1. Processus de conception personnalisée ZFN <ol><li> Pour accélérer le processus de conception ZFN, un enquêteur doit fournir: </li><ul><li> Informations sur le gène cible telles que le nom du gène, espèce, et le gène de l&#39;annotation / numéro d&#39;identification. </li><li> Une clairement indiqué sur-tout l&#39;objectif de l&#39;expérience (par exemple, ou Knockout Knockin) </li><li> Tous les facteurs spécifiques de la cible du gène qui comprennent structure génique atypique, la biologie particulière impliqué dans le locus génétique, ou des régions homologues dans le reste du génome. </li><li> La plage spécifique de séquence d&#39;ADN pour le doigt de zinc pour cibler nucléases. </li></ul><li> L&#39;équipe de Sigma bioinformatique mène in silico ZFN conception pour développer des sites initiaux à doigts de zinc cibles. </li><li> Les premiers sites cibles ZFN sont fournis à un consultant technique et scientifique ZFN. Pour les projets plus complexes techniquement, ce scientifique Sigma travaille avec les enquêteurs de mettre au point la stratégie du projet. </li><li&gt; Le Sigma bioinformatique équipe procède à une analyse des algorithmes pour générer ZFN dans les conceptions ZFN silico. Cela inclut une recherche du génome entier pour hors-cible des sites, le masquage de répétition, et l&#39;analyse des SNP pour chaque site cible ZFN potentiel. </li><li> Bioinformatique fournit les meilleurs sites cibles ZFN à l&#39;enquêteur aux fins d&#39;examen. Lors de l&#39;approbation des sites potentiels cibles ZFN, cette information est fournie à l&#39;équipe de production ZFN pour commencer le processus de fabrication ZFN. </li></ol> 2. Personnalisé de production ZFN <ol><li> L&#39;archive Sigma de modules à doigt de zinc est utilisé pour assembler les modèles ZFN approuvés. </li><li> Chaque modèle est assemblé et ZFN séquence vérifiée sur une plate-forme de clonage à haut débit. </li><li> Une fois la production de tous les modèles ZFN est terminée, tous les ZFN est envoyé à la validation. </li></ol> 3. Validation des ZFNs personnalisés <ol><li> Des projets dans ZFNespèce humaine, la souris, de rat ou de CHO sont validés dans des lignées cellulaires bien caractérisées pour chaque espèce, un dosage à base de levure est utilisé pour d&#39;autres organismes ou des types cellulaires. </li><li> Constructions ZFN sont livrés dans la lignée cellulaire appropriée par nucléofection et les ZFNs sont exprimés. </li><li> ADN est récolté à partir du pool de cellules transfectées ZFN et la région d&#39;intérêt est amplifié par PCR. </li><li> Le Cel-1 test est ensuite effectué sur le produit de PCR. L&#39;électrophorèse sur gel est exécuté sur le Cel-1 dosage de l&#39;activité ZFN validé. </li><li> La conception plus forte activité ZFN tel que confirmé par le dosage Cel-1 est ensuite fourni au client. ZFNs sont livrés en ARNm et l&#39;ADN plasmidique ainsi amorces de PCR pour l&#39;essai Cel-1 et l&#39;ADN génomique comme témoin positif. </li></ol> 4. La livraison des ZFNs validés par nucléofection <ol><li> Graine les cellules à une densité de 2x10 5 cellules par ml de la veille nucléofection. </li><li> Le jour de nucléofection,sortez portable Ligne Nucleofector Kit V et laisser tiédir à température ambiante. </li><li> Ajouter le supplément à la solution nucléofection V selon le protocole du fabricant. </li><li> Compter les cellules. Densité de cellules doit être compris entre 2,5-5x10 5 cellules par ml. </li><li> Remplir une plaque à 6 puits avec 2 ml de milieu dans chaque puits et pré-chaud dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C pendant au moins 20 minutes avant nucléofection. </li><li> Centrifuger 2x10 6 cellules par transfection (8x10 6 au total) au 200xg pendant 5 minutes. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 20 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> Préparer des tubes expérimentaux: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique) </li><li> Retirer la plaque à 6 puits contenant les médias de l&#39;étape (6.5) de l&#39;incubateur. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 400 pi (100 pi / réaction) de la solution nucléofection V. </li><li> Un réactionnel à la fois, ajouter 100 pl de cellules à chaque ADN ou ARNm contenant du tube. Transfer le mélange à une électroporation 2 mm cuvette et sur une nucleofect Nucleofector avec le programme approprié. </li><li> Immédiatement après nucléofection de chaque échantillon, utiliser une pipette de transfert pour ajouter ~ 500 pi de milieu préchauffé de la plaque à 6 puits à l&#39;étape (6,9) dans la cuvette. Puis, transférez les cellules de la cuvette au milieu restant préchauffé dans la plaque à 6 puits. </li><li> Terminer toutes les réactions et retourner la plaque à 6 puits à l&#39;incubateur à CO 2 à 37 ° C. </li></ol> 5. La récolte d&#39;ADN génomique après la livraison de ZFNs <ol><li> Des plaques 6 puits - ne pas récolter la totalité des cellules mises en commun. Il est important de maintenir la culture dans le but d&#39;avoir des cellules à clone cellulaire de dilution simple une fois que vous confirmez que vous avez produits Cel-1 de digestion. Un à trois jours après nucléofection recueillir les cellules pour préparer l&#39;ADN chromosomique utilisant le GenElute l&#39;ADN génomique des mammifères Miniprep Kit. </li></ol> 6. Cel-1 Test </p&gt; <ol><li> Amplifier par PCR de l&#39;ADN génomique à partir des échantillons ZFN transfectées et l&#39;ADN génomique de contrôle positif fourni dans le kit, en utilisant les amorces fournies. La réaction de PCR est mis en place avec les conditions suivantes: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique). </li><li> Pour générer des hétéroduplex homoduplexes PCR prendre 10 ul de la réaction PCR à partir de chaque échantillon ZFN traités ainsi que le contrôle et utiliser le programme suivant sur un thermocycleur: 95 ° C, 10 minutes 95 ° C à 85 ° C, -2 ° C / seconde 85 ° C à 25 ° C, -0,1 ° C / seconde 4 ° C, indéfiniment </li><li> Ajouter 1 ul de enhancer et 1 ul de nucléase S (à partir de 706 025 Numéro de catalogue Transgenomic) à chaque réaction et incuber à 42 ° C pendant 20-40 minutes. </li><li> Exécuter les digestions sur un 10% PAGE-TBE gel avec des marqueurs appropriés, tels que l&#39;ADN Ladder DirectLoad WideRange (D7058 Numéro de catalogue) (voir les résultats dans le bulletin technique personnalisé ZFN). </li><li> SurCE signal positif a été détecté dans ZFN-traités par les populations cel-je test, procéder à l&#39;isolement et la caractérisation des clones. </li></ol> 7. Isolement et caractérisation de clones <ol><li> Une seule cellule clone les échantillons ZFN-traités par des méthodes standards, y compris FACS et le clonage de dilution. </li><li> Autoriser les clones se développer suffisamment, puis fractionnez une certaine proportion de cellules pour la récolte d&#39;ADN génomique, le gel de retour le reste en tant que matériau en banque. </li><li> Amplifier l&#39;ADN génomique des clones en utilisant les amorces Cel-I et d&#39;analyser l&#39;amplicon par Cel-je test (avec et sans ADN WT atteint un sommet en), ou encore utiliser cet amplicon de procéder directement au génotypage. </li><li> Clones candidats génotype identifié comme ayant des allèles édité par la méthode préférée. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;ensemble du flux de travail CompoZr ZFN est présenté dans la Figure 2. ZFNs sont livréspour les cellules où ils se lient et coupent la séquence d&#39;ADN appropriée qui crée une cassure double brin (DSB). Le processus naturel de réparation, non homologue (NHEJ extrémité de jonction), les réparations de l&#39;ORD. Dans certains résultats aberrants dans les instances NHEJ suppression, insertion ou substitution de nucléotides. Amplification par PCR de la récolte des résultats d&#39;ADN génomique dans la formation des hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés après la dénaturation / étape de recuit de la réaction