio a fin se presentan a continuación: Clonación celular La capacidad de aislar y expandir una línea celular determinada debe ser probado antes de comenzar cualquier experimento ZFN. Las células individuales deben ser aislados y ampliado para garantizar que una población clonal derivado es posible. Algunas líneas celulares son recalcitrantes en esta materia, y los trucos como el enriquecimiento de los clones editados, o cultura con los medios de comunicación acondicionado pueden ayudar a superar estos retos. Entrega la eficiencia Optimización de la eficiencia en la entrega es una necesidad antes de la entrega de los ZFNs. Muchos métodos se pueden utilizar como base de lípidos de la transfección, electroporación, y nucleofectisucesivamente. El método de entrega ideal se compone de un que permite la mezcla óptima de la eficacia del suministro y la supervivencia celular. La cuantificación de estas eficiencias se puede estimar mediante la entrega de un control de plásmido GFP y cuantificar mediante inspección visual o FACS 24-48hrs después de la entrega. Cel-I de ensayo Es imperativo que Cel-I ensayo se realiza en paralelo con los controles adecuados para asegurar que los parámetros de PCR, la digestión y electroforesis no interfiera con la interpretación de experimento ZFN. Cada kit incluye control de ADN genómico que se utiliza para crear la imagen de Cel-I en el certificado de análisis. La amplificación del ADN con los cebadores de control previstas seguidas por Cel-I del ensayo le permitirá al usuario comparar los resultados con lo establecido en el Certificado de Análisis (COFA) de la imagen, y aislar los posibles ineficiencias en este aspecto de un experimento. Un adecuado control negativo, como una maqueta, o las buenas prácticas agrarias de células tratadasmuestra también deben ser incluidos para permitir la elucidación de los productos de escisión no específicos. Cualitativa / cuantitativa de análisis de una sola célula de los clones Después del tratamiento ZFN y la clonación de células individuales, las poblaciones de células pueden ser examinados para la edición en el locus de interés por un número de métodos. Cel.-I ensayo puede llevarse a cabo en el ADN genómico a partir de clones con el fin de identificar clones candidatos para el genotipado adicional. Es importante espiga WT amplificación de PCR en los amplicones de muestra en una proporción de 1:1 antes de realizar la Cel-I digerir como clones mutantes homocigóticas contendrá moléculas homogéneas, y por lo tanto transmitir una negativa Cel-I ensayo resultado. Un método alternativo para la detección de estos clones candidatos es diseñar un cebador de PCR aterrizaje directamente en el sitio de destino ZFN. Usado en conjunción con uno de los cebadores de control, un resultado del ensayo negativo indica una pérdida de la secuencia de WT. Un clon heterocigoto que contiene al menos un alelo WT na suield PCR señal, pero pueden estar separados de los clones completamente WT mediante la realización de la PCR en el contexto de SYBR qPCR. Una vez que los clones candidatos han sido identificados por los métodos anteriores, se pueden genotipo por pirosecuenciación estándar, la secuenciación de profundidad, u otros métodos de secuenciación. Para todos los métodos de secuenciación, una amplicón creado a partir del ADN genómico clonal debe ser generada. Para alelos pirosecuenciación tradicionales pueden estar separados por TA-clonación del producto de PCR y secuenciación de las colonias individuales. Para los métodos tales como la secuenciación profunda este paso no es necesario. Homología Dirigida Reparación (IDH) Este protocolo proporciona el método de octavos de final ZFN génica mediada a través de NHEJ. La integración de los transgenes también puede llevarse a cabo mediante la introducción de un plásmido donante con los brazos de homología que flanquean un sitio de corte ZFN. 11 En este escenario, el ZFN creó doble cadena rotura sea reparada por el Informe sobre Desarrollo Humano en lugar de NHEJ. Informe sobre Desarrollo Humano que dirigentegración de transgenes puede ser confirmado mediante métodos similares a los procedimientos establecidos a través de este protocolo. Solución de problemas La entrega de ZFNs La entrega ZFN y la expresión de entrega-puede ser controlada por la entrega de un GFP o cualquier otro plásmido para la visualización y / o cuantificación. Bajo la expresión debido a la incompatibilidad promotor con el tipo de células de interés puede ser superado por la entrega de ZFNs en formato ARNm. Además, el método del choque en frío puede ser utilizada para aumentar aún más la eficacia de ZFNs en las células. 12 Si se utiliza ARNm es imperativo que las células se lavan antes de la entrega para asegurar que todos RNasas suero derivados se han eliminado. También es prudente que se descongele el ARNm en el hielo, y añadir el que las células en el último momento para minimizar el riesgo de la degradación. Cel-I de ensayo La fundación de la ASSA Cel-Iy es la amplificación específica y amplia del locus de interés. Si no específicos productos de amplificación se observan uso estándar de los procedimientos de solución de PCR para aumentar la especificidad como la optimización de la cantidad de plantilla, la concentración de iniciador, y el ciclo de los parámetros. Realizar análisis PAGE en oposición a electroforesis en agarosa estándar como el último método no proporciona una resolución adecuada y sensibilidad. Cel.