1. תהליך עיצוב מותאם אישית ZFN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזרז את תהליך התכנון ZFN, החוקר צריך לספק: </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידע על הגן היעד כגון שם גנים, מינים, וכן ביאור / מספר זיהוי הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבירור מעל כל מטרת הניסוי (למשל, נוק או הפיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הגורמים הספציפיים של היעד הגן הכוללים מבנה הגן טיפוסית, ביולוגיה מיוחד מעורב לוקוס גנטי, או כל מקום אחר הומולוגיים אזורים בגנום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טווח מסוים של רצף ה-DNA של אצבע אבץ nucleases להתמקד. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צוות ביואינפורמטיקה Sigma עורכת בעיצוב ZFN סיליקו לפתח הראשונים אצבע אבץ אתרי היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד הראשוני אתרים ZFN ניתנים יועץ ZFN טכנית מדעית. עבור פרויקטים מורכבים יותר מבחינה טכנית, זה מדען Sigma עובד עם החוקרים לפתח אסטרטגיית הפרויקט. </li><lאני&gt; צוות ביואינפורמטיקה Sigma מבצעת ניתוח עם אלגוריתמים ZFN ליצור בעיצובים סיליקו ZFN. זה כולל חיפוש הגנום כולו מחוץ היעד אתרים, מיסוך חוזר, וניתוח SNP עבור כל אתר ZFN פוטנציאל היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינפורמטיקה מספקת היעד האתרים המובילים ZFN לחוקר לבדיקה. עם אישור של אתרי מטרה פוטנציאליים ZFN, מידע זה מסופק צוות הפקה ZFN כדי להתחיל את תהליך הייצור ZFN. </li></ol> 2. הייצור מותאם אישית ZFN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארכיון סיגמא של מודולים אצבע אבץ משמש כדי להרכיב את העיצובים ZFN מאושרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב כל ZFN מורכב ורצף אומת על פלטפורמה תפוקה גבוהה שיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייצור של כל העיצובים ZFN הוא להשלים את כל ZFN נשלח אימות. </li></ol> 3. אימות של ZFNs אישית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ZFN פרויקטיםהמין האנושי, עכבר, חולדה או CHO מאומתים על שורות תאים שאפיינו גם עבור כל מין, assay המבוסס על שמרים משמש אורגניזמים אחרים או סוגי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונה ZFN מועברים לתוך קו התא המתאים ידי nucleofection ואת ZFNs באים לידי ביטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA נאסף מתוך מאגר של תאים ZFN transfected והאזור עניין מוגבר PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay-1 CEL מתנהל ואילך מוצר ה-PCR. ג&#39;ל אלקטרופורזה מנוהלת על assay cel-1 לפעילות ZFN תוקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ZFN הגבוהה ביותר בפעילות העיצוב כמו אושר על ידי assay cel-1 מסופק מכן ללקוח. ZFNs מועברות ב-mRNA ו-DNA פלסמיד יחד עם primers ה-PCR עבור assay cel-1 ו-DNA הגנומי כביקורת חיובית. </li></ol> 4. מסירת ZFNs מאומת על ידי Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע התאים בצפיפות של 2x10 5 תאים למ&quot;ל יום לפני nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום nucleofection,להוציא את קו סלולרי Nucleofector ערכת V ולתת חם לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תוספת הפתרון Nucleofection V לפי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים. צפיפות התאים צריך להיות בין 2.5-5x10 5 תאים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת 6-היטב עם 2ml של המדיום בכל היטב מראש חם CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת 2x10 6 תאים לכל transfection (6 בסך הכל 8x10) בשעה 200xg במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם 20 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות הניסוי: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת היטב המכיל 6-Media משלב (6.5) מתוך האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μl 400 (100 μl / התגובה) של פתרון Nucleofection V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים ל-DNA או כל mRNA המכיל צינור. Transfאה את התערובת ל 2 מ&quot;מ electroporation קובט ו nucleofect על Nucleofector עם תוכנית מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר nucleofection של מדגם זה, השתמש פיפטה העברת להוסיף ~ 500 μl של המדיום prewarmed מהצלחת 6-גם בשלב (6.9) כדי קובט. ואז, בזהירות להעביר תאים קובט עד בינוני prewarmed שנותר בצלחת 6 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את כל התגובות ולהחזיר את צלחת 6-היטב CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li></ol> 5. קציר הדנ&quot;א הגנומי לאחר מסירת ZFNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם בצלחת - לא לקצור את כל התאים