<p class="jove_content"> Ce projet a été financé par une subvention de la Société canadienne de la sclérose d&#39;RKRWO est récipiendaire d&#39;une bourse d&#39;études de la Société canadienne de la sclérose. DTS est un récipiendaire de bourses postdoctorales de la Multiple Sclerosis Society of Canada et les Instituts de recherche en santé. </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content"> Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré. </p>

<p class="jove_content"> Ce rapport décrit une méthode pour isoler les OPC murin de différenciation dans les cultures OL-enrichi ou OL / DRGN co-cultures. Lorsqu&#39;elle est cultivée seule, l&#39;OPC se différencier en MBP <sup>+</sup> LO <sup>VE,</sup> produisant de la myéline comme des feuilles membraneuses. Lorsqu&#39;il est ajouté à DRGN lits neurites, LO enveloppent les neurites DRGN avec MBP <sup>+</sup> membrane <sup>ve.</sup> Ce modèle profite à l&#39;enquête sur les fondements complexes qui régissent l&#39;OL à médiation ensheathment axonale. </p><p class="jove_content"> Tout d&#39;une grande valeur, l&#39;établissement de ces cultures est techniquement difficile. En particulier, les aspects exigeants incluent la digestion des tissus efficace / dissociation, l&#39;entretien de la culture médiatique au pH équilibré, et DRGN changements médias. Il est important de considérer que la durée de la digestion, la quantité de tissu étant digérée et le montant de la trituration affecte le résultat d&#39;efficacité et à la fin de la dissociation des tissus. Il n&#39;est pas inhabituel pour les chercheurs expérimentés d&#39;obtenir de faibles rendements cellulaires des tissus du système nerveux dissociés. En outre, les OPC murins ont tendance à être sensibles aux changements dans le pH du milieu de culture, en particulier dans des conditions alcalines. L&#39;entretien des cultures, à 8,5% de CO <sub>2</sub> vise à empêcher cela, puisque les OPC semblent mieux tolérer des conditions légèrement acides au cours de base. En ce qui concerne DRGNs alimentation, les changements de supports doivent être effectués rapidement pour ne pas dessécher les neurones, cependant, doit être doux pour ne pas perturber le lit de neurites en développement. Changements brusques des médias peuvent déloger le lit neurites du substrat, et le résultat probable dans sa dissociation complète de la lamelle. </p><p class="jove_content"> Le mérite potentiel de ce système modèle éclipse fortement son caractère techniquement exigeante. Un avantage de ce système est l&#39;utilisation de la post-natale des souris pour la dérivation de la culture cellulaire, en contournant la nécessité de sacrifier les femelles reproductrices de récolter des tissus embryonnaires. Un autre avantage est l&#39;absence d&#39;obligation pour les facteurs de croissance (GFS) pour l&#39;expansion de l&#39;OPC. Mixte cultures gliales fournir un environnement qui favorise la propagation des OPC, vraisemblablement en raison de la présence de facteurs trophiques astrocyte dérivées. D&#39;autres méthodes, telles que la dérivation via neurosphères <sup>7,8,</sup> reposent sur ​​les propriétés mitogéniques de GFS tels que le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour l&#39;expansion du CPVP. De même, en utilisant le développement postnatal (P5-10) pour les souris DRGNs évite l&#39;obligation de compléter les milieux de culture avec un facteur de croissance nerveuse (NGF), un facteur neurotrophique requis pour le <em>taux de</em> survie <em>in vitro</em> des embryons DRGNs <sup>9, 10.</sup> Il est intéressant d&#39;éviter d&#39;utiliser le NGF car elle influence négativement la capacité de myélinisation des LO lorsqu&#39;elles sont cultivées avec des DRGNs <sup>4.</sup> Éviter l&#39;utilisation du GF-complété des médias a aussi des avantages économiques, comme ces réactifs devenir coûteux s&#39;il est utilisé à grande échelle. </p><p class="jove_content"> Peut-être l&#39;avantage le plus important de ce modèle est sa culture de dérivation de la souris uniquement les tissus, offrant ainsi la possibilité de tirer à la fois les OPC et les DRGNs de la grande variété de lignées de souris transgéniques. Cela permet pour l&#39;étude de deux DRGN et / ou OPC propriétés spécifiques qui régissent la myélinisation. Cela sera particulièrement important pour l&#39;élucidation des interactions récepteur / ligand régulation OL-médiée myélinisation des axones. En tout, cette technique est d&#39;une grande valeur en ce qui concerne la recherche en neurosciences en raison de ses applications vers la compréhension des signaux moléculaires qui sous-tendent la myélinisation. </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Nom du produit</strong> </td><td> <strong>Société</strong> </td><td> <strong>Numéro de produit</strong> </td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319 à 005-CL </td></tr><tr><td> Hank Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Albumine sérique bovine (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Homme mérosine protéine purifiée (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Recombinante du facteur neurotrophique rat ciliaire (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-thyroxine </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 complément </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> L&#39;insuline bovine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Sélénite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-désoxyuridine (FUDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Solution de papaïne </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 puits de culture tissulaire </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Flacons de culture de tissu T25 avec capuchon de l&#39;évent </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> Boîtes de 10 cm de culture de tissu </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Une collagénase </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 um (optionnel) de filtre </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> La myéline protéine basique (MBP) Anticorps </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 d&#39;anticorps </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> La myéline-associated glycoprotein (MAG) antibody </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cyclique nucléotide 3&#39;-phosphodiestérase (CNP) antibody </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> L&#39;actine pan Ab-5 anticorps </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament-200 (NF) antibody </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Bêta-tubuline trois chaînes (Tuj1) antibody </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H + L) anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 chèvre anti-souris IgG (H + L) anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 