<p class="jove_content"> Bu proje, Kanada Multipl Skleroz Derneği RKRWO bir hibe ile finanse edildi Kanada Multipl Skleroz Derneği Bursu bir alıcı. SDR, Kanada ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı. </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content"> Çıkar çatışması ilan etti. </p>

<p class="jove_content"> Bu rapor, kültürleri ya da OL-zenginleştirilmiş DRGN / OL ortak kültürler farklılaşma fare OPC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Yalnız kültür, OPC MBP içine ayırt <sup>+ Ve</sup> EKK, miyelin benzeri membranöz levha üretim. Neurite yatak DRGN eklendiği zaman, OLS MBP DRGN neurites sarmak <sup>+ ve</sup> membran. Bu model, OL-aracılı aksonal ensheathment yöneten karmaşık temellerinin araştırılması yarar sağlar. </p><p class="jove_content"> Büyük bir değer olsa da, bu tür kültürlerin kurulması, teknik olarak çok zordur. Özellikle zorlu yönlerini etkili doku sindirim / disosiasyon, dengeli bir kültür ortamı pH bakım ve DRGN medya değişiklikleri içerir. Sindirim uzunluğu, doku miktarı sindirilir ve öğütme miktarı doku ayrılma etkinliği ve sonuçta etkiler olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Ayrışmış sinir sistemi dokularında düşük hücresel verimi elde etmek için deneyimli araştırmacılar için alışılmadık bir durum değildir. Buna ek olarak, fare OPC, özellikle alkali koşullar altında, kültür ortamı pH değişikliklerine duyarlı olma eğilimindedirler. % 8.5 CO <sub>2</sub> kültürlerin bakım OPC temel üzerinde hafif asidik koşullarda daha iyi tolere görünen bu yana, bu önlemek için amaçlamaktadır. Ancak, medya değişiklikleri, beslenme DRGNs ile ilgili olarak, nöronlar ile kurutun olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir olmalıdır gelişmekte neurite yatak bozmayacak gibi hafif olmalıdır. Ani medya değişiklikleri yüzey neurite yatak, ve lamel tam ayrılma olası sonuç yerinden olabilir. </p><p class="jove_content"> Bu model sisteminin potansiyel liyakat, teknik açıdan zorlu doğa büyük ölçüde düşer. Bu sistemin bir avantajı, embriyonik doku hasat üreme kadın feda etmeye gerek engellemeyi, hücre kültürü derivasyon için post-natal farelerin kullanılması. Diğer bir avantajı OPC genişlemesi için büyüme faktörleri için gereğinin olmaması (GDS). Karışık glial kültürler astrosit türetilen trofik faktörlerin varlığı nedeniyle muhtemelen OPC yayılmasını destekleyen bir ortam sağlar. Türetme yoluyla neurospheres <sup>7,8</sup> gibi diğer yöntemler, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve OPC genişleme için trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF) gibi GF&#39;lerin mitojenik özellikleri güveniyor. Benzer şekilde, postnatal (P5-10) DRGNs için fareler kullanarak, sinir büyüme faktörü (NGF), embriyonik <sup>DRGNs 9, <em>10,</em></sup> in vitro hayatta kalmak için gerekli bir nörotrofik faktör ile kültür ortamı tamamlayan gereği önler . Ilgi DRGNs <sup>4</sup> ile kültüre EKK&#39;nın myelinating kapasitesini olumsuz etkiler olarak NGF kullanmaktan kaçının. Kullanımı kaçınmak GF-desteklenmiş büyük ölçekte kullanılan bu reaktifler pahalı gibi medya da, ekonomik faydaları vardır. </p><p class="jove_content"> Belki de bu kültürün modelin en önemli yararı, bu nedenle, transgenik fare hatları çok çeşitli OPC ve DRGNs elde etmek için fırsatlar sağlayarak, sadece fare dokuları türevidir. Bu her iki DRGN ve / veya miyelinasyonun yöneten OPC-spesifik özellikleri çalışma için izin verir. Bu aksonlar OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen reseptör / ligand etkileşimleri nedenlerine açıklık için özellikle önemli olacaktır. Bu teknikte, miyelinasyonun altında yatan moleküler ipuçları anlamaya yönelik uygulamaları nedeniyle nörolojik araştırma açısından büyük bir değer taşımaktadır. </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ürün Adı</strong> </td><td> <strong>Şirket</strong> </td><td> <strong>Ürün Numarası</strong> </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) </td><td> Çok hücreli </td><td> 319-005-CL </td></tr><tr><td> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medya (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin (Pen / Strep) </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> İnsan merosin saflaştırılmış protein (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Rekombinant sıçan siliyer nörotrofik faktör (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroksin </td><td> BioChemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 takviyesi </td><td> Gibco </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Sığır insülin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Sodyum Selenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-dezoksiuridin (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papain çözüm </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-iyi doku kültürü yemekleri </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Havalandırma kapağı ile T25-doku kültürü şişeleri </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm doku kültürü yemekleri </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm&#39;lik petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 mikron filtre (opsiyonel) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Miyelin Temel Protein (MBP) Antikor </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 antikor </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Miyelin İlişkili Glikoprotein (MAG) antikor </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-Siklik nükleotid 3&#39;-fosfodiesteraz (CNP) antikor </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Aktin pan Ab-5 antikor </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Nörofilaman-200 (NF) antikor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulin beta-3 zinciri (Tuj1) antikoru </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L) sekonder antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 keçi anti-fare IgG (H + L) sekonder antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 