1. תהליך עיצוב מותאם אישית ZFN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזרז את תהליך התכנון ZFN, החוקר צריך לספק: </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידע על הגן היעד כגון שם גנים, מינים, וכן ביאור / מספר זיהוי הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבירור מעל כל מטרת הניסוי (למשל, נוק או הפיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הגורמים הספציפיים של היעד הגן הכוללים מבנה הגן טיפוסית, ביולוגיה מיוחד מעורב לוקוס גנטי, או כל מקום אחר הומולוגיים אזורים בגנום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טווח מסוים של רצף ה-DNA של אצבע אבץ nucleases להתמקד. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צוות ביואינפורמטיקה Sigma עורכת בעיצוב ZFN סיליקו לפתח הראשונים אצבע אבץ אתרי היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד הראשוני אתרים ZFN ניתנים יועץ ZFN טכנית מדעית. עבור פרויקטים מורכבים יותר מבחינה טכנית, זה מדען Sigma עובד עם החוקרים לפתח אסטרטגיית הפרויקט. </li><lאני&gt; צוות ביואינפורמטיקה Sigma מבצעת ניתוח עם אלגוריתמים ZFN ליצור בעיצובים סיליקו ZFN. זה כולל חיפוש הגנום כולו מחוץ היעד אתרים, מיסוך חוזר, וניתוח SNP עבור כל אתר ZFN פוטנציאל היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינפורמטיקה מספקת היעד האתרים המובילים ZFN לחוקר לבדיקה. עם אישור של אתרי מטרה פוטנציאליים ZFN, מידע זה מסופק צוות הפקה ZFN כדי להתחיל את תהליך הייצור ZFN. </li></ol> 2. הייצור מותאם אישית ZFN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארכיון סיגמא של מודולים אצבע אבץ משמש כדי להרכיב את העיצובים ZFN מאושרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב כל ZFN מורכב ורצף אומת על פלטפורמה תפוקה גבוהה שיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייצור של כל העיצובים ZFN הוא להשלים את כל ZFN נשלח אימות. </li></ol> 3. אימות של ZFNs אישית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ZFN פרויקטיםהמין האנושי, עכבר, חולדה או CHO מאומתים על שורות תאים שאפיינו גם עבור כל מין, assay המבוסס על שמרים משמש אורגניזמים אחרים או סוגי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונה ZFN מועברים לתוך קו התא המתאים ידי nucleofection ואת ZFNs באים לידי ביטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA נאסף מתוך מאגר של תאים ZFN transfected והאזור עניין מוגבר PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay-1 CEL מתנהל ואילך מוצר ה-PCR. ג&#39;ל אלקטרופורזה מנוהלת על assay cel-1 לפעילות ZFN תוקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ZFN הגבוהה ביותר בפעילות העיצוב כמו אושר על ידי assay cel-1 מסופק מכן ללקוח. ZFNs מועברות ב-mRNA ו-DNA פלסמיד יחד עם primers ה-PCR עבור assay cel-1 ו-DNA הגנומי כביקורת חיובית. </li></ol> 4. מסירת ZFNs מאומת על ידי Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע התאים בצפיפות של 2x10 5 תאים למ&quot;ל יום לפני nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום nucleofection,להוציא את קו סלולרי Nucleofector ערכת V ולתת חם לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תוספת הפתרון Nucleofection V לפי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים. צפיפות התאים צריך להיות בין 2.5-5x10 5 תאים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת 6-היטב עם 2ml של המדיום בכל היטב מראש חם CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת 2x10 6 תאים לכל transfection (6 בסך הכל 8x10) בשעה 200xg במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם 20 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות הניסוי: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת היטב המכיל 6-Media משלב (6.5) מתוך האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μl 400 (100 μl / התגובה) של פתרון Nucleofection V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים ל-DNA או כל mRNA המכיל צינור. Transfאה את התערובת ל 2 מ&quot;מ electroporation קובט ו nucleofect על Nucleofector עם תוכנית מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר nucleofection של מדגם זה, השתמש פיפטה העברת להוסיף ~ 500 μl של המדיום prewarmed מהצלחת 6-גם בשלב (6.9) כדי קובט. ואז, בזהירות להעביר תאים קובט עד בינוני prewarmed שנותר בצלחת 6 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את כל התגובות ולהחזיר את צלחת 6-היטב CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li></ol> 5. קציר הדנ&quot;א הגנומי לאחר מסירת ZFNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם בצלחת - לא לקצור את כל התאים