<p class="jove_content"> Este proyecto fue financiado por una beca de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá a RKRWO es beneficiario de una beca de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá. El DEG es un receptor de becas post-doctorales de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y de Institutos Canadienses de Investigación en Salud. </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content"> No hay conflictos de interés declarado. </p>

<p class="jove_content"> Este informe describe un método para aislar OPC murino para la diferenciación de las culturas OL-enriquecido o OL / DRGN co-culturas. Cuando se cultiva solo, el OPC se diferencian en MBP <sup>+</sup> LB <sup>ve,</sup> la producción de mielina, como las hojas membranosas. Cuando se añade a DRGN camas neuritas, LB envuelven las neuritas DRGN con MBP <sup>+</sup> membrana <sup>ve.</sup> Este modelo beneficia a la investigación de los complejos fundamentos que rigen OL mediada ensheathment axonal. </p><p class="jove_content"> Aunque de gran valor, el establecimiento de estas culturas es un reto técnico. En particular, los aspectos difíciles incluyen la digestión del tejido eficiente / disociación, el mantenimiento de la cultura equilibrada pH del medio, y los cambios DRGN los medios de comunicación. Es importante tener en cuenta que la longitud de la digestión, la cantidad de tejido que se digieren y la cantidad de trituración afecta el resultado de la eficacia y al final de la disociación del tejido. No es inusual para los investigadores con experiencia para obtener bajos rendimientos celulares de disociar los tejidos del sistema nervioso. Además, los OPC murino tienden a ser sensibles a los cambios en el pH del medio de cultivo, especialmente bajo condiciones alcalinas. El mantenimiento de los cultivos en el 8,5% de CO <sub>2</sub> tiene por objeto prevenir esto, ya que los OPC parecen tolerar mejor las condiciones más básicas ligeramente ácido. En cuanto a DRGNs alimentación, cambios en los medios debe realizarse rápidamente ya que no para desecar las neuronas, sin embargo, debe ser suave como para no interrumpir la cama neuritas en desarrollo. Cambios bruscos de medios puede desplazar la cama neuritas del sustrato, y el resultado probable de su disociación completa de la cubreobjetos. </p><p class="jove_content"> El mérito potencial de este modelo de sistema enormemente eclipsa su naturaleza exigente técnicamente. Una de las ventajas de este sistema es el uso de post-natal para la derivación de los ratones de cultivo celular, evitando la necesidad de sacrificar las hembras reproductoras de la cosecha del tejido embrionario. Otra ventaja es la falta de exigencia de los factores de crecimiento (FC) para la expansión de las OPC. Mezcla de culturas gliales ofrecen un entorno que apoye la difusión de las OPC, presumiblemente debido a la presencia de factores tróficos astrocitos derivados. Otros métodos, como la derivación a través de neuroesferas <sup>7,8,</sup> se basan en las propiedades mitogénicas de FC como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el derivado de plaquetas factor de crecimiento (PDGF) para la expansión de OPC. Del mismo modo, el uso postnatal (P5-10) de los ratones DRGNs evita la necesidad de complementar los medios de cultivo con el factor de crecimiento nervioso (NGF), un factor neurotrófico necesarios para la <em>supervivencia</em> in <em>vitro</em> de embriones DRGNs <sup>9, 10.</sup> Es de interés para evitar el uso de NGF, ya que influye negativamente en la capacidad de myelinating LB cuando se cultivan con DRGNs <sup>4.</sup> Evitar el uso de GF-complementado los medios de comunicación también tiene beneficios económicos, ya que estos reactivos ser costoso cuando se utiliza a gran escala. </p><p class="jove_content"> Tal vez el beneficio más importante de este modelo de cultivo es su derivación de ratón sólo los tejidos, proporcionando así las oportunidades para obtener los OPC y DRGNs de la amplia variedad de líneas de ratones transgénicos. Esto permite el estudio de ambos DRGN y / o OPC propiedades específicas que rigen la mielinización. Esto será especialmente importante para dilucidar las interacciones receptor / ligando que regulan OL mediada por la mielinización de los axones. En total, esta técnica es de gran valor en cuanto a investigación en neurociencias, debido a sus aplicaciones a la comprensión de las señales moleculares que subyacen en la mielinización. </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Nombre del producto</strong> </td><td> <strong>Empresa</strong> </td><td> <strong>Número de producto</strong> </td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Multicelda </td><td> 319 a 005-CL </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Mínimo de los medios de comunicación esencial (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (penicilina / estreptomicina) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Humanos merosina proteico purificado (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> El factor recombinante de rata neurotrófico ciliar (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroxina </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> Suplemento B27 </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triyodo-L-tironina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Selenita de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (FUDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> La papaína solución </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 y los platos de cultivo de tejidos </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Frascos de cultivo de tejidos-T25 con la tapa del respiradero </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm platos de cultivo de tejidos </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm de una caja de petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Colagenasa A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 micras filtro (opcional) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Proteína básica de mielina (MBP) Anticuerpo </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Mielina glicoproteína asociada (MAG) de anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cíclico de nucleótido 3&#39;-fosfodiesterasa (CNP) de anticuerpos </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actina pan Ab-5 de anticuerpos </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilamentos-200 (NF) de anticuerpos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Beta-3 de cadena tubulina (Tuj1) de anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H + L) anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 cabra anti-ratón IgG (H + L) anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 cabra anti-rata (IgG) (H + L) anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón IgG (H + L)-HRP anticuerpo secundario conjugado </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> De cabra anti-IgG de rata (H + L)-HRP anticuerpo secundario conjugado </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Los medios de comunicación Recetas </p><p class="jove_content"> <strong>OL-100X Suplemento *</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Cantidad a añadir</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Selenita de sodio </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triyodo-L-tironina </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Almacene a -80 ° C en 250 alícuotas </p>t &quot;&gt; <strong>los medios de comunicación OL</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Cantidad a añadir</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 ml </td></tr><tr><td> OL-100X Suplemento </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> Insulina bovina (de 1 mg / ml) </td><td> 125 l </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> Holo-transferrina (de 33 mg / ml) </td><td> 37,5 l </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 l </td></tr><tr><td> CNTF (de 50 ng / mL de archivo) </td><td> 25 l </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Mezcla de medios de cultivo gliales (compuesta en DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>La concentración final</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (0,33% del stock) </td><td> 33 unidades / ml de penicilina y estreptomicina 33 mg / ml </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN los medios de comunicación (hecho en DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>La concentración final</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (1% del stock) </td><td> 100 unidades / ml de penicilina y estreptomicina 100 mg / ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Recetas de la digestión de solución: </p><p class="jove_content"> <strong>OPC papaína solución (compuesto en el MEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>La concentración final</strong> </td></tr><tr><td> La papaína solución </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mg / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mg / ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG papaína solución (hecho en HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>La concentración final</strong> </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mg / ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG colagenasa Una solución (hecho en HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>La concentración final</strong> </td></tr><tr><td> Colagenasa A </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> Identificar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo OL no sólo es fundamental para ampliar nuestro conocimiento de la biología OL, pero también tiene implicaciones para la comprensión de la patogénesis de las enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM). Desarrollo celular es comúnmente estudiadas con modelos de cultivos celulares primarios. Cultivo de células primarias facilita la evaluación de un tipo de célula, proporcionando un ambiente controlado y libre de las variables externas que están presentes <em>en vivo.</em> Mientras que las culturas OL derivadas de ratas han proporcionado una gran cantidad de conocimiento de la biología OL, esfuerzos similares en el establecimiento de cultivos de OL de los ratones se ha encontrado con obstáculos importantes. El desarrollo de métodos de cultivo primario LB murino es imprescindible a fin de tomar ventaja de las líneas de ratones transgénicos disponibles. </p><p class="jove_content"> Múltiples métodos para la extracción de OPC a partir de tejido de roedores se han descrito, desde la derivación neuroesfera, purificación y adhesión diferencial inmunopurificación <sup>1-3.</sup> Mientras que muchos métodos ofrecen el éxito de la mayoría, requieren tiempos de amplia cultura y / o equipos costosos / reactivos. Para evitar esto, purificación de OPC a partir de tejido murino con una adaptación del método descrito originalmente por McCarthy y de Vellis <sup>2</sup> es preferido. Este método consiste en separar físicamente los OPC a partir de un cultivo mixto gliales derivadas de cortezas de roedores recién nacidos. El resultado es una población purificada OPC que pueden diferenciarse en una cultura OL-enriquecido. Este enfoque es atractivo debido a su tiempo de cultivo relativamente corto y el requisito innecesario para los factores de crecimiento o anticuerpos immunopanning. </p><p class="jove_content"> Mientras explora los mecanismos de desarrollo OL en una cultura purificada es informativo, no proporciona el entorno más fisiológicamente relevantes para la evaluación de la formación de la vaina de mielina. Co-cultivo LB con las neuronas que ayudan a comprender la las bases moleculares que regulan la OL mediada por la mielinización de los axones. Para muchos OL / co-cultivo de neuronas estudios, las neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRGNs) han demostrado ser el tipo de neurona de la elección. Son ideales para el co-cultivo con LB, debido a su facilidad de extracción, cantidad mínima de células contaminantes, y la formación de neuritas camas densas. Mientras que los estudios con ratas / ratones myelinating xenocultures han sido publicados <sup>por 4-6,</sup> un método para la obtención de tales OL / DRGN myelinating co-cultivos de post-natal tejido murino no se ha descrito. Aquí se presentan los métodos detallados sobre la manera de producir eficazmente estos cultivos, junto con ejemplos de los resultados esperados. Estos métodos son útiles para abordar cuestiones relacionadas con el desarrollo OL / myelinating función, y son herramientas útiles en el campo de la neurociencia. </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).</p>

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K vistas.  Ottawa Hospital Research Institute. En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).