keçi anti-sıçan (IgG) (H + L) sekonder antikoru </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare IgG (H + L)-HRP konjuge sekonder antikor </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Keçi anti-sıçan IgG (H + L)-HRP konjuge sekonder antikor </td><td> Santa Cruz Biyoteknoloji </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Medya Tarifler </p><p class="jove_content"> <strong>OL-100X Ek *</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Eklenecek tutar</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.02 g </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0.6 mg </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Sodyum Selenit </td><td> 0.05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Mağaza -80 ° C 250 mcL alikot </p>&quot;t&gt; <strong>OL medya</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Eklenecek tutar</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23.75 ml </td></tr><tr><td> 100X OL-Ek </td><td> 250 mcL </td></tr><tr><td> Sığır insülin (1 mg / ml stok) </td><td> 125 mcL </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250 mcL </td></tr><tr><td> Holo-transferrin (33 mg / ml stok) </td><td> 37.5 mcL </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> 500 mcL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 mcL </td></tr><tr><td> CNTF (50 mcL ng / stok) </td><td> 25 mcL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Karışık glial kültür ortamı (DMEM içinde oluşur)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Final konsantrasyonu</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (% 0.33 stok) </td><td> 33 adet / ml penisilin ve 33 mg / ml Streptomisin </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> % 1 </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN medya (DMEM içinde oluşan)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Final konsantrasyonu</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Pen / Strep (stok% 1) </td><td> 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml Streptomisin </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Sindirim Çözüm Tarifler: </p><p class="jove_content"> <strong>OPC papain solüsyonu (MEM yılında yapılan)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Final konsantrasyonu</strong> </td></tr><tr><td> Papain çözüm </td><td> 1.54 mg / ml </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> 360 mcg / mL </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mcg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG papain solüsyonu (HBSS içinde oluşan)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Final konsantrasyonu</strong> </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 1.54 mg / ml </td></tr><tr><td> L-sistein </td><td> 360 mcg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG kollajenaz (HBSS içinde yapılmış bir çözüm)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Bileşen</strong> </td><td> <strong>Final konsantrasyonu</strong> </td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> 4 mg / ml </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> OL geliştirme altında yatan moleküler mekanizmaları belirleme OL biyoloji bilgimizi ilerletmek için yalnızca kritik değil, Multipl Skleroz (MS) gibi demiyelinizan hastalıkların patogenezinde anlamak için de etkileri vardır. Hücresel gelişimi sık primer hücre kültür modelleri ile çalışılmaktadır. Primer hücre <em>kültürü, in vivo</em> olarak bulunan gereksiz değişkenlerin kontrollü bir ortam sağlayarak, belirli bir hücre tipi değerlendirilmesi kolaylaştırır . Sıçanlarda türetilen OL kültürler OL biyoloji içgörü büyük bir miktar olsa da, fareler OL kültürler kurmayı benzer çabalar büyük engellerden ile karşılandı. Transgenik fare hatları yararlanmak amacıyla kültür fare primer OLS için yöntemler geliştirmek zorunludur. </p><p class="jove_content"> Neurosphere türev, diferansiyel yapışma arıtma ve <sup>1-3</sup> immunopurification arasında değişen, kemirgen dokusundan OPC çıkarılması için birden çok yöntem tarif edilmiştir. Pek çok yöntem başarı sunarken, en kapsamlı kültür ve / veya pahalı ekipman / reaktifler gerektirir. Bunu aşmak için, başlangıçta McCarthy &amp; de Vellis <sup>2</sup> tarafından açıklanan yöntemi bir adaptasyon fare doku OPC arındırıcı tercih edilir. Bu yöntem, fiziksel neonatal kemirgen korteks türetilen karışık bir glial kültüründen ayıran OPC içerir. Sonuç, bir saflaştırılmış OPC nüfusu OL-zenginleştirilmiş kültür ayrılabilir. Bu yaklaşım, görece kısa bir kültür zaman ve büyüme faktörleri veya immunopanning antikorlar için gereksiz gereksinimi nedeniyle itiraz ediyor. </p><p class="jove_content"> , Saflaştırılmış bir kültür OL gelişme mekanizmaları keşfetmek bilgilendirici olmasına rağmen, miyelin kılıf oluşumu değerlendiren için en önemli fizyolojik bir ortam sağlamaz. Co-kültür OLS nöron aksonları OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen moleküler temellerinin içgörü ödünç. / OL nöron ko-kültür çalışmaları birçok insan için, dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) seçim nöron türü olduğu kanıtlanmış. Ekstraksiyon, kirlenmesine neden olan hücreler az miktarda ve yoğun neurite yatak oluşumu kolaylığı nedeniyle OLS ile ko-kültür için idealdir. <sup>4-6</sup> xenocultures myelinating sıçan / fare kullanarak çalışmalar yayınlanmış olsa da, böyle derivasyon için bir yöntem DRGN / OL post-natal fare doku ortak kültürler myelinating tanımlanmıştır değil. Burada etkili beklenen sonuçlar örnekleri ile birlikte, bu tür kültür üretmek için nasıl ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemler OL geliştirme / myelinating fonksiyonu ile ilgili sorulara yanıt için yararlı ve faydalı araçlar sinirbilim alanında. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues at JoVE.com

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.</p>

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K Görüntüleme.  Ottawa Hospital Research Institute. Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.