אספו. חשוב לשמור על תרבות כדי שיהיה תאים לשבט תא בודד דילול לאחר שתוודא כי יש לך מוצרים cel-1 עיכול. אחד עד שלושה ימים לאחר nucleofection לאסוף את התאים כדי להכין את ה-DNA כרומוזומלי באמצעות DNA GenElute היונקים הגנום ערכת Miniprep. </li></ol> 6. Cel-1 Assay </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הדנ&quot;א הגנומי מן דגימות transfected ZFN והשליטה חיובית דנ&quot;א גנומי המסופק בערכה, באמצעות primers המצורף. תגובת PCR מוגדר עם התנאים הבאים: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור heteroduplexes מן homoduplexes ה-PCR לקחת 10 μl של תגובה PCR מכל מדגם ZFN לטפל בתוספת מלאה להשתמש בתוכנית הבאה על thermocycler: 95 מעלות צלזיוס, 10 דקות 95 ° C עד 85 ° C, -2 ° C / 2 85 ° C עד 25 ° C, -0.1 ° C / 2 4 ° C, ללא הגבלת זמן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של משפר ו 1 μl של nuclease S (מ מס &#39;קטלוגי Transgenomic 706025) לתגובה כל דגירה על 42 מעלות צלזיוס במשך 20-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את digestions על ג&#39;ל עמוד TBE 10% עם סמנים מתאימים, כגון סולם WideRange DNA DirectLoad (מק&quot;ט D7058) (ראה תוצאות עלון מותאם אישית טכנית ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלאיתות חיובי לספירה זוהה ZFN שטופלו על ידי אוכלוסיות assay cel-I, המשך בידוד ואפיון משובט ו. </li></ol> 7. בידוד אפיון משובט ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתא בודד לשבט את ZFN שטופלו דגימות בשיטות סטנדרטיות כולל FACS ו שיבוט דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המשובטים להרחיב במידה מספקת, ואז לפצל חלק חלקם של התאים לקציר הדנ&quot;א הגנומי, הקפאת בחזרה את יתרת חומר הפקידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הדנ&quot;א הגנומי מן שיבוטים באמצעות cel-I primers ולנתח amplicon ידי assay cel-I (עם או בלי ה-DNA WT זינק ב), או לחילופין להשתמש amplicon להמשיך ישירות genotyping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המועמד שיבוטים גנוטיפ מזוהה כבעל אללים בעריכת השיטה המועדפת. </li></ol> 8. נציג תוצאות דוגמה כולו CompoZr ZFN העבודה מוצגת באיור 2. ZFNs מועברותלתאים שם נקלטות ודבק את רצף ה-DNA המתאים היוצרת הפסקה פעמיים תקועים (DSB). תהליך התיקון הטבעי, שאינם הומולוגיים בסופו של דבר להצטרף (NHEJ), תיקון DSB. בכמה מקרים חריגים תוצאות NHEJ ב הכניסה מחיקה או החלפה של נוקלאוטידים. PCR הגברה של שנקטפו תוצאות הדנ&quot;א הגנומי במבנה heteroduplex בין סוג פראי amplicons להשתנות אחרי denaturation / צעד חישול התגובה PCR. תוספת של cel-1 תוצאות האנזים המחשוף של כל מולקולות heteroduplex. Cel-1 תוצאות נפתרים על ידי ניתוח עמוד לאשר מחשוף ZFN. איור 3 מספק סכימטי של assay cel-1 ואת התוצאות הצפויות. נציג cel-1 תוצאות כלולים איורים 4 ו -5 איור 4 מכיל תוצאות זוג פעיל מאוד ZFNs (21%) ב K562 תאים,. איור 5 מכיל תוצאות זוג פחות פעילים (2.4%) של ZFNs בK562 תאים. פעילות ZFN הוא אישר דמויות הן על ידי נוכחות של שני קטעי ה-PCR מתחת שבר PCR ההורים. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ZFNs ייצוג nucleases אצבע קשורות אבץ. מתוכננים חלבונים המורכבים אצבע אבץ DNA-binding תחום התמזגו לתחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI. כאשר קשורים כמו heterodimer, ZFNs ליצור הפסקה פעמיים תקועים על רצף DNA מסוים המשתמש. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סכמטי של זרימת עבודה מותאמים אישית ZFN שירות. ייצוג גרפי של זרימת עבודה כדי ליצור קו תאים מהונדסים גנטית באמצעות ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. סכמטי של assay cel-1 ואת התוצאות.) ZFN o פלסמיד<html> mRNA R מועבר לתאים. ב) הביעו לאגד ZFNs וחותכים רצף היעד שלהם ליצור הפסקה גדילי כפול (DSB) בחלק של תאים. ג) תיקון החריג של DSBs מסוימים על ידי אי - שהצטרף בסופו של הומולוגיים התוצאות הכניסה נוקלאוטיד או מחיקה. D) הדנ&quot;א הגנומי נאסף ממאגר transfected של תאים מוגבר על מוקד של עניין. EF) PCR המוצר הוא מפוגל מחדש מרותק יצירת היווצרות heteroduplex בין סוג פראי amplicons שונה. ז) cel-1 endonuclease אי התאמה ב assay תוצאות המחשוף של מולקולות heteroduplex. ע) cel-1 אנזים מעכל נפתרות על ידי. היחס הנצפה של המוצר מחשוף ללהקה Parenteral, נקבע על ידי ImageJ תוכנה, מציין לחתוך חלק והיעילות של ZFNs את. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="איור 4" /> באיור 4. Cel-1 נובע ZFNs פעילים 21% התוכנה ImageJ זמין בכתובת:._blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. Cel-1 נובע% 2.4 ZFNs פעילים ImageJ התוכנה ניתן למצוא באתר:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