אספו. חשוב לשמור על תרבות כדי שיהיה תאים לשבט תא בודד דילול לאחר שתוודא כי יש לך מוצרים cel-1 עיכול. אחד עד שלושה ימים לאחר nucleofection לאסוף את התאים כדי להכין את ה-DNA כרומוזומלי באמצעות DNA GenElute היונקים הגנום ערכת Miniprep. </li></ol> 6. Cel-1 Assay </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הדנ&quot;א הגנומי מן דגימות transfected ZFN והשליטה חיובית דנ&quot;א גנומי המסופק בערכה, באמצעות primers המצורף. תגובת PCR מוגדר עם התנאים הבאים: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור heteroduplexes מן homoduplexes ה-PCR לקחת 10 μl של תגובה PCR מכל מדגם ZFN לטפל בתוספת מלאה להשתמש בתוכנית הבאה על thermocycler: 95 מעלות צלזיוס, 10 דקות 95 ° C עד 85 ° C, -2 ° C / 2 85 ° C עד 25 ° C, -0.1 ° C / 2 4 ° C, ללא הגבלת זמן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של משפר ו 1 μl של nuclease S (מ מס &#39;קטלוגי Transgenomic 706025) לתגובה כל דגירה על 42 מעלות צלזיוס במשך 20-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את digestions על ג&#39;ל עמוד TBE 10% עם סמנים מתאימים, כגון סולם WideRange DNA DirectLoad (מק&quot;ט D7058) (ראה תוצאות עלון מותאם אישית טכנית ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלאיתות חיובי לספירה זוהה ZFN שטופלו על ידי אוכלוסיות assay cel-I, המשך בידוד ואפיון משובט ו. </li></ol> 7. בידוד אפיון משובט ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתא בודד לשבט את ZFN שטופלו דגימות בשיטות סטנדרטיות כולל FACS ו שיבוט דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המשובטים להרחיב במידה מספקת, ואז לפצל חלק חלקם של התאים לקציר הדנ&quot;א הגנומי, הקפאת בחזרה את יתרת חומר הפקידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הדנ&quot;א הגנומי מן שיבוטים באמצעות cel-I primers ולנתח amplicon ידי assay cel-I (עם או בלי ה-DNA WT זינק ב), או לחילופין להשתמש amplicon להמשיך ישירות genotyping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המועמד שיבוטים גנוטיפ מזוהה כבעל אללים בעריכת השיטה המועדפת. </li></ol> 8. נציג תוצאות דוגמה כולו CompoZr ZFN העבודה מוצגת באיור 2. ZFNs מועברותלתאים שם נקלטות ודבק את רצף ה-DNA המתאים היוצרת הפסקה פעמיים תקועים (DSB). תהליך התיקון הטבעי, שאינם הומולוגיים בסופו של דבר להצטרף (NHEJ), תיקון DSB. בכמה מקרים חריגים תוצאות NHEJ ב הכניסה מחיקה או החלפה של נוקלאוטידים. PCR הגברה של שנקטפו תוצאות הדנ&quot;א הגנומי במבנה heteroduplex בין סוג פראי amplicons להשתנות אחרי denaturation / צעד חישול התגובה PCR. תוספת של cel-1 תוצאות האנזים המחשוף של כל מולקולות heteroduplex. Cel-1 תוצאות נפתרים על ידי ניתוח עמוד לאשר מחשוף ZFN. איור 3 מספק סכימטי של assay cel-1 ואת התוצאות הצפויות. נציג cel-1 תוצאות כלולים איורים 4 ו -5 איור 4 מכיל תוצאות זוג פעיל מאוד ZFNs (21%) ב K562 תאים,. איור 5 מכיל תוצאות זוג פחות פעילים (2.4%) של ZFNs בK562 תאים. פעילות ZFN הוא אישר דמויות הן על ידי נוכחות של שני קטעי ה-PCR מתחת שבר PCR ההורים. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ZFNs ייצוג nucleases אצבע קשורות אבץ. מתוכננים חלבונים המורכבים אצבע אבץ DNA-binding תחום התמזגו לתחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI. כאשר קשורים כמו heterodimer, ZFNs ליצור הפסקה פעמיים תקועים על רצף DNA מסוים המשתמש. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סכמטי של זרימת עבודה מותאמים אישית ZFN שירות. ייצוג גרפי של זרימת עבודה כדי ליצור קו תאים מהונדסים גנטית באמצעות ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. סכמטי של assay cel-1 ואת התוצאות.) ZFN o פלסמיד<html> mRNA R מועבר לתאים. ב) הביעו לאגד ZFNs וחותכים רצף היעד שלהם ליצור הפסקה גדילי כפול (DSB) בחלק של תאים. ג) תיקון החריג של DSBs מסוימים על ידי אי - שהצטרף בסופו של הומולוגיים התוצאות הכניסה נוקלאוטיד או מחיקה. D) הדנ&quot;א הגנומי נאסף ממאגר transfected של תאים מוגבר על מוקד של עניין. EF) PCR המוצר הוא מפוגל מחדש מרותק יצירת היווצרות heteroduplex בין סוג פראי amplicons שונה. ז) cel-1 endonuclease אי התאמה ב assay תוצאות המחשוף של מולקולות heteroduplex. ע) cel-1 אנזים מעכל נפתרות על ידי. היחס הנצפה של המוצר מחשוף ללהקה Parenteral, נקבע על ידי ImageJ תוכנה, מציין לחתוך חלק והיעילות של ZFNs את. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="איור 4" /> באיור 4. Cel-1 נובע ZFNs פעילים 21% התוכנה ImageJ זמין בכתובת:._blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. Cel-1 נובע% 2.4 ZFNs פעילים ImageJ התוכנה ניתן למצוא באתר:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