de PCR. Ajout des résultats enzymatiques Cel-1 dans le clivage de toutes les molécules hétéroduplex. Cel-1 résultats sont résolus par l&#39;analyse PAGE pour confirmer le clivage ZFN. La figure 3 présente un schéma de l&#39;essai Cel-1 et les résultats escomptés. Représentant de CEL-1 résultats sont contenus dans les figures 4 et 5 la figure 4 contient les résultats d&#39;une paire très actif de ZFNs (21%) dans les cellules K562;. Figure 5 contient les résultats d&#39;une paire moins actif (2,4%) de ZFNs dansLes cellules K562. Activité ZFN est confirmée dans les deux chiffres par la présence de fragments de PCR deux sous le fragment parentale PCR. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. ZFNs Représentation des nucléases à doigt de zinc liés. Sont conçus protéines composées d&#39;un doigt de zinc domaine liant l&#39;ADN fusionné au domaine de clivage de l&#39;endonucléase de restriction FokI. Lorsqu&#39;il est lié comme un hétérodimère, ZFNs créer une cassure double brin à une séquence d&#39;ADN d&#39;utilisateur spécifié. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma du workflow ZFN service personnalisé. Représentation graphique du workflow pour générer une lignée de cellules génétiquement modifiées à l&#39;aide ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Schéma de l&#39;essai Cel-1 et les résultats. A) ZFN plasmide o<html> ARNm r est délivré à cellules. B) Exprimé bind ZFNs et couper leur séquence cible la création d&#39;une pause double brin (DSB) dans une partie des cellules. C) la réparation aberrante de certains conseils scolaires de district par des non-homologue fin de rejoindre des résultats à l&#39;insertion ou la suppression de nucléotides. D) l&#39;ADN génomique est récolté à partir du pool de cellules transfectées et amplifié au niveau du locus d&#39;intérêt. EF) produit de PCR est dénaturé et re-création de recuit formation d&#39;hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés. G) Les résultats Cel-1 inadéquation endonucléase de dosage dans le clivage de molécules hétéroduplex. H) Cel-1 enzyme digère sont résolus par PAGE. Le ratio observé de produit de clivage à la bande parentérale, déterminée par logiciel ImageJ, indique la coupe de fraction et de l&#39;efficacité des ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Cel-1 résulte de 21% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l&#39;adresse:._blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Cel-1 résulte de 2,4% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l&#39;adresse:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

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Les chercheurs peuvent fournir des ZFN cellules ou animaux modifiés à des collaborateurs dans le cadre du Contrat de Licence de recherche standard. Dans cette circonstance Sigma demande qu&#39;un accord de transfert de matériel est mis en place entre Sigma, le client ZFN et leur collaborateur. Le permis de recherche peut être consulté à: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Si il ya un potentiel pour une application commerciale en utilisant des cellules modifiées ZFN Sigma demande alors qu&#39;une licence commerciale est mis en place. La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par la société Sigma, Inc

Une fois ZFN modifiés cellules sont isolés, ils ont permanente et héréditaire modifications de l&#39;ADN. Il en résulte la possibilité de générer des lignées cellulaires de façon stable ou animaux modifiés race avec des modifications génétiques souhaitées pour effectuer des recherches. CompoZr ZFNs personnalisés offrent une méthode robuste pour génome d&#39;édition dans une grande variété de types cellulaires. Publication du génome succès d&#39;édition avec ZFNs comprend mais ne se limite pas à des lignées cellulaires humaines, de souris, rat, poisson-zèbre, grenouille, porcine et des modèles de recherche CHO. 3,4,5,6,7,8,9 La possibilité de créer un double brin rupture au site cible désirée dans le type cellulaire déterminé est assurée lorsque les ZFNs sont correctement délivrés dans une cellule. Il est également possible d&#39;effectuer séquentielles modifications à doigts de zinc à une cellule afin d&#39;avoir plus d&#39;une modification génétique dans une cellule 10. La possibilité de sélectionner une séquence cible spécifique et ne modifient que locus particulier est une principale cause de la possibilité de créer plusieurs modifides cations. Le CompoZr personnalisé ZFN certificat d&#39;analyse est générée avec les réactifs très fournies dans le kit assurant ainsi que tous les composants du kit ont été soigneusement validé pour la réussite des clients. Les étapes critiques du flux de production du début à la fin sont présentées ci-dessous: Clonage cellulaire La capacité à isoler et à développer une lignée cellulaire donnée doivent être testés avant de commencer toutes les expériences ZFN. Les cellules individuelles doivent être isolés et élargi afin de s&#39;assurer que la population clonale dérivée est possible. Certaines lignées cellulaires sont récalcitrantes à ce sujet, et des astuces telles que l&#39;enrichissement des clones édités, ou de la culture avec les médias climatisées peuvent aider à surmonter ces défis. L&#39;efficacité de livraison Optimisation de l&#39;efficacité de livraison est un must avant la livraison des ZFNs. De nombreuses méthodes peuvent être utilisées, y compris à base de lipides transfection, l&#39;électroporation, et nucleofectile. La méthode de livraison idéal se compose d&#39;un mélange qui offre la plus optimale de l&#39;efficacité de livraison et la survie cellulaire. Quantification de ces gains d&#39;efficacité peuvent être estimées par la prestation d&#39;un contrôle GFP du plasmide et la quantification par inspection visuelle ou FACS 24-48h après l&#39;accouchement. Cel-je test Il est impératif que Cel-je dosage est effectué en parallèle avec les contrôles appropriés pour s&#39;assurer que les paramètres de la PCR, la digestion, et l&#39;électrophorèse ne pas interférer avec l&#39;interprétation de l&#39;expérience ZFN. Chaque kit comprend l&#39;ADN génomique de contrôle qui est utilisé pour créer l&#39;image Cel-I dans le certificat d&#39;analyse. Amplification de l&#39;ADN de contrôle avec les amorces fournies suivies par Cel-je test permettra à l&#39;utilisateur de comparer les résultats avec celles fournies dans le certificat d&#39;analyse (CA) d&#39;image, et d&#39;isoler les inefficacités potentielles dans cet aspect de l&#39;expérience. Un contrôle approprié négative comme une maquette, ou GFP traités celluleéchantillon doit également être inclus pour permettre l&#39;élucidation de tous les produits de clivage non-spécifiques. Qualitative / quantitative d&#39;analyse de la seule clones de cellules Après le traitement et le clonage ZFN seule cellule, les populations de cellules peuvent être criblés pour l&#39;édition au niveau du locus d&#39;intérêt par un certain nombre de méthodes. Cel-I dosage peut être effectuée sur l&#39;ADN génomique à partir de clones dans le but d&#39;identifier les clones candidats pour le génotypage en outre. Il est important de pic WT amplicon de PCR dans les amplicons échantillon à un rapport de 1:1 avant d&#39;effectuer la Cel-je digère comme homozygotes clones mutants sera contiennent des molécules homogènes, et donc donner un effet négatif Cel-I dosage résultat. Une méthode alternative pour le criblage de ces clones candidats est de concevoir un atterrissage d&#39;amorce de PCR directement sur le site cible ZFN. Utilisée en conjonction avec l&#39;une des amorces de contrôle, un résultat négatif signifie dosage perte de la séquence WT. Un clone hétérozygote contenant au moins un allèle WT va Yield signal PCR, mais peuvent être séparés à partir de clones WT pleinement en effectuant la PCR dans le cadre de SYBR qPCR. Une fois les clones candidats ont été identifiés par les méthodes ci-dessus, ils