<p class="jove_content"> Questo progetto è stato finanziato da una sovvenzione della Multiple Sclerosis Society of Canada a RKRWO è un destinatario di una borsa di studio dalla Multiple Sclerosis Society of Canada. SDR è un destinatario di Post-Doctoral Fellowships dalla Multiple Sclerosis Society of Canada e Canadian Institutes of Health Research. </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content"> Nessun conflitto di interessi dichiarati. </p>

<p class="jove_content"> Questo rapporto descrive un metodo per isolare OPC murini per la differenziazione nelle culture OL-arricchito o OL / DRGN co-culture. Quando colta da solo, il OPC differenziarsi in MBP <sup>+</sup> OL <sup>ve,</sup> la produzione di mielina come fogli membranosa. Quando aggiunto a DRGN letti neuriti, OL avvolgono i neuriti DRGN con MBP <sup>+</sup> membrana <sup>ve.</sup> Questo modello benefici l&#39;indagine dei fondamenti complessi che regolano OL-mediata ensheathment assonale. </p><p class="jove_content"> Anche se di grande valore, l&#39;istituzione di tali culture è tecnicamente impegnativo. In particolare, gli aspetti impegnativi includono la digestione efficiente dei tessuti / dissociazione, il mantenimento del pH equilibrato terreni di coltura, e DRGN cambiamenti dei media. E &#39;importante considerare che la lunghezza della digestione, la quantità di tessuto essere digerito e la quantità di triturazione influenza il risultato efficacia e la fine della dissociazione dei tessuti. Non è insolito per i ricercatori esperti di ottenere basse rese cellulari dissociato da tessuti del sistema nervoso. Inoltre, OPC murino tendono ad essere sensibili alle variazioni del pH dei terreni di coltura, in particolare in ambiente alcalino. Il mantenimento di culture a 8,5% CO <sub>2</sub> mira a prevenire questo, dal momento che OPC sembrano tollerare condizioni migliori sul leggermente acido base. Per quanto riguarda DRGNs alimentazione, i cambiamenti dei media deve essere eseguita velocemente per non essiccare i neuroni, tuttavia, deve essere gentile come non perturbare il letto neuriti via di sviluppo. Bruschi cambiamenti dei media può rimuovere il letto neuriti dal substrato, e il risultato probabilmente nella sua completa dissociazione dalla coprioggetto. </p><p class="jove_content"> Il merito potenzialità di questo sistema modello oscura notevolmente la sua natura tecnicamente impegnativo. Un vantaggio di questo sistema è l&#39;uso di post-natale topi per la derivazione di coltura cellulare di eludere la necessità di sacrificare femmine riproduttrici per la raccolta dei tessuti embrionali. Un altro vantaggio è la mancanza di requisiti per i fattori di crescita (GF) per l&#39;espansione della OPC. Misti culture gliali forniscono un ambiente che supporta la propagazione della OPC, presumibilmente a causa della presenza di astrociti derivati ​​da fattori trofici. Altri metodi, come la derivazione via neurosfere <sup>7,8,</sup> si basano sulle proprietà di GF mitogenica come fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e delle piastrine fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) per l&#39;espansione OPC. Allo stesso modo, usando postnatale (P5-10) per topi DRGNs evita la necessità di integrare i terreni di coltura con fattore di crescita nervosa (NGF), un fattore neurotrofico necessario per la sopravvivenza <em>in vitro</em> di embrioni DRGNs <sup>9, 10.</sup> E &#39;di interesse per evitare l&#39;uso di NGF poichè influenza negativamente la capacità di mielinizzanti OL quando coltivate con DRGNs <sup>4.</sup> Evitare l&#39;uso di GF-integrato dei media ha anche benefici economici, in quanto questi reagenti diventare costoso se utilizzato su larga scala. </p><p class="jove_content"> Forse il vantaggio più importante di questo modello la cultura è la sua derivazione da mouse solo tessuti, fornendo così l&#39;opportunità di derivare sia OPC e DRGNs dalla grande varietà di linee di topi transgenici. Questo permette per lo studio di entrambi e DRGN / o OPC proprietà specifiche che regolano la mielinizzazione. Questo sarà particolarmente importante per chiarire il recettore / ligando che regolano le interazioni OL-mediata mielinizzazione degli assoni. In tutto, questa tecnica è di grande valore per quanto riguarda la ricerca delle neuroscienze per le sue applicazioni verso la comprensione i segnali molecolari alla base della mielinizzazione. </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Nome prodotto</strong> </td><td> <strong>Azienda</strong> </td><td> <strong>Codice</strong> </td></tr><tr><td> Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319-005-CL </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimo Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Sieroalbumina bovina (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Umano merosina purificata proteine ​​(LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Ricombinante di ratto fattore neurotrofico ciliare (CNTF) </td><td> Peprotech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroxina </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 supplemento </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Sodio Selenite </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-deossiuridina (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papaina soluzione </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-bene di coltura tissutale piatti </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> T25-tessuto cultura fiaschi con tappo di sfiato </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 centimetri di tessuto cultura piatti </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 centimetri scatola di Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 micron filtro (opzionale) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Proteina basica della mielina (MBP) Anticorpo </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 anticorpi </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Glicoproteina associata alla mielina (MAG) anticorpi </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-ciclico-nucleotide 3&#39;-fosfodiesterasi (CNP) anticorpi </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actina pan Ab-5 anticorpi </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilamenti-200 (NF) anticorpi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulina beta-3 a catena (Tuj1) anticorpi </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio (H + L) anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 capra anti-topo IgG (H + L) anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 di capra anti-topo (IgG) (H + L) anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IgG (H + L)-HRP coniugato secondario </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Capra anti-topo IgG (H + L)-HRP coniugato secondario </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Ricette dei media </p><p class="jove_content"> <strong>OL-100X Supplemento *</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Importo da aggiungere</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Sodio Selenite </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Conservare a -80 ° C in aliquote da 250 microlitri </p>t &quot;&gt; <strong>media OL</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Importo da aggiungere</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> OL-100X Supplemento </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> Insulina bovina (da 1 mg / ml stock) </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250 microlitri </td></tr><tr><td> Holo-transferrina (da 33 mg / ml stock) </td><td> 37,5 microlitri </td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td> CNTF (da 50 ng / mL stock) </td><td> 25 microlitri </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Tecnica mista cultura gliali (costituita in DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentrazione finale</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / strep (0,33% dal magazzino) </td><td> 33 unità / ml di penicillina e 33 mg / ml di streptomicina </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 1% </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN media (composta in DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentrazione finale</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% dal magazzino) </td><td> 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Digestione Soluzione Ricette: </p><p class="jove_content"> <strong>OPC papaina soluzione (costituita nel MEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentrazione finale</strong> </td></tr><tr><td> Papaina soluzione </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> 360 mg / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mg / ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG papaina soluzione (costituita in HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentrazione finale</strong> </td></tr><tr><td> Papaina </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> 360 mg / ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG Collagenasi Una soluzione (costituita in HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentrazione finale</strong> </td></tr><tr><td> Collagenasi A </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> Identificare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo OL non solo è fondamentale per approfondire la nostra conoscenza della biologia OL, ma ha anche implicazioni per la comprensione della patogenesi delle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM). Sviluppo cellulare è comunemente studiate con modelli di colture cellulari primarie. Colture cellulari primarie facilita la valutazione di un dato tipo di cellula, fornendo un ambiente controllato, privo di variabili estranee che sono presenti <em>in vivo.</em> Mentre le culture OL derivati ​​da ratti hanno fornito una grande quantità di conoscenza nella biologia OL, iniziative analoghe a stabilire culture OL dai topi è stata accolta con grandi ostacoli. Lo sviluppo di metodi di cultura OL murino primario è indispensabile al fine di sfruttare le linee disponibili nel topo transgenico. </p><p class="jove_content"> Diversi metodi per l&#39;estrazione di OPC da tessuto roditori sono state descritte, che vanno dalla derivazione neurosfere, adesione purificazione differenziale e immunopurification <sup>1-3.</sup> Mentre molti metodi offrire il successo, la maggior parte richiedono tempi di cultura vasta e / o attrezzature costose / reagenti. Per aggirare questo, purificando OPC da tessuti murini con un adattamento del metodo originariamente descritto da McCarthy &amp; de Vellis <sup>2</sup> è preferito. Questo metodo comporta fisicamente OPC separazione da una coltura mista gliali derivati ​​da cortecce roditori neonatale. Il risultato è una popolazione purificata OPC che possono essere differenziati in un OL-arricchito la cultura. Questo approccio è attraente per la sua cultura tempo relativamente breve e il requisito necessario per fattori di crescita o anticorpi immunopanning. </p><p class="jove_content"> Durante l&#39;esplorazione dei meccanismi di sviluppo OL in una cultura purificato è informativa, non fornisce l&#39;ambiente più fisiologicamente rilevanti per valutare la formazione di guaina mielinica. Co-coltura OLS con i neuroni darebbe comprensione delle basi molecolari che regolano OL-mediata mielinizzazione degli assoni. Per molti OL / neuroni co-coltura studi, i neuroni dei gangli della radice dorsale (DRGNs) hanno dimostrato di essere il tipo neurone di scelta. Sono ideali per co-coltura con OLS per la loro facilità di estrazione, quantità minima di cellule contaminanti, e la formazione di posti letto dei neuriti denso. Mentre gli studi utilizzando ratto / topo mielinizzanti xenocultures sono stati pubblicati <sup>4-6,</sup> un metodo per la derivazione di tale OL / DRGN mielinizzanti co-culture post-natale dei tessuti murino non è stata descritta. Qui vi presentiamo metodi dettagliate su come produrre in modo efficace tali colture, insieme a esempi di risultati attesi. Questi metodi sono utili per affrontare questioni rilevanti per lo sviluppo OL / funzione mielinizzanti, e sono strumenti utili nel campo delle neuroscienze. </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).</p>

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).