<p class="jove_content"> Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss von der Multiple Sclerosis Society von Kanada bis RKRWO finanziert ist ein Empfänger ein Stipendium von der Multiple Sclerosis Society von Kanada. SDR ist ein Empfänger von Post-Doctoral Fellowships aus dem Multiple-Sklerose-Gesellschaft von Kanada und kanadischen Institutes of Health Research. </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content"> Keine Interessenskonflikte erklärt. </p>

<p class="jove_content"> Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Isolierung muriner OPCs für die Differenzierung in OL-angereicherten Kulturen oder OL / DRGN Co-Kulturen. Wenn kultivierte allein, differenzieren die OPCs in MBP <sup>+ ve</sup> OLS, produziert Myelin-like membranöse Blatt. Wenn hinzugefügt, um Neuriten Betten DRGN, umhüllen OLs die DRGN Neuriten mit MBP <sup>+ ve</sup> Membran. Dieses Modell profitiert die Erforschung der komplexen Grundlagen über OL-vermittelte axonale ensheathment. </p><p class="jove_content"> Während von großem Wert, ist die Einrichtung eines solchen Kulturen technisch anspruchsvoll. Dazu gehören insbesondere anspruchsvolle Aspekte effizienter Gewebe Verdauung / Dissoziation, die Aufrechterhaltung der ausgewogenen Kulturmedien pH-Wert und DRGN Medien ändert. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Länge der Verdauung, Menge an Gewebe verdaut wird und die Höhe der Verreibung Einfluss auf die Wirksamkeit und Endergebnis der Gewebedissoziation. Es ist nicht für erfahrene Wissenschaftler ungewöhnlich niedrigen zellulären Erträge aus dissoziierten Nervensystem Gewebe zu erhalten. Darüber hinaus neigen murine OPCs zu empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes der Kultur Medien, insbesondere unter alkalischen Bedingungen. Die Pflege der Kulturen bei 8,5% CO <sub>2</sub> zielt darauf ab, dies zu verhindern, da OPCs besser tolerieren leicht sauren Bedingungen über grundlegende erscheinen. Im Hinblick auf die Fütterung DRGNs, Medien ändert sich schnell durchgeführt werden muss, um nicht auszutrocknen den Neuronen, muss jedoch sanft wie nicht stören die Entwicklung von Neuriten Bett. Abrupte Änderungen können Medien verdrängen die Neuriten Bett aus dem Substrat, und wahrscheinlich zu seiner vollständigen Loslösung von dem Deckglas. </p><p class="jove_content"> Das Potenzial Verdienst dieses Modellsystem stark überschattet seine technisch anspruchsvollen Natur. Ein Vorteil dieses Systems ist die Verwendung von postnatalen Mäusen für die Zellkultur Ableitung unter Umgehung der Notwendigkeit, weibliche Zuchttiere zu opfern, um embryonale Gewebe zu ernten. Ein weiterer Vorteil ist die fehlende Voraussetzung für Wachstumsfaktoren (GF) für den Ausbau der OPCs. Mixed glialen Kulturen bieten ein Umfeld, das die Ausbreitung von OPCs, vermutlich wegen der Anwesenheit von Astrozyten-derived trophischen Faktoren unterstützt. Andere Methoden, wie z. B. Ableitung über Neurosphären <sup>7,8,</sup> vertrauen auf die mitogene Eigenschaften von GF wie basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und platelet-derived growth factor (PDGF) für OPC Expansion. Auch mit der Geburt (P5-10) Mäuse für DRGNs vermeidet das Erfordernis der Ergänzung der Kulturmedien mit nerve growth factor (NGF), einen neurotrophen Faktor für die <em>in vitro</em> das Überleben von embryonalen DRGNs <sup>9, 10</sup> erforderlich. Es ist interessant zu vermeiden, mit NGF, wie es wirkt sich negativ auf myelinisierenden Kapazität von OLS, wenn sie mit DRGNs <sup>4</sup> kultiviert. Vermeidung der Verwendung von GF-ergänzt Medien hat auch wirtschaftliche Vorteile, da diese Reagenzien teuer werden, wenn in großem Maßstab eingesetzt. </p><p class="jove_content"> Vielleicht der wichtigste Vorteil dieser Kultur Modells ist seine Ableitung aus Maus-only Gewebe, wodurch die Chancen abzuleiten beiden OPCs und DRGNs aus der Vielzahl von transgenen Mauslinien. Dies ermöglicht die Untersuchung der beiden DRGN und / oder OPC-spezifische Eigenschaften, die Myelinisierung zu regieren. Dies ist besonders wichtig für die Aufklärung der Rezeptor / Ligand-Interaktionen regulieren OL-vermittelte Myelinisierung der Axone. Alles in allem ist diese Technik von großem Wert in Bezug auf neurowissenschaftliche Forschung aufgrund ihrer Anwendungen zum Verständnis der molekularen Signale zugrunde liegenden Myelinisierung. </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Product Name</strong> </td><td> <strong>Firma</strong> </td><td> <strong>Produktnummer</strong> </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319 bis 005-CL </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Menschliche merosin gereinigtes Protein (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Rekombinantes Ratten ciliary neurotrophen Faktors (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-Thyroxin </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-Transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 ergänzen </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Rinderinsulin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiod-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Natriumselenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-desoxyuridin (FUDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papain-Lösung </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-Well-Platten </td><td> CELLSTAR </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> T25-Zellkulturflaschen mit Entlüftungskappe </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm Gewebekulturschalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm Petrischale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 um Filter (optional) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Myelin Basic Protein (MBP) Antikörper </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 Antikörper </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) Antikörper </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-zyklische Nukleotid-3&#39;-Phosphodiesterase (CNP) Antikörper </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actin pan Ab-5-Antikörper </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament-200 (NF)-Antikörper </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulin beta-3-Kette (Tuj1) Antikörper </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) Sekundär-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa 555 Ziege anti-Maus IgG (H + L) Sekundär-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte (IgG) (H + L) Sekundär-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus IgG (H + L)-HRP-konjugierten sekundären Antikörper </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Ratte-IgG (H + L)-HRP-konjugierten sekundären Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Medien Rezepte </p><p class="jove_content"> <strong>100X OL-Supplement *</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Amount hinzufügen</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescin </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Natriumselenit </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiod-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Lagerung bei -80 ° C in 250 ul Aliquots </p>t &quot;&gt; <strong>OL Medien</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Amount hinzufügen</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> 100X OL-Supplement </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Rinderinsulin (von 1 mg / mL Lager) </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Holo-Transferrin (von 33 mg / mL Lager) </td><td> 37,5 ul </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> CNTF (von 50 ng / ul Lager) </td><td> 25 ul </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Mixed Gliazellen Kulturmedien (bis in DMEM gemacht)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Endkonzentration</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% ab Lager lieferbar) </td><td> 33 Einheiten / ml Penicillin und 33 ug / ml Streptomycin </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN Medien (bis in DMEM gemacht)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Endkonzentration</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% ab Lager lieferbar) </td><td> 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Aufschlusslösung Rezepte: </p><p class="jove_content"> <strong>OPC Papain-Lösung (in MEM gemacht)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Endkonzentration</strong> </td></tr><tr><td> Papain-Lösung </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> 360 pg / mL </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 ug / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG Papain-Lösung (in HBSS gemacht)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Endkonzentration</strong> </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> 360 pg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG Collagenase A-Lösung (in HBSS gemacht)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Zutat</strong> </td><td> <strong>Endkonzentration</strong> </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> Identifizierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen OL Entwicklung ist nicht nur entscheidend für die Förderung unserer Kenntnis der OL Biologie, sondern hat auch Implikationen für das Verständnis der Pathogenese der demyelinisierenden Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS). Cellular Entwicklung wird allgemein mit primären Zellkultur-Modellen untersucht. Primäre Zellkultur erleichtert die Auswertung eines bestimmten Zelltyp durch die Bereitstellung einer kontrollierten Umgebung, frei von der Störvariablen, die <em>in vivo</em> sind. Während OL Kulturen von Ratten abgeleitet eine große Menge an Einsicht in OL Biologie zur Verfügung gestellt haben, hat ähnliche Bemühungen zur Schaffung OL Kulturen aus Mäusen, die mit großen Hindernissen erfüllt. Entwicklung von Methoden zur Kultur murine primäre OLs ist zwingend notwendig, um die Vorteile der zur Verfügung stehenden transgenen Mauslinien zu nehmen. </p><p class="jove_content"> Mehrere Methoden zur Extraktion von OPCs von Nagetier Gewebe beschrieben worden, von Neurosphäre Ableitung, Differential Haftung Reinigung und immunopurification <sup>1-3.</sup> Während viele Methoden Erfolg bieten, verlangen die meisten umfangreichen Kultur-mal und / oder teure Ausrüstung / Reagenzien. Um dies zu umgehen, ist reinigend OPCs aus murinen Gewebe mit einer Anpassung der Methode ursprünglich von McCarthy &amp; de VELLIS <sup>2</sup> beschrieben bevorzugt. Bei dieser Methode wird die räumliche Trennung OPCs aus einer gemischten Gliazellen Kultur von neugeborenen Nagern Cortex abgeleitet. Das Ergebnis ist eine gereinigte OPC Bevölkerung, die in eine OL-angereicherten Kultur unterschieden werden können. Dieser Ansatz ist aufgrund seiner relativ kurzen Kulturzeit und der unnötige Voraussetzung für Wachstumsfaktoren oder Immunopanning Antikörper ansprechend. </p><p class="jove_content"> Während der Erkundung der Mechanismen der OL Entwicklung in eine gereinigte Kultur ist informativ, bietet es keine der physiologisch relevanten Umfeld für die Beurteilung der Myelinscheide Bildung. Co-Kultivierung OLS mit Neuronen würden Einblick in die molekularen Grundlagen zur Regelung OL-vermittelte Myelinisierung von Axonen zu verleihen. Für viele OL / Neuron Co-Kultur-Studien haben Spinalganglien Neuronen (DRGNs) nachweislich das Neuron Art der Wahl sein. Sie sind ideal für Co-Kultur mit OLs durch ihre einfache Extraktion, minimale Menge an kontaminierenden Zellen und die Bildung von dichten Neuriten Betten. Während Studien mit Ratte / Maus myelinisierenden xenocultures veröffentlicht worden sind <sup>4-6,</sup> ein Verfahren zur Ableitung solcher OL / DRGN myelinisierenden Co-Kulturen von postnatalen murinen Gewebe wurde nicht beschrieben. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Methoden auf, wie man effektiv produzieren solche Kulturen, zusammen mit Beispielen von den erwarteten Ergebnissen. Diese Methoden sind nützlich für die Behandlung relevanten Fragen OL Entwicklung / myelinisierenden Funktion und sind nützliche Werkzeuge im Bereich der Neurowissenschaften. </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).</p>

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K Aufrufe.  Ottawa Hospital Research Institute. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).