peuvent être génotypés par pyroséquençage standard, le séquençage de profondeur, ou d&#39;autres méthodes de séquençage. Pour toutes les méthodes de séquençage, un amplicon créé à partir de l&#39;ADN génomique des clones doit être généré. Pour allèles pyroséquençage traditionnels peuvent être séparés par TA-clonage du produit PCR et le séquençage des colonies individuelles. Pour des méthodes telles que le séquençage en profondeur cette étape n&#39;est pas nécessaire. Réparation homologie Réalisé (HDR) Ce protocole prévoit la méthode de knock-out de gène médié par l&#39;intermédiaire ZFN NHEJ. L&#39;intégration des transgènes peuvent également être réalisée par introduction d&#39;un plasmide donneur avec bras d&#39;homologie qui flanquent un site de coupe ZFN 11. Dans ce scénario, le ZFN créé double brin pause est réparé par HDR au lieu de NHEJ. HDR j&#39;ai réaliséntégration des transgènes peuvent être confirmés en utilisant des méthodes similaires aux procédures prévues dans ce protocole. Dépannage La livraison des ZFNs Livraison ZFN et d&#39;expression de livraison peut être contrôlée par la livraison d&#39;un GFP ou autre plasmide pour la visualisation et / ou la quantification. Faible niveau d&#39;expression pour cause d&#39;incompatibilité avec le promoteur type de cellule d&#39;intérêt peuvent être surmontés par la livraison de ZFNs au format ARNm. En outre, la méthode choc dû au froid peut être utilisé pour augmenter encore l&#39;efficacité de ZFNs dans les cellules. 12 Si l&#39;ARNm est utilisé, il est impératif que les cellules sont lavées avant la livraison pour s&#39;assurer que tous Rnases sérum dérivés ont été supprimés. Il est également prudent de dégeler l&#39;ARNm sur la glace, et ajouter le il aux cellules à la dernière minute afin de minimiser tout risque de dégradation. Cel-je test La fondation de l&#39;assa-Cel Iy est égal à une amplification spécifique et un grand du locus d&#39;intérêt. Si les produits d&#39;amplification non spécifiques sont observées utiliser la PCR standard les procédures de dépannage pour accroître la spécificité tels que l&#39;optimisation de la quantité de modèle, la concentration d&#39;amorce, et le cyclisme paramètres. Effectuer une analyse PAGE, par opposition à d&#39;agarose électrophorèse standard comme cette dernière méthode ne fournit pas la résolution et de sensibilité. Cel-I conditions de digestion peuvent également être optimisés si aucun produit digéré ou de traînées excessive est observée. Le titrage de la quantité de Cel-1 nucléase et / ou la durée de la digestion peuvent être titrés afin d&#39;améliorer ces aspects.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Nucléase S (Cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Cellule Ligne Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP exemptes d&#39;endotoxines Plasmide Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Génome édition est une technique puissante qui peut être utilisé pour élucider la fonction des gènes et de la base génétique de la maladie. Gène traditionnel édition méthodes telles que la chimie basée sur la mutagenèse aléatoire ou l&#39;intégration de séquences d&#39;ADN confère changements aveugles génétiques d&#39;une manière globalement inefficace et nécessite l&#39;incorporation de séquences synthétiques ou indésirables d&#39;utiliser des conditions de culture aberrants, peut prêter à confusion étude biologique. En revanche, l&#39;expression transitoire ZFN dans une cellule peut faciliter précise, héréditaires édition du gène d&#39;une manière très efficace sans la nécessité pour l&#39;administration de produits chimiques ou d&#39;intégration de transgènes synthétiques. Nucléases à doigt de zinc (ZFNs) sont des enzymes qui se lient et couper des séquences distinctes de l&#39;ADN double brin (ADNdb). Une fonctionnelle CompoZr ZFN unité se compose de deux protéines individuelles monomères qui lient l&#39;ADN &quot;demi-site» d&#39;environ 15-18 nucléotides (voir Figure 