<ol>
	<li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li><li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases.">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases.">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).</li><li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases.">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433 (2009).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li><li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li><li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases.">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li><li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li><li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases.">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li><li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases.">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li><li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption.">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li></ol>

החוקרים יכולים לספק תאים מהונדסים ZFN או בעלי חיים משתפי פעולה במסגרת הסכם מחקר סטנדרטי הרישיון. בנסיבות הזה Sigma שואל כי הסכם העברת החומר לשים במקום בין סיגמא, הלקוח ZFN ושותפו שלהם. רישיון המחקר ניתן לצפות ב: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . אם יש אפשרות של יישום מסחרי באמצעות ZFN שונה תאים Sigma ואז מבקש רישיון מסחרי מוצבת במקום. הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Sigma, Inc

פעם ZFN-Modified תאים מבודדים להם קבוע תורשתי שינוי ה-DNA. התוצאה היא היכולת ליצור שורות תאים מהונדסים ביציבות או בעלי חיים גזע עם שינויים גנטיים הרצוי לערוך מחקר. CompoZr ZFNs מותאמים אישית לספק שיטה יציבה עבור עריכת הגנום במגוון רחב של סוגי תאים. פרסום הגנום מוצלחת עם עורך ZFNs כולל אך לא מוגבל ל שורות תאים אנושיים, עכבר, חולדה, דג הזברה, צפרדע, חזירי ומודלים צ מחקר. 3,4,5,6,7,8,9 היכולת ליצור פעמיים תקועים הפסקה באתר היעד הרצוי בסוג תא מסוים מובטח כאשר ZFNs מועברות כמו שצריך אל תוך התא. כמו כן, ניתן לבצע עוקבים אצבע שינויים אבץ לתא כדי שיהיה יותר הנדסה גנטית בתוך תא. 10 היכולת לבחור רצף יעד ספציפי ורק לשנות את מוקד מסוים הוא הגורם העיקרי היכולת ליצור מספר רב של modifiקטיונים. אישית CompoZr תעודת ZFN ניתוח נוצרת עם ריאגנטים במיוחד המסופק בערכה ובכך להבטיח כי כל מרכיבי הערכה אומתו באופן יסודי להצלחת הלקוח. השלבים הקריטיים של זרימת העבודה מתחילתו ועד סופו מוצגים להלן: התא שיבוט היכולת לבודד להרחיב את קו תא נתון יש לבדוק לפני תחילת כל הניסויים ZFN. תאים בודדים יש לבודד והרחיב על מנת להבטיח כי האוכלוסייה clonally הנגזרות אפשרי. כמה שורות תאים הם הסרבן בעניין זה, ועל טריקים כגון העשרה שיבוטים ערוכים, או תרבות עם התקשורת מיזוג יכול לעזור להתגבר על אתגרים אלה. משלוח יעילות אופטימיזציה של יעילות האספקה ​​היא חובה לפני מסירת ZFNs את. שיטות רבות ניתן להשתמש גם transfection השומנים מבוסס, electroporation, ו nucleofectiב. שיטת הצגה אידיאלית מורכבת זו מאפשרת את השילוב האופטימלי ביותר של יעילות מסירה הישרדות התא. Quantitating אלה יעילות ניתן להעריך על ידי אספקת שליטה GFP פלסמיד ו quantitating על ידי בדיקה ויזואלית או FACS 24-48hrs שלאחר הלידה. Cel-I assay זוהי חובתו של cel-assay אני מתבצע במקביל הבקרות המתאימות על מנת להבטיח כי הפרמטרים PCR, מערכת העיכול, וכן אלקטרופורזה לא יפריע פרשנות של הניסוי ZFN. כל ערכה כוללת בקרת DNA