<p class="jove_content"> Este projeto foi financiado por uma doação da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá para RKRWO é um receptor de um Studentship da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá. SDR é um receptor de Bolsas de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá e Canadian Institutes of Health Research. </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content"> Não há conflitos de interesse declarados. </p>

<p class="jove_content"> Este relatório descreve um método para isolar OPCs murino para a diferenciação em culturas OL-enriquecido ou OL / DRGN co-culturas. Quando cultivadas por si só, o OPCs diferenciar em MBP <sup>+ ve</sup> OLS, produzindo mielina como folhas membranosas. Quando adicionado ao DRGN camas neurite, OLS envolver o neurites DRGN com MBP <sup>+</sup> membrana <sup>ve.</sup> Este modelo beneficia a investigação dos fundamentos complexos que regem OL-mediada ensheathment axonal. </p><p class="jove_content"> Embora de grande valor, o estabelecimento de tais culturas é um desafio técnico. Em particular, os aspectos exigentes incluem a digestão do tecido eficiente / dissociação, manutenção de pH equilibrado meios de cultura, e as mudanças DRGN mídia. É importante considerar que o comprimento da digestão, a quantidade de tecido a ser digerida e da quantidade de trituração afeta o resultado final da eficácia e da dissociação do tecido. Não é incomum para investigadores experientes para obter baixos rendimentos a partir de celulares dissociados tecidos do sistema nervoso. Além disso, OPCs murino tendem a ser sensíveis às mudanças no pH do meio de cultura, especialmente sob condições alcalinas. A manutenção de culturas em 8,5% CO <sub>2</sub> visa evitar isso, desde OPCs parecem tolerar melhor as condições mais básicas ligeiramente ácido. Com relação ao DRGNs alimentação, alterações de mídia deve ser realizada rapidamente para não desidratar os neurônios, no entanto, deve ser suave para não perturbar a cama neurite em desenvolvimento. Mudanças bruscas de mídia pode desalojar a cama neurite do substrato, e que resultam em sua dissociação completa da lamela. </p><p class="jove_content"> O mérito potencial deste sistema modelo muito ofusca sua natureza tecnicamente exigente. Uma vantagem deste sistema é a utilização de ratos pós-natal para derivação de cultura de células, evitando a necessidade de sacrifício fêmeas reprodutoras para a colheita de tecido embrionário. Outra vantagem é a falta de exigência de fatores de crescimento (GFs) para a expansão da OPCs. Mistas culturas gliais proporcionar um ambiente que suporta a propagação de OPCs, provavelmente devido à presença de fatores de astrócitos derivados trófica. Outros métodos, como a derivação via neurospheres <sup>7,8,</sup> invocar as propriedades mitogênica da FG, como fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e das plaquetas fator de crescimento derivado (PDGF) para expansão da OPC. Da mesma forma, usando pós-natal (P5-10) para ratos DRGNs evita a necessidade de complementar os meios de cultura com fator de crescimento neural (NGF), um fator neurotrófico necessários para a sobrevivência <em>in vitro</em> de embriões DRGNs <sup>9, 10.</sup> É de interesse para evitar o uso de NGF, uma vez que influencia negativamente a capacidade myelinating de OLS quando cultivadas com DRGNs <sup>4.</sup> Evitando o uso de GF-suplementado mídia também tem benefícios econômicos, uma vez que estes reagentes tornar-se caro quando usado em larga escala. </p><p class="jove_content"> Talvez o benefício mais importante deste modelo de cultura é sua derivação do rato-somente tecidos, proporcionando assim as oportunidades para derivar tanto OPCs e DRGNs da grande variedade de linhas de ratinhos transgénicos. Isto permite o estudo de ambos e DRGN / ou OPC propriedades específicas que regem a mielinização. Isto será especialmente importante para a elucidação das interações receptor / ligante regulação OL-mediada mielinização dos axônios. Ao todo, esta técnica é de grande valor com relação à pesquisa em neurociência, devido à suas aplicações para a compreensão dos sinais moleculares subjacentes mielinização. </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Nome do produto</strong> </td><td> <strong>Companhia</strong> </td><td> <strong>Número de produtos</strong> </td></tr><tr><td> Modificado Dulbecco Eagle Medium (DMEM) </td><td> Multicélulas </td><td> 319-005-CL </td></tr><tr><td> Solução salina balanceada de Hank (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Mínimo Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-l-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Humana merosina proteína purificada (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Recombinante rato fator neurotrófico ciliar (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroxina </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 suplemento </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Selenito de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-deoxiuridina (FuDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Solução de papaína </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 pratos bem a cultura de tecidos </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Frascos T25 tecido-cultura com tampa da abertura </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 centímetros cultura pratos tecido </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 centímetros placa de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 mm filtro (opcional) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Mielina Básico Protein (MBP) Antibody </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 anticorpos </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Mielina Associated Glicoproteína anticorpos (MAG) </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cíclico-fosfodiesterase nucleotídeo 3&#39;-anticorpos (CNP) </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actina pan-5 Ab de anticorpos </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilamento-200 de anticorpo (NF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Beta-3 tubulina cadeia (Tuj1) de anticorpos </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L) anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 cabra anti-camundongo IgG (H + L) anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 cabra anti-rato (IgG) (H + L) anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Cabra anti-camundongo IgG (H + L)-HRP conjugado anticorpo secundário </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Cabra anti-IgG de rato (H + L)-HRP conjugados de anticorpos secundários </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Receitas da mídia </p><p class="jove_content"> <strong>OL-100X Suplemento *</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Quantidade para adicionar</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Selenito de sódio </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> * Conservar a -80 ° C em 250 mL alíquotas </p>t &quot;&gt; <strong>mídias OL</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Quantidade para adicionar</strong> </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> Suplemento OL-100X </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> Insulina bovina (de um estoque mg / mL) </td><td> 125 mL </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> Holo-transferrina (de 33 ações mg / mL) </td><td> 37,5 mL </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 mL </td></tr><tr><td> CNTF (de 50 ações ng / mL) </td><td> 25 mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>Mista glial meios de cultura (confeccionados em DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentração final</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% do estoque) </td><td> 33 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 33 mg / mL </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN media (confeccionados em DMEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentração final</strong> </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% do estoque) </td><td> 100 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_step"> Solução Receitas digestão: </p><p class="jove_content"> <strong>OPC papaína solução (composta em MEM)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentração final</strong> </td></tr><tr><td> Solução de papaína </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mcg / mL </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mcg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG papaína solução (composta em HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentração final</strong> </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mcg / mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG colagenase solução A (confeccionados em HBSS)</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Ingrediente</strong> </td><td> <strong>Concentração final</strong> </td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content"> Identificar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento OL não é apenas fundamental para ampliar nosso conhecimento da biologia OL, mas também tem implicações para a compreensão da patogênese de doenças desmielinizantes, como esclerose múltipla (MS). Desenvolvimento celular é comumente estudada com modelos de cultura primária da célula. Cultura de células primárias facilita a avaliação de um tipo de célula dada por fornecer um ambiente controlado, livre das variáveis ​​externas que estão presentes <em>in vivo.</em> Enquanto culturas OL derivados de ratos têm proporcionado uma grande quantidade de insights sobre a biologia OL, esforços semelhantes ao estabelecimento de culturas OL de camundongos, foi recebido com grandes obstáculos. Desenvolvimento de métodos para a cultura murino OLS primário é imperativa, a fim de aproveitar as linhas disponíveis camundongo transgênico. </p><p class="jove_content"> Vários métodos para a extração de OPCs a partir de tecido de roedores têm sido descritos, variando de derivação neurosphere, purificação de adesão diferencial e immunopurification <sup>1-3.</sup> Embora muitos métodos oferecer maior sucesso, requerem tempos de cultivo extensivo e / ou equipamentos de alto custo / reagentes. Para contornar isso, purificando OPCs do tecido murino com uma adaptação do método originalmente descrito por McCarthy &amp; de Vellis <sup>2</sup> é o preferido. Este método envolve fisicamente OPCs separação de uma cultura mista glial derivado de córtices roedores neonatal. O resultado é uma população purificada OPC que podem ser diferenciados em uma cultura OL-enriquecido. Esta abordagem é atraente devido ao seu tempo relativamente curto a cultura ea exigência desnecessária para fatores de crescimento ou anticorpos immunopanning. </p><p class="jove_content"> Enquanto explora os mecanismos de desenvolvimento OL em uma cultura purificada é informativo, não proporcionar o ambiente mais fisiologicamente relevantes para a avaliação de mielina formação da bainha. Co-cultura de MQO com os neurônios emprestaria visão sobre as bases moleculares que regulam OL-mediada mielinização dos axônios. Para muitos OL / neurônio co-cultura estudos, os neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs) provaram ser o tipo de neurônio de escolha. Eles são ideais para co-cultura com MQO, devido à sua facilidade de extração, quantidade mínima de células contaminantes, e formação de camas neurite denso. Enquanto estudos usando ratos / mouse myelinating xenocultures foram publicados <sup>4-6,</sup> um método para a derivação de tais OL / DRGN myelinating co-culturas de pós-natal do tecido murino não tem sido descrita. Aqui apresentamos métodos detalhados sobre a forma de produzir tais culturas, juntamente com exemplos de resultados esperados. Estes métodos são úteis para tratar de questões relevantes para o desenvolvimento OL / função myelinating, e são ferramentas úteis no campo da neurociência. </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).</p>

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.0K visualizações.  Ottawa Hospital Research Institute. Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).