1). Lorsque deux ZFN monoMers &quot;maison&quot; à leurs sites cibles adjacents les domaines d&#39;ADN clivage dimériser et de créer une cassure double brin (CDB) dans l&#39;ADN. 1 Introduction de ZFN médiation CDB dans le génome établit une fondation pour l&#39;édition du génome très efficace. Réparation imparfaite de CDB dans une cellule par le biais du non-homologue de fin d&#39;assemblage (NHEJ) voie réparation de l&#39;ADN peut entraîner de petites insertions et suppressions (indels). Création d&#39;indels dans la séquence du gène codant d&#39;une cellule peut se traduire par décalage du cadre et suite à élimination directe fonctionnelle d&#39;un locus du gène à haut rendement. 2 Bien que ce protocole décrit l&#39;utilisation de ZFNs pour créer une inactivation du gène, l&#39;intégration des transgènes peuvent également être effectuées par l&#39;intermédiaire homologie dirigée réparation sur le site de coupe ZFN. Le CompoZr personnalisé ZFN service représente une approche systématique, globale et bien caractérisé à l&#39;édition gène ciblé pour la communauté scientifique avec la technologie ZFN. Scientifiques Sigma travailler en étroite collaboration avec les enquêteurs à 1) perform analyse de diligence raisonnable, y compris l&#39;analyse de la structure des gènes pertinents, la biologie, et un système de modèle conformément aux objectifs du projet, 2) appliquer cette connaissance pour développer une bonne stratégie de ciblage, 3), puis la conception, la construction, et fonctionnellement valider ZFNs pour l&#39;activité d&#39;une manière pertinente lignée cellulaire. L&#39;enquêteur reçoit positif ADN génomique de contrôle et des amorces, et prêt-à-utiliser les réactifs ZFN fournis à la fois dans l&#39;ADN plasmidique et le format in-vitro l&#39;ARNm transcrit. Ces réactifs peuvent ensuite être livrés pour l&#39;expression transitoire dans une lignée cellulaire de l&#39;enquêteur ou le type de cellule de choix. Les échantillons sont ensuite testés pour l&#39;édition au niveau du locus du gène d&#39;intérêt par des techniques classiques de biologie moléculaire, y compris l&#39;amplification par PCR, digestion enzymatique, et l&#39;électrophorèse. Après signal positif pour le montage du gène est détectée dans la population initiale, les cellules sont des cellules clonées seule et génotypés pour l&#39;identification de clones mutants ou allèles.

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Le CompoZr personnalisé à doigt de zinc nucléase (ZFN) permet la fonction d&#39;édition génome précis dans un organisme ou lignée cellulaire à tout lieu défini par l&#39;utilisateur. Cet article décrit le processus pour la conception, la fabrication, la validation et la mise en œuvre du Service CompoZr personnalisé ZFN.

Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.2K vues.  Sigma Life Science. Le CompoZr personnalisé à doigt de zinc nucléase (ZFN) permet la fonction d'édition génome précis dans un organisme ou lignée cellulaire à tout lieu défini par l'utilisateur. Cet article décrit le processus pour la conception, la fabrication, la validation et la mise en œuvre du Service CompoZr personnalisé ZFN.

Vidéo: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Recherche

Biologie

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

Un tactile automatisé Passif doigts stimulateur (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Mesure de la fonction cérébrale Neuromagnetic En pré-scolaire des enfants à la coutume entreprises MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Génome Édition dans<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Utilisation Transcription Activator comme Effector nucléases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

Évaluation de la disponibilité des minéraux dans les aliments pour poissons à l’aide de méthodes complémentaires démontrées par l’exemple du zinc dans le saumon de l’Atlantique

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.