הגנומי שבו נעשה שימוש כדי ליצור את התמונה cel-I באישור של ניתוח. הגברה מ-DNA השליטה עם primers הניתנים ואחריו assay cel-I תאפשר למשתמש להשוות את התוצאות עם זה המסופק תעודת ניתוח (CofA) תמונה, ולבודד כל חוסר יעילות פוטנציאליים היבט זה של הניסוי. שליטה שליליות מתאימות כגון מעושה, או GFP טיפול בתאמדגם יש לכלול גם לאפשר הבהרה של כל המוצרים שאינם ספציפיים מחשוף. איכותי / כמותי וניתוח של תא יחיד שיבוטים לאחר הטיפול ZFN ו שיבוט תא בודד, אוכלוסיות של תאים עשויים להיות מוקרן לעריכה על מוקד של עניין על ידי מספר שיטות. Cel-assay אני יכול להתנהל על הדנ&quot;א הגנומי של שיבוטים לצורך זיהוי שיבוטים המועמד עבור genotyping נוסף. חשוב amplicon ספייק PCR WT לתוך amplicons מדגם ביחס 1:01 לפני ביצוע cel-I לעיכול כמו שיבוטים מוטציה הומוזיגוטים יכיל מולקולות הומוגניות, ובכך להעביר תוצאה שלילית cel-I assay. שיטה חלופית לסינון מועמדים אלה שיבוטים היא לעצב 1 הנחיתה PCR פריימר ישירות באתר היעד ZFN. הפועל בשיתוף עם אחד primers שליטה, תוצאה assay שלילי מצביע על אובדן הרצף WT. שיבוט הטרוזיגוטיים המכיל לפחות אלל WT יהיה yIELD PCR האות, אבל יכול להיות מופרדים מן שיבוטים WT באופן מלא על ידי ביצוע PCR בהקשר של SYBR QPCR. לאחר שיבוטים המועמד זוהו על ידי השיטות הנ&quot;ל, ניתן genotyped ידי pyrosequencing רגיל, סידור עמוק, או רצף שיטות אחרות. לכל שיטות רצף, amplicon נוצר מ-DNA גנומי משובט צריך להיות שנוצר. עבור אללים pyrosequencing המסורתיים ניתן הפרדה לפי המוצר ת&quot;א שיבוט PCR, ו רצף המושבות בודדים. שיטות כגון עמוק רצף שלב זה אינו הכרחי. הומולוגיה תיקון בימוי (HDR) פרוטוקול זה מספק שיטה בנוקאאוט גן ZFN מתווכת דרך NHEJ. שילוב transgenes ניתן גם שנערך על ידי הכנסת התורם פלסמיד בזרועות הומולוגיה כי האגף חתך ZFN באתר. 11 בתרחיש זה, ZFN נוצר פעמיים תקועים הפסקה תוקן על ידי HDR במקום NHEJ. HDR מכוונת אניntegration של transgenes ניתן אישר שימוש בשיטות דומות בהליכים הניתנים בכל פרוטוקול זה. פתרון בעיות מסירת ZFNs משלוח ZFN וביטוי משלוח יכול להיות נשלט על ידי אספקה ​​של ה-GFP או אחר כגון פלסמיד עבור להדמיה / או לכמת. ביטוי נמוך בשל חוסר תאימות עם מקדם סוג התא של עניין ניתן להתגבר על ידי אספקה ​​של ZFNs בפורמט ה-mRNA. בנוסף, שיטת ההלם הקר עשוי להיות מנוצל כדי להגביר עוד יותר את היעילות של ZFNs בתאים. 12 אם mRNA משמש זוהי חובתו של תאים נשטפים לפני המסירה על מנת להבטיח את כל סרום הנגזרות Rnases הוסרו. כמו כן, נבון להפשיר את ה-mRNA על קרח, ולהוסיף אותו אל התאים ברגע האחרון ממש כדי למזער כל סיכוי השפלה. Cel-I assay קרן של אסא cel-Iy הוא הגברה ספציפי נרחב של מוקד של עניין. אם לא מוגדרים מוצרים הגברה הם נצפו להשתמש תקן ה-PCR הליכי פתרון בעיות כדי להגדיל את הספציפיות כגון אופטימיזציה של כמות תבנית, ריכוז פריימר, ורכיבה על אופניים פרמטרים. ביצוע ניתוח PAGE לעומת agarose אלקטרופורזה רגילה שיטה זו האחרונה אינה מספקת רזולוציה רגישות נאותים. Cel-I תנאים לקט עשוי גם להיות מותאם אם לא מתעכל המוצר או מריחות מוגזמת הוא ציין. טיטרציה של כמות cel-1 nuclease ו / או משך זמן העיכול ניתן טיטרציה כדי לשפר את ההיבטים האלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Nuclease S (cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> להרחיב את נאמנות גבוהה PCR מערכת </td><td> רוש </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> שורת תאים Nucleofector ערכת V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP רעלן פנימי, חינם הפלסמיד Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