chèvre anti-rat (IgG) (H + L) anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-souris IgG (H + L)-HRP anticorps secondaire conjugué </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-rat IgG (H + L)-HRP anticorps secondaire conjugué </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Recettes des médias </p><p class="jove_content"> <strong>OL-100X * Supplément</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>Montant à ajouter</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Sélénite de sodium </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Store à -80 ° C dans 250 aliquotes </p>t <strong>&quot;&gt;</strong> Médias <strong>OL</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>Montant à ajouter</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> OL-100X Supplément </td><td> 250 uL </td></tr><tr><td> L&#39;insuline bovine (de 1 mg / mL de stock) </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 uL </td></tr><tr><td> Holo-transferrine (de 33 mg / mL de stock) </td><td> 37,5 uL </td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> CNTF (de 50 ng / uL stock) </td><td> 25 uL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Mixte des milieux de culture gliales (composé de DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>La concentration finale</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% du stock) </td><td> 33 unités / ml de pénicilline et 33 pg / ml de streptomycine </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN médias (constitué de DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>La concentration finale</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% du stock) </td><td> 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Recettes solution de digestion: </p><p class="jove_content"> <strong>OPC papaïne solution (composé de MEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>La concentration finale</strong> </td></tr><tr><td> Solution de papaïne </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> 360 pg / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 pg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG papaïne solution (composé de HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>La concentration finale</strong> </td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> 360 pg / ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG collagénase Une solution (composé de HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrédient</strong> </td><td> <strong>La concentration finale</strong> </td></tr><tr><td> Une collagénase </td><td> 4 mg / ml </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> Identifier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement OL n&#39;est pas seulement essentielle pour approfondir notre connaissance de la biologie OL, mais a également des implications pour la compréhension de la pathogenèse des maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques (SEP). Développement cellulaire est communément étudié avec primaires modèles de culture cellulaire. Culture de cellules primaires facilite l&#39;évaluation d&#39;un type cellulaire donné en fournissant un environnement contrôlé, sans les variables exogènes qui sont <em>présentes</em> in <em>vivo.</em> Bien que les cultures OL provenant de rats ont fourni une grande quantité de comprendre la biologie de LO, des efforts similaires à établir des cultures OL de souris a été rencontré d&#39;obstacles majeurs. Développer des méthodes de culture murin LO primaire est impératif afin de profiter des lignes disponibles de souris transgéniques. </p><p class="jove_content"> De multiples méthodes pour l&#39;extraction des OPC à partir de tissus de rongeurs ont été décrites, allant de la dérivation Neurosphère, la purification de l&#39;adhérence différentielle et immunopurification <sup>1-3.</sup> Alors que de nombreuses méthodes offrent de succès, la plupart nécessitent des temps de culture extensive et / ou du matériel coûteux / réactifs. Pour contourner cela, purifiant les OPC à partir de tissus murins avec une adaptation de la méthode initialement décrite par McCarthy &amp; de Vellis <sup>2</sup> est préféré. Cette méthode implique physiquement OPC séparant d&#39;une culture mixte gliales provenant cortex des rongeurs nouveau-nés. Le résultat est une population purifiée OPC qui peuvent être différenciées en une culture de l&#39;OL enrichi. Cette approche est attrayante en raison de ses temps de culture relativement courtes et l&#39;exigence inutile pour les facteurs de croissance ou des anticorps immunopanning. </p><p class="jove_content"> Tout en explorant les mécanismes du développement de LO dans une culture purifiée est informatif, il ne fournit pas l&#39;environnement le plus physiologiquement pertinents pour évaluer la formation gaine de myéline. Co-culture avec des neurones LO donnerait un aperçu des fondements moléculaires régulant l&#39;OL à médiation myélinisation des axones. Pour beaucoup de OL / neurone de co-culture des études, dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs) se sont révélés être le type de neurone de choix. Elles sont idéales pour la co-culture avec LO en raison de leur facilité d&#39;extraction, le montant minimal de cellules contaminantes, et la formation de neurites lits denses. Alors que les études utilisant rat / souris myélinisantes xenocultures ont été publiés <sup>4-6,</sup> une méthode pour la dérivation d&#39;une telle OL / DRGN myélinisantes co-cultures de tissus post-natale murin n&#39;a pas été décrite. Nous présentons ici des méthodes détaillées sur la façon de produire efficacement de telles cultures, avec des exemples de résultats escomptés. Ces méthodes sont utiles pour aborder les questions pertinentes pour le développement de LO / fonction myélinisantes, et sont des outils utiles dans le domaine des neurosciences. </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">Cet article décrit les méthodes pour estimer la population enrichie des cellules précurseurs des oligodendrocytes murins (OPC) en culture primaire, qui se différencier pour produire des oligodendrocytes matures (MCO). En outre, ce rapport décrit des techniques pour produire murin myélinisantes co-cultures par semis OPC de la souris sur un lit de neurites de souris dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs).</p>

Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K vues.  Ottawa Hospital Research Institute. Cet article décrit les méthodes pour estimer la population enrichie des cellules précurseurs des oligodendrocytes murins (OPC) en culture primaire, qui se différencier pour produire des oligodendrocytes matures (MCO). En outre, ce rapport décrit des techniques pour produire murin myélinisantes co-cultures par semis OPC de la souris sur un lit de neurites de souris dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs).