Danilo Maddalo ist ein Empfänger ein Forschungsstipendium als Young Investigator Group (YIG) aus dem Karlsruhe Institute of Technology.

1. Aussäen der Zellen <ol><li> Bevor Sie beginnen, wärmen das Kulturmedium, das PBS 1X und das Trypsin in einem Wasserbad bei 37 ˚ C </li><li> Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen das Medium. </li><li> Sanft gelten 5 ml PBS 1X auf die Zellen, um sie zu waschen. </li><li> Saugen Sie das PBS 1X und gelten 1 ml Trypsin enthält 0,025% EDTA. </li><li> Vorsichtig dreht die Platte um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsin haben. </li><li> Legen Sie die Zellen im Brutschrank bei 37 ˚ C für 5-10 Minuten (je nach Zelltyp). Von Zeit zu Zeit überprüfen, ob Zellen werden durch Schütteln der Platte abgelöst. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10-20 ml Medium und sammeln sie in einem 50 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Beckman Zähler. Die Anzahl der Zellen sollte ausreichen, um ein Zusammenfluss von ca. 60-70% zu gewährleisten. </li><li> Platte der Zellen und ermöglichen ihnen, Samen für 6-8 Stunden. </li></ol> 2. Transfection <ol><li> Vor der Transfektion Aufwärmen ein Aliquot von Serum-freiem Medium in einem Wasserbad bei 37 ˚ C. </li><li> Bringen Sie die X-treme Gene 9 bis Raumtemperatur. </li><li> Pipettieren der serumfreien Medium in 2 Eppendorf-Röhrchen (1 Tube = 1 Transfektion). </li><li> Pipettieren Sie die X-treme Gene 9 in der serumfreien Medium zu achten, dass die Spitze nicht berühren Kunststoff Wand des Eppendorf und Inkubation für 5 Minuten. In der Zwischenzeit bereiten sich zwei DNA-Mix in eine Tube vermischen die Plasmide für die Renilla, Glühwürmchen und einem leeren Vektor-Steuerung, in ein anderes Rohr Renilla, Glühwürmchen und das molekulare Chaperon. </li><li> Fügen Sie die DNA-Mix zu jedem eppendorf mit serumfreiem Medium + X-treme Gene 9, Vortex und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten. </li><li> Fügen Sie tropfenweise jeden Mix auf jeder Platte und inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2 </li></ol> 3. Die Aufteilung der Zellen <ol><li> 24 Stunden nach der Transfektion trypsinize die Zellen wie unter 1.4 beschrieben - 1,6 und verdünnen, um eine endgültige Konfluenz von 60-70% in einer 6-Well-Platte. </li><li> Bereiten Sie eine Platte für die Nicht-Schock-Steuerung und so viele Platten wie die Recovery-Zeit Punkte, die analysiert werden müssen, wie gezeigt, in Abb.. 2. </li></ol> 4. Heat shock <ol><li> Für Hitzeschock, pre-warm serum-haltigem Medium in einem Wasserbad bei 37 ˚ C. </li><li> Bereiten Sie &quot;Hitzeschock-Puffer&quot; durch Verdünnung in serum-haltigem Medium Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml und MOPS bis 20 mM. </li><li> Jetzt nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und saugen das Medium. </li><li> Fügen Sie in jede Vertiefung 1 ml &#39;Heat Shock Puffer&#39;, und inkubieren für 30 Minuten bei 37 ˚ C und 5% CO 2 (enthält auch die Referenz-Platte in dieser Behandlung). Dies wird de novo Proteinsynthese zu stoppen. </li><li> In der Zwischenzeit Schalter auf einem Wasserbad und stellen Sie die temperatur bei 45 ˚ C. </li><li> Nach der Inkubation, verschließen Sie die Deckel der Platten mit Parafilm zuvor geschnitten in Streifen. Die Referenz Platte (100% der refolfed firefly) ist in den Inkubator verlassen. </li><li> Die Inkubation bei 45 ˚ C für 30 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die Platten aus dem Wasserbad, entfernen Sie die Parafilm und stellte die Teller zurück in den Inkubator, um Erholung zu ermöglichen. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt der Ernte der Zellen und waschen Sie sie in PBS 1X durch Zentrifugation bei 2000Xg für 1 Minute bei 4 ˚ C. </li></ol> 5. Zelllyse und Luciferase-Assay <ol><li> Für eine effiziente Lyse, Snap freeze das Zellpellet in flüssigem Stickstoff. </li><li> Add 200 ul der passiven Lysepuffer verdünnt 1:5 in doppelt destilliertem Wasser in einem Glasrohr. </li><li> Add 30 ul Zelllysat in einer 96-Well-Platte. Jede Probe wird in dreifacher Ausführung pipettiert. </li><li> Nur die &quot;nicht schockiert&quot; Referenzproben verwendet werden, umLesen Sie Renilla-Luciferaseaktivität, da dieser Schritt wird verwendet, um gleich Transfektionseffizienz zu überprüfen. </li><li> Bereiten Sie die Lösungen für den Test. Für das Luciferin-Lösung verdünnt Luciferin zu einer Endkonzentration von 0,2 mM in Gly-Gly-Puffer. Für die Reaktion Puffer verdünnt, DTT und ATP zu 1mm Endkonzentration in Gly-Gly-Puffer. Für Coelenterazin Reaktionspuffer verdünnen Coelenterazin zu einer Endkonzentration von 0,2 uM in Coelenterazin Puffer. Keep Luciferin-Lösung und Coelenterazin Reaktionspuffer Licht geschützt. </li><li> Setzen Sie nun den 96-Well-Platte in das Luminometer und starten Sie das Programm &#39;Wallac 1420 Workstation &quot;. </li><li> Führen Sie das Pump1 in das Falcon-Röhrchen mit dem Coelenterazin-Lösung. Schließen Sie den Deckel so kein Licht in Kontakt mit dem Rohr kommen. </li><li> Wählen Sie aus dem Menü die Option &#39;Dispenser Wartung &quot;und kreuzen Sie Pump1. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;Fill&quot;. </li><li> So bearbeiten Sie die Platte Layout wählen Sie die Option &#39;Explore-Protokoll und die Ergebnisse &quot;auf der Speisekarte. Wählen Sie das Protokoll, und doppelklicken Sie darauf. Wählen Sie nun den Brunnen zu lesen. </li><li> Zurück zu &quot;Wallac Manager &#39;und klicken Sie auf&#39; Start &#39;. Die Reaktion zwischen dem Renilla-Luciferase und seinem Substrat Coelenterazin emittiert Licht mit einer Peak-Wellenlänge von 482 nm auf. </li><li> Nach der Lesung zum Thema &quot;Dispenser Wartung&quot; und wählen Sie &quot;Leer&quot; und Pump1 alle der verbleibenden Lösung zurück Freisetzung in die Röhre. </li><li> Bewegen Sie nun den Schlauch zu einem Falcon-Röhrchen mit Wasser und kreuzen Sie &#39;Flush&#39;. </li><li> Nach dem Spülschritt, leeren Sie den Schlauch durch die Auswahl &quot;Empty&quot;. </li><li> Das Röhrchen aus Pump1 im Reaktionspuffer Falcon-Röhrchen und der von Pumpe 2 in das Luciferin Falcon-Röhrchen. </li><li> Ändern Sie die Platte Layout. </li><li> Wählen Sie &quot;Fill&quot; für Pump1 und Pumpe 2 aus dem &#39;Dispenser Maintenance &quot;-Menü. </li><li> Wählen Sie das Protokoll und starten Sie das Lesen. Die Reaktion zwischen dem Firefly Luciferase und ihr Substrat Luciferin emittiert Licht mit einer Peak-Wellenlänge von 560 nm auf. </li><li> Am Ende der Lesung wiederholen Sie den Vorgang Empty-Flush-Empty für Pump1 und Pumpe2. </li><li> Die Ergebnisse sind nun in der &#39;Wallac 1420 Explorer &quot;zur Verfügung. </li><li> Jeder Versuch, einen Assay-Nummer zugeordnet ist, username, Beginn und Ende Datum. </li><li> Die Ergebnisse können nun als Excel-Datei exportiert werden. </li><li> 1: Für die Berechnungen werden die Zellen in drei Gruppen eingeteilt. nicht schockiert Referenzproben (als 100% des refolded Glühwürmchenluciferase), 2. Zellen ohne molekulares Chaperon und Hitzeschock, 3. Zellen mit molekularen Chaperon und Hitzeschock. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Rückfaltungsmethoden wird direkt an den Zeitpunkt der Wiederherstellung daher zu prüfen, im Zusammenhang, wenn das System arbeitet pro<html> Perly, hat einen Test durchgeführt Sammeln der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten werden. Eine direkte Korrelation Zeit / Anteil der Rückfaltung zeigt an, dass das Experiment wurde ordnungsgemäß durchgeführt und stellt somit ein limitierender Faktor. Es sollte jedoch immer berücksichtigt werden, dass Rückfaltung nach Hitzeschock ist eine Sättigung Veranstaltung und daher eine angemessene zeitliche Verlauf Analyse sollte vor Beginn eines jeden Experiments durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Übersicht des Experiments. In vivo Rückfaltung Test erfordert 3 bis 4 Tagen abgeschlossen sein. Am Tag 1 Zellen ausgesät und transfiziert. Der folgende Tag-Zellen werden in einem kleineren Format aufgeteilt und an Tag 3 sind sie Hitzeschock. An dieser Stelle besteht die Möglichkeit, die Luciferase-Assay direkt nach der Ernte der Zellen durchzuführen oder das Zellpellet bei -80 ° C zu sparen und führen Sie die Tests in einem anderen Moment _content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Zellteilung. Am Tag 2 Zellen in einer 6-Well-Platte aufgeteilt. Jede Transfektion wird in