הגנום עריכה היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי להבהיר את תפקיד הגן ואת הבסיס הגנטי של המחלה. הגן המסורתית עריכת שיטות כגון mutagenesis הכימי מבוסס או שילוב אקראי של רצפי DNA להעניק שינויים גנטיים חסרות הבחנה בצורה יעילה הכוללת ודורשים שילוב של רצפים סינתטיים לא רצויים או שימוש התנאים תרבות חריגים, פוטנציאל מבלבל המחקר הביולוגי. לעומת זאת, הביטוי ZFN חולפת בתא יכול להקל מדויק, תורשתי עריכת הגן בצורה היעילה ביותר ללא צורך בממשל של כימיקלים או שילוב של transgenes סינתטיים. Nucleases אצבע אבץ (ZFNs) הם אנזימים אשר נקלטות וחותכים רצפים שונים של גדילי הדנ&quot;א הכפול (dsDNA). יחידה תפקודית CompoZr ZFN מורכב משני חלבונים monomeric בודדים אשר נקלטות על ידי ה-DNA &quot;חצי אתר&quot; של כ 15-18 נוקלאוטידים (ראה איור 1). כאשר 2 ZFN מונומרס &quot;בית&quot; לאתרים סמוכים היעד שלהם את ה-DNA מחשוף תחומים dimerize וליצור הפסקה הגדיל פעמיים (DSB) ב-DNA. 1 מבוא של ZFN בתיווך DSBs בגנום מניח היסודות עריכת הגנום היעילה ביותר. תיקון מושלם של DSBs בתא דרך לא הומולוגיים בסוף שהצטרף מסלול (NHEJ) תיקון דנ&quot;א יכול לגרום הוספות קטנות ומחיקות (indels). יצירת indels בתוך רצף הגן המקודד של התא יכול לגרום frameshift ו בנוקאאוט תפקודית הבאות של לוקוס הגן על יעילות גבוהה. 2 אמנם פרוטוקול זה מתאר את השימוש ZFNs ליצור פצצה גן, שילוב של transgenes יכול גם להתנהל דרך הומולוגיה מכוונת לתיקון במקום לחתוך ZFN. אישית CompoZr ZFN שירות מייצג גישה שיטתית, מקיפה, היטב מאופיין לעריכה הגן ממוקד עבור הקהילה המדעית עם הטכנולוגיה ZFN. מדענים סיגמא לעבוד בשיתוף פעולה הדוק עם חוקרים 1) perfoבדיקת RM ניתוח בשל כולל ניתוח של מבנה הגן ביולוגיה רלוונטי,, ​​מערכת מודל בהתאם מטרות הפרויקט, 2) ליישם את הידע הזה כדי לפתח אסטרטגיה קול מיקוד, 3) ואז לתכנן, לבנות, והן מבחינה תפקודית לאמת ZFNs לפעילות רלוונטי התא קו. החוקר מקבל שליטה חיובית הדנ&quot;א הגנומי primers, ומוכן לשימוש ריאגנטים ZFN שסופקו ב-DNA הן הפלסמיד ואת חוץ גופית בפורמט ה-mRNA עיבד. ריאגנטים אלה עשויים אז להיות מועברת לביטוי חולף בתור תא של החוקר או סוג תא של בחירה. דגימות נבדקו אז מוקד של עניין קנה מידה בטכניקות ביולוגיה מולקולרית כולל הגברה PCR, תקציר האנזימטית, ו אלקטרופורזה לעריכה הגן. לאחר איתות חיובי עבור עריכת הגן מזוהה בקרב האוכלוסייה הראשונית, הם תאים מתא בודד לשכפל ו genotyped לזיהוי של שיבוטים / אללים מוטנטים.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs at JoVE.com