<ol>
	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

החוקרים יכולים לספק תאים מהונדסים ZFN או בעלי חיים משתפי פעולה במסגרת הסכם מחקר סטנדרטי הרישיון. בנסיבות הזה Sigma שואל כי הסכם העברת החומר לשים במקום בין סיגמא, הלקוח ZFN ושותפו שלהם. רישיון המחקר ניתן לצפות ב: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . אם יש אפשרות של יישום מסחרי באמצעות ZFN שונה תאים Sigma ואז מבקש רישיון מסחרי מוצבת במקום. הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Sigma, Inc

פעם ZFN-Modified תאים מבודדים להם קבוע תורשתי שינוי ה-DNA. התוצאה היא היכולת ליצור שורות תאים מהונדסים ביציבות או בעלי חיים גזע עם שינויים גנטיים הרצוי לערוך מחקר. CompoZr ZFNs מותאמים אישית לספק שיטה יציבה עבור עריכת הגנום במגוון רחב של סוגי תאים. פרסום הגנום מוצלחת עם עורך ZFNs כולל אך לא מוגבל ל שורות תאים אנושיים, עכבר, חולדה, דג הזברה, צפרדע, חזירי ומודלים צ מחקר. 3,4,5,6,7,8,9 היכולת ליצור פעמיים תקועים הפסקה באתר היעד הרצוי בסוג תא מסוים מובטח כאשר ZFNs מועברות כמו שצריך אל תוך התא. כמו כן, ניתן לבצע עוקבים אצבע שינויים אבץ לתא כדי שיהיה יותר הנדסה גנטית בתוך תא. 10 היכולת לבחור רצף יעד ספציפי ורק לשנות את מוקד מסוים הוא הגורם העיקרי היכולת ליצור מספר רב של modifiקטיונים. אישית CompoZr תעודת ZFN ניתוח נוצרת עם ריאגנטים במיוחד המסופק בערכה ובכך להבטיח כי כל מרכיבי הערכה אומתו באופן יסודי להצלחת הלקוח. השלבים הקריטיים של זרימת העבודה מתחילתו ועד סופו מוצגים להלן: התא שיבוט היכולת לבודד להרחיב את קו תא נתון יש לבדוק לפני תחילת כל הניסויים ZFN. תאים בודדים יש לבודד והרחיב על מנת להבטיח כי האוכלוסייה clonally הנגזרות אפשרי. כמה שורות תאים הם הסרבן בעניין זה, ועל טריקים כגון העשרה שיבוטים ערוכים, או תרבות עם התקשורת מיזוג יכול לעזור להתגבר על אתגרים אלה. משלוח יעילות אופטימיזציה של יעילות האספקה ​​היא חובה לפני מסירת ZFNs את. שיטות רבות ניתן להשתמש גם transfection השומנים מבוסס, electroporation, ו nucleofectiב. שיטת הצגה אידיאלית מורכבת זו מאפשרת את השילוב האופטימלי ביותר של יעילות מסירה הישרדות התא. Quantitating אלה יעילות ניתן להעריך על ידי אספקת שליטה GFP פלסמיד ו quantitating על ידי בדיקה ויזואלית או FACS 24-48hrs שלאחר הלידה. Cel-I assay זוהי חובתו של cel-assay אני מתבצע במקביל הבקרות המתאימות על מנת להבטיח כי הפרמטרים PCR, מערכת העיכול, וכן אלקטרופורזה לא יפריע פרשנות של הניסוי ZFN. כל ערכה כוללת בקרת DNA הגנומי שבו נעשה שימוש כדי ליצור את התמונה cel-I באישור של ניתוח. הגברה מ-DNA השליטה עם primers הניתנים ואחריו assay cel-I תאפשר למשתמש להשוות את התוצאות עם זה המסופק תעודת ניתוח (CofA) תמונה, ולבודד כל חוסר יעילות פוטנציאליים היבט זה של הניסוי. שליטה שליליות מתאימות כגון מעושה, או GFP טיפול בתאמדגם יש לכלול גם לאפשר הבהרה של כל המוצרים שאינם ספציפיים מחשוף. איכותי / כמותי וניתוח של תא יחיד שיבוטים לאחר הטיפול ZFN ו שיבוט תא בודד, אוכלוסיות של תאים עשויים להיות מוקרן לעריכה על מוקד