-I Condiciones digerir también puede optimizarse si ningún producto digerido o manchas excesiva que se observa. La valoración de la cantidad de Cel-1 nucleasa y / o la duración del tiempo de digestión se pueden valorar para mejorar estos aspectos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Nucleasa S (Cel-1 Enzima) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Línea Celular nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> AVC-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP libre de endotoxinas Plásmido Kit Maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genoma de edición es una potente técnica que puede utilizarse para dilucidar la función del gen y la base genética de la enfermedad. Gen tradicional de edición de métodos tales como la química basada en la mutagénesis aleatoria o la integración de secuencias de ADN confieren los cambios genéticos indiscriminados de una manera ineficiente en general y requerir la incorporación de secuencias sintéticas no deseados o el uso de aberrantes condiciones de cultivo, lo que podría confundir a los estudios biológicos. Por el contrario, la expresión transitoria ZFN en una célula puede facilitar precisa, heredable edición gen de una manera altamente eficiente sin la necesidad de administración de productos químicos o la integración de los transgenes sintéticos. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) son enzimas que se unen y cortar secuencias diferentes de ADN de doble cadena (dsDNA). Una unidad funcional CompoZr ZFN consta de dos proteínas monoméricas individuales que se unen un ADN &quot;medio-sitio&quot; de aproximadamente 15-18 nucleótidos (ver Figura 1). Cuando dos ZFN monodores &quot;casa&quot; a sus lugares de destino adyacentes a los dominios de escisión del ADN-dímeros y crear un salto de doble cadena (DSB) en el ADN. 1 Introducción de ZFN mediadas DSBs en el genoma establece una base para la edición de genoma altamente eficiente. Reparación imperfecta de DSBs en una celda a través de la de extremos no homólogos a participar (NHEJ) vía de reparación del ADN puede dar lugar a pequeñas inserciones y deleciones (indeles). Creación de indeles dentro de la secuencia del gen codificante de una célula puede resultar en marco de lectura y posterior nocaut funcional de un locus del gen en una alta eficiencia. 2 Aunque este protocolo se describe el uso de ZFNs para crear un gen knockout, la integración de los transgenes también puede llevarse a cabo a través homología dirigida reparación en el sitio de corte ZFN. El CompoZr personalizado ZFN servicio representa un enfoque sistemático, integral y bien caracterizado-en la edición dirigida de genes para la comunidad científica con la tecnología ZFN. Sigma científicos trabajan en estrecha colaboración con los investigadores a 1) perforaciónEl análisis rm debida diligencia incluye el análisis de la estructura del gen correspondiente, la biología, y el sistema de modelo de acuerdo con las metas del proyecto, 2) aplicar este conocimiento para desarrollar una buena estrategia dirigida, 3) a continuación, diseñar, construir, validar y funcionalmente ZFNs para la actividad en una importante la línea celular. El investigador recibe ADN genómico positivo control y cebadores, y listo para usar reactivos ZFN suministrados tanto en el ADN plásmido e in vitro formato ARNm transcrito. Estos reactivos pueden entonces ser entregado para la expresión transitoria en la línea celular del investigador o tipo de célula de elección. Las muestras se ensayan para la edición en el locus del gen de interés mediante técnicas estándar de biología molecular, incluyendo la amplificación por PCR, digestión enzimática, y la electroforesis. Después de señal positiva para la edición de gen se detecta en la población inicial, las células son de una sola célula clonado y genotipo para la identificación de clones mutantes o alelos.

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

El CompoZr personalizado nucleasa dedo de zinc (ZFN) Servicio permite la edición precisa en el genoma de cualquier organismo o línea celular en cualquier lugar definido por el usuario. En este artículo se describe el proceso para el diseño, fabricación, validación e implementación del Servicio de CompoZr ZFN personalizado.

Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.3K vistas.  Sigma Life Science. El CompoZr personalizado nucleasa dedo de zinc (ZFN) Servicio permite la edición precisa en el genoma de cualquier organismo o línea celular en cualquier lugar definido por el usuario. En este artículo se describe el proceso para el diseño, fabricación, validación e implementación del Servicio de CompoZr ZFN personalizado.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Investigación

Biología

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

A táctil automático pasivo-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

La medición de la función cerebral neuromagnetic En Pre-escolar Niños con tamaño personalizado MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iClip - transcriptoma en todo el mapeo de la proteína-ARN interacciones con la Resolución de nucleótidos individuales

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

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