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.3K Views.  Sigma Life Science. אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

Video: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Genetics

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Developmental Biology

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but protospacer adjacent motif (PAM) limitations are a major obstacle to creating accurate animal models of human genetic disorders caused by single-nucleotide variants (SNVs). Until now, some SpCas9 variants with broad PAM compatibility have shown efficiency in zebrafish. The application of the optimized SpRY-mediated adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e, and synthetically modified gRNA in zebrafish has enabled efficient adenine-guanine base conversion without PAM restriction. Described here is a protocol for efficient adenine base editing without PAM limitation in zebrafish using zSpRY-ABE8e. By injecting a mixture of zSpRY-ABE8e mRNA and synthetically modified gRNA into zebrafish embryos, a zebrafish disease model was constructed with a precise mutation that simulated a pathogenic site of the TSR2 ribosome maturation factor (tsr2). This method provides a valuable tool for the establishment of accurate disease models for studying disease mechanisms and treatments.

This protocol describes how to perform efficient adenine base editing without PAM limitation to construct a precise zebrafish disease model using zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

Genome Editing

A well-established technique for modifying specific sequences in the genome is gene targeting by homologous recombination, but this method can be laborious and only works in certain organisms. Recent advances have led to the development of &#8220;genome editing&#8221;, which works by inducing double-strand breaks in DNA using engineered nuclease enzymes guided to target genomic sites by either proteins or RNAs that recognize specific sequences. When a cell attempts to repair this damage, mutations can be introduced into the targeted DNA region. In this video, JoVE explains the principles behind genome editing, emphasizing how this technique relates to DNA repair mechanisms. Then, three major genome editing methods&#8212;zinc finger nucleases, TALENs, and the CRISPR-Cas9 system&#8212;are reviewed, followed by a protocol for using CRISPR to create targeted genetic changes in mammalian cells. Finally, we discuss some current research that applies genome editing to alter the genetic material in model organisms or cultured cells.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video