של עניין על ידי מספר שיטות. Cel-assay אני יכול להתנהל על הדנ&quot;א הגנומי של שיבוטים לצורך זיהוי שיבוטים המועמד עבור genotyping נוסף. חשוב amplicon ספייק PCR WT לתוך amplicons מדגם ביחס 1:01 לפני ביצוע cel-I לעיכול כמו שיבוטים מוטציה הומוזיגוטים יכיל מולקולות הומוגניות, ובכך להעביר תוצאה שלילית cel-I assay. שיטה חלופית לסינון מועמדים אלה שיבוטים היא לעצב 1 הנחיתה PCR פריימר ישירות באתר היעד ZFN. הפועל בשיתוף עם אחד primers שליטה, תוצאה assay שלילי מצביע על אובדן הרצף WT. שיבוט הטרוזיגוטיים המכיל לפחות אלל WT יהיה yIELD PCR האות, אבל יכול להיות מופרדים מן שיבוטים WT באופן מלא על ידי ביצוע PCR בהקשר של SYBR QPCR. לאחר שיבוטים המועמד זוהו על ידי השיטות הנ&quot;ל, ניתן genotyped ידי pyrosequencing רגיל, סידור עמוק, או רצף שיטות אחרות. לכל שיטות רצף, amplicon נוצר מ-DNA גנומי משובט צריך להיות שנוצר. עבור אללים pyrosequencing המסורתיים ניתן הפרדה לפי המוצר ת&quot;א שיבוט PCR, ו רצף המושבות בודדים. שיטות כגון עמוק רצף שלב זה אינו הכרחי. הומולוגיה תיקון בימוי (HDR) פרוטוקול זה מספק שיטה בנוקאאוט גן ZFN מתווכת דרך NHEJ. שילוב transgenes ניתן גם שנערך על ידי הכנסת התורם פלסמיד בזרועות הומולוגיה כי האגף חתך ZFN באתר. 11 בתרחיש זה, ZFN נוצר פעמיים תקועים הפסקה תוקן על ידי HDR במקום NHEJ. HDR מכוונת אניntegration של transgenes ניתן אישר שימוש בשיטות דומות בהליכים הניתנים בכל פרוטוקול זה. פתרון בעיות מסירת ZFNs משלוח ZFN וביטוי משלוח יכול להיות נשלט על ידי אספקה ​​של ה-GFP או אחר כגון פלסמיד עבור להדמיה / או לכמת. ביטוי נמוך בשל חוסר תאימות עם מקדם סוג התא של עניין ניתן להתגבר על ידי אספקה ​​של ZFNs בפורמט ה-mRNA. בנוסף, שיטת ההלם הקר עשוי להיות מנוצל כדי להגביר עוד יותר את היעילות של ZFNs בתאים. 12 אם mRNA משמש זוהי חובתו של תאים נשטפים לפני המסירה על מנת להבטיח את כל סרום הנגזרות Rnases הוסרו. כמו כן, נבון להפשיר את ה-mRNA על קרח, ולהוסיף אותו אל התאים ברגע האחרון ממש כדי למזער כל סיכוי השפלה. Cel-I assay קרן של אסא cel-Iy הוא הגברה ספציפי נרחב של מוקד של עניין. אם לא מוגדרים מוצרים הגברה הם נצפו להשתמש תקן ה-PCR הליכי פתרון בעיות כדי להגדיל את הספציפיות כגון אופטימיזציה של כמות תבנית, ריכוז פריימר, ורכיבה על אופניים פרמטרים. ביצוע ניתוח PAGE לעומת agarose אלקטרופורזה רגילה שיטה זו האחרונה אינה מספקת רזולוציה רגישות נאותים. Cel-I תנאים לקט עשוי גם להיות מותאם אם לא מתעכל המוצר או מריחות מוגזמת הוא ציין. טיטרציה של כמות cel-1 nuclease ו / או משך זמן העיכול ניתן טיטרציה כדי לשפר את ההיבטים האלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Nuclease S (cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> להרחיב את נאמנות גבוהה PCR מערכת </td><td> רוש </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> שורת תאים Nucleofector ערכת V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP רעלן פנימי, חינם הפלסמיד Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

הגנום עריכה היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי להבהיר את תפקיד הגן ואת הבסיס הגנטי של המחלה. הגן המסורתית עריכת שיטות כגון mutagenesis הכימי מבוסס או שילוב אקראי של רצפי DNA להעניק שינויים גנטיים חסרות הבחנה בצורה יעילה הכוללת ודורשים שילוב של רצפים סינתטיים לא רצויים או שימוש התנאים תרבות חריגים, פוטנציאל מבלבל המחקר הביולוגי. לעומת זאת, הביטוי ZFN חולפת בתא יכול להקל מדויק, תורשתי עריכת הגן בצורה היעילה ביותר ללא צורך בממשל של כימיקלים או שילוב של transgenes סינתטיים. Nucleases אצבע אבץ (ZFNs) הם אנזימים אשר נקלטות וחותכים רצפים שונים של גדילי הדנ&quot;א הכפול (dsDNA). יחידה תפקודית CompoZr ZFN מורכב משני חלבונים monomeric בודדים אשר נקלטות על ידי ה-DNA &quot;חצי אתר&quot; של כ 15-18 נוקלאוטידים (ראה איור 1). כאשר 2 ZFN מונומרס &quot;בית&quot; לאתרים סמוכים היעד שלהם את ה-DNA מחשוף תחומים dimerize וליצור הפסקה הגדיל פעמיים (DSB) ב-DNA. 1 מבוא של ZFN בתיווך DSBs בגנום מניח היסודות עריכת הגנום היעילה ביותר. תיקון מושלם של DSBs בתא דרך לא הומולוגיים בסוף שהצטרף מסלול (NHEJ) תיקון דנ&quot;א יכול לגרום הוספות קטנות ומחיקות (indels). יצירת indels בתוך רצף הגן המקודד של התא יכול לגרום frameshift ו בנוקאאוט תפקודית הבאות של לוקוס הגן על יעילות גבוהה. 2 אמנם פרוטוקול זה מתאר את השימוש ZFNs ליצור פצצה גן, שילוב של transgenes יכול גם להתנהל דרך הומולוגיה מכוונת לתיקון במקום לחתוך ZFN. אישית CompoZr ZFN שירות מייצג גישה שיטתית, מקיפה, היטב מאופיין לעריכה הגן ממוקד עבור הקהילה המדעית עם הטכנולוגיה ZFN. מדענים סיגמא לעבוד בשיתוף פעולה הדוק עם חוקרים 1) perfoבדיקת RM ניתוח בשל כולל ניתוח של מבנה הגן ביולוגיה רלוונטי,, ​​מערכת מודל בהתאם מטרות הפרויקט, 2) ליישם את הידע הזה כדי לפתח אסטרטגיה קול מיקוד, 3) ואז לתכנן, לבנות, והן מבחינה תפקודית לאמת ZFNs לפעילות רלוונטי התא קו. החוקר מקבל שליטה חיובית הדנ&quot;א הגנומי primers, ומוכן לשימוש ריאגנטים ZFN שסופקו ב-DNA הן הפלסמיד ואת חוץ גופית בפורמט ה-mRNA עיבד. ריאגנטים אלה עשויים אז להיות מועברת לביטוי חולף בתור תא של החוקר או סוג תא של בחירה. דגימות נבדקו אז מוקד של עניין קנה מידה בטכניקות ביולוגיה מולקולרית כולל הגברה PCR, תקציר האנזימטית, ו אלקטרופורזה לעריכה הגן. לאחר איתות חיובי עבור עריכת הגן מזוהה בקרב האוכלוסייה הראשונית, הם תאים מתא בודד לשכפל ו genotyped לזיהוי של שיבוטים / אללים מוטנטים.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.2K Views.  Sigma Life Science. אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

Video: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

ממריץ משושי אוטומטי פסיבי-Finger (ברזים)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

מדידה של תפקוד המוח Neuromagnetic ב טרום בית ספר לילדים עם מג בגודל מותאם אישית

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

הערכת זמינות המינרלים בהזנות דגים בשיטות משלימות המודגמת עם הדוגמה של אבץ בסלמון אטלנטי

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.