<p class="jove_content">このプロジェクトは、カナダの多発性硬化症協会からRKRWOへの助成金によって賄われていたカナダの多発性硬化症協会から学生の身分の受信者です。 SDRは、健康研究のカナダとカナダの研究所の多発性硬化症協会からポストドクトラルフェローシップの受賞者です。 </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content">利害の衝突は宣言されません。 </p>

<p class="jove_content">このレポートは、OL -濃縮培養物または共培養DRGN / OLの分化のためにマウスOPCを単離するための方法を説明します。単独で培養した場合、OPCはMBPに分化する<sup>+ VEの</sup> OLSを、膜状のシートミエリンのように生産。神経突起ベッドをDRGNに追加すると、OLSはMBPとDRGNの神経突起を包む<sup>+ VEの</sup>膜を。このモデルは、OL​​を介した軸索ensheathmentを支配する複雑な基盤の調査に利益をもたらします。 </p><p class="jove_content">大きな値の間に、そのような文化の確立が技術的に困難です。特に、要求の厳しい側面が効率的な組織の消化/解離、バランスの培地のpHの維持、およびDRGNメディアの変更が含まれています。消化の長さは、組織の量を消化し、粉砕の量は組織の解離の効果と終了結果に影響されていることを考慮することが重要です。それは、経験豊かな研究者のために解離神経系の組織から、低細胞の収率を得ることが珍しくありません。さらに、マウスOPCは、特にアルカリ性の条件下で、培地のpHの変化に敏感になる傾向があります。 8.5％CO <sub>2</sub>で培養の維持は、OPCはより基本的にやや酸性条件に耐えるように見えるので、これを防ぐことを目的としています。給餌DRGNsに関しては、メディアの変更は神経細胞を乾燥させるようにすることを迅速に実行する必要があります、しかし、発展途上神経突起のベッドを混乱させないよう穏やかにする必要があります。突然のメディアの変化は、基板からの神経突起ベッド、およびカバースリップから、その完全な解離の可能性が高い結果が外れる。 </p><p class="jove_content">このモデルシステムの潜在的なメリットは大きく、その技術的な要求の性質を目立たなくします。このシステムの利点の一つは、胚組織を採取するために繁殖の女性を犠牲にする必要性を回避して、細胞培養の導出のための産後のマウスの使用です。もう一つの利点は、OPCの拡大のための増殖因子のための要件の欠如（GFS）です。混合グリア培養物は、アストロサイト由来の栄養因子の存在のためにおそらくOPCは、の伝播をサポートする環境を提供しています。このようなニューロスフェアを<sup>7,8</sup>を介して導出などの他の方法は、、そのような塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮成長因子（EGF）とOPCの拡大のための血小板由来増殖因子（PDGF）などのGFSの分裂促進特性に依存しています。同様に、出生後（P5 - 10）DRGNsのためのマウスを使用すると、神経成長因子（NGF）、胚DRGNs <sup>9、10</sup>の<em>in vitroでの</em>生存<em>の</em>ために必要な神経栄養因子と培地を補充する要件を回避することができます。それはDRGNs <sup>4</sup>で培養した場合にマイナスOLSのmyelinating能力に影響を与えるとして、NGFの使用を避けることは興味深い。大規模で使用すると、これらの試薬は高価になるとGF添加培地の使用を避けることにより、また、経済的利益を持っています。 </p><p class="jove_content">おそらく、この培養モデルの最も重要な利点は、このようにトランスジェニックマウス系統の多種多様なOPCはとDRGNs両方を導出する機会を提供し、マウスのみの組織からの派生です。これはDRGNおよび/または髄鞘形成を支配するOPC固有のプロパティの両方の研究が可能になります。これは、軸索のOLを介した髄鞘形成を調節する受容体/リガンド相互作用を解明するために特に重要になります。すべてでは、こ​​の手法は、髄鞘形成の根底にある分子の手がかりを知るため、そのアプリケーションが原因で神経科学の研究に関しては大きな価値があります。 </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>製品名</strong> </td><td> <strong>会社</strong> </td><td> <strong>製品番号</strong> </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>マルチセル</td><td> 319から005 - CL </td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩類溶液（HBSS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM） </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌） </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td>ポリ- L -リジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P2636 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4503 </td></tr><tr><td>人間merosin精製タンパク質（LN2） </td><td>ミリポア</td><td> CC085 </td></tr><tr><td>組換えラット毛様体神経栄養因子（CNTF） </td><td>ぺプロ</td><td> 450から50 </td></tr><tr><td> L -チロキシン</td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td> GIBCO </td><td> 0080085 - SA </td></tr><tr><td>ウシインスリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3&#39;,5 -トリヨード- L -チロニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I6634 </td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P8783 </td></tr><tr><td>プトレッシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7505 </td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5 - フルオロ-2&#39; - デオキシウリジン（FUDR） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F0503 </td></tr><tr><td>パパインのソリューション</td><td>ワージントン</td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td>ロッシュ</td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L -システイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24ウェル組織培養皿</td><td> Cellstar </td><td> 662から160 </td></tr><tr><td>ベントキャップ付T25 -組織培養フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10cmの組織培養皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10cmペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 0875713 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics50μmのフィルター（オプション） </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td>ミエリン塩基性タンパク質（MBP）抗体</td><td> ABD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2抗体</td><td>ミリポア</td><td> AB5320 </td></tr><tr><td>ミエリン関連糖タンパク質（MAG）抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2&#39;、3&#39; -サイクリックヌクレオチド3&#39; -ホスホジエステラーゼ（CNP）抗体</td><td> Covance </td><td> SMI - 91R - 100 </td></tr><tr><td>アクチンパンAB - 5抗体</td><td>フィッツジェラルド</td><td> 10R - A106AX </td></tr><tr><td>ニューロフィラメント- 200（NF）抗体</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N4142 </td></tr><tr><td>チューブリンβ- 3チェーン（Tuj1）抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgG（H + L）二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A11008 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 555ヤギ抗マウスIgG（H + L）二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A21422 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 647ヤギ抗ラット抗体（IgG）（H + L）二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> A21247 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG（H + L）- HRP標識二次抗体</td><td> BioRad社</td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG（H + L）- HRP標識二次抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 2065 </td></tr><tr><td> 4&#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step">メディアのレシピ</p><p class="jove_content"> <strong>100X OL -補足*</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>追加する量</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100mLの</td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.02グラム</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td> 0.6mgの</td></tr><tr><td>プトレッシン</td><td> 161 mgの</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td> 0.05mgの</td></tr><tr><td> 3,3&#39;,5 -トリヨード- L -チロニン</td><td> 4mgを</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> -80 * ° Cで保存250μL分注し</p>T&quot;&gt; <strong>OLメディア</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>追加する量</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23.75 mLの</td></tr><tr><td> 100X OL -サプリメント</td><td> 250μL </td></tr><tr><td>ウシインスリン（1 mg / mLの在庫から） </td><td> 125μL </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> 250μL </td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン（33 mg / mlストックから） </td><td> 37.5μL </td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td> 500μL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125μL </td></tr><tr><td> CNTF（50 ng /μLの在庫から） </td><td> 25μL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>混合グリア培養培地（DMEMで構成される）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>最終濃度</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>ペン/咽頭（株式から0.33％） </td><td> 33ユニット/ mlペニシリン、33μg/ mlストレプトマイシン</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>一パーセント</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN培地（DMEMで構成される）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>最終濃度</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>ペン/咽頭（株式から1％） </td><td> 100単位/ mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン</td></tr></tbody></table><p class="jove_step">消化溶液のレシピ： </p><p class="jove_content"> <strong>OPCパパイン溶液（MEMで構成される）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>最終濃度</strong> </td></tr><tr><td>パパインのソリューション</td><td> 1.54 mg / mLの</td></tr><tr><td> L -システイン</td><td> 360μg/ mLの</td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60μg/ mLの</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGパパイン溶液（HBSSで構成される）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>最終濃度</strong> </td></tr><tr><td>パパイン</td><td> 1.54 mg / mLの</td></tr><tr><td> L -システイン</td><td> 360μg/ mLの</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGコラゲナーゼ溶液（HBSSで構成される）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>最終濃度</strong> </td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td> 4 mg / mLの</td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> OL開発の根底にある分子機構を同定することはOL生物学の知識を深めるには重要であるだけでなく、このような多発性硬化症（MS）などの脱髄疾患の病因を理解するための意味を持っています。携帯電話の開発は、一般的に一次細胞培養モデルで研究されている。初代培養細胞は、 <em>生体内に</em>存在する余分な変数の自由、制御された環境を提供することにより、所定の細胞型の評価を容易にする。ラット由来OLの文化がOL生物学への洞察の膨大な量を提供しているが、マウスからOLの文化を確立することで、同様の努力が大きな障害に満たされている。文化マウス一次OLSする方法を開発することは可能なトランスジェニックマウス系統を利用するために不可欠です。 </p><p class="jove_content">げっ歯類の組織からOPCを抽出するための複数のメソッドは、ニューロスフェアの導出、差動接着精製と<sup>1-3</sup>免疫精製に至るまで、記載されている。多くのメソッドが成功を提供していますが、ほとんどは大規模な文化の時間および/または高価な機器/試薬を必要とする。これを回避するために、当初はマッカーシー＆デVellis <sup>2</sup>で説明した方法の適応とマウス組織からOPCを精製することが好ましい。このメソッドは、新生児げっ歯類皮質由来する混合グリア培養液から物理的に分離するOPCを伴います。結果は、OLに富んだ文化に分化することができる精製したOPCの人口です。このアプローチは、その比較的短い文化時間や成長因子またはimmunopanning抗体の不必要な要件のために魅力的です。 </p><p class="jove_content">精製された文化の中でOL発展のメカニズムを探ることは有益ですが、それは、髄鞘形成を評価するための最も生理学的に関連する環境を提供していません。ニューロンとの共培養のOLSは、軸索のOLを介した髄鞘形成を制御する分子的基盤への洞察を貸すだろう。多くのOL /ニューロンの共培養の研究については、後根神経節ニューロンは（DRGNs）選択肢のニューロンのタイプであることが証明されている。彼らは、抽出、混入細胞の最小限の量、そして緻密な神経突起のベッドの形成の容易さのため、OLSとの共培養に最適です。ラット/マウスmyelinating xenoculturesを用いた研究が<sup>4-6を</sup>公開されているが、出生後のマウス組織から共培養をmyelinatingなど/ OL DRGNの導出のための方法が記載されていない。ここでは、効果的に予想される結果の例と共に、そのような文化を生産する方法に関する詳細な方法を提示する。これらのメソッドは、OL開発/ myelinating機能に関連する質問に対処するために有用であり、神経科学の分野で有用なツールです。 </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">この記事では、成熟オリゴデンドロサイト（OLS）を生成するために差別化初代培養におけるマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）の豊かな集団を、導出する方法を説明します。さらに、この報告書はマウス後根神経節ニューロン（DRGNs）の神経突起ベッドの上にマウスのOPCを播種によってマウスmyelinating共培養を生成する手法を説明します。</p>

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K ビュー.  Ottawa Hospital Research Institute. この記事では、成熟オリゴデンドロサイト（OLS）を生成するために差別化初代培養におけるマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）の豊かな集団を、導出する方法を説明します。さらに、この報告書はマウス後根神経節ニューロン（DRGNs）の神経突起ベッドの上にマウスのOPCを播種によってマウスmyelinating共培養を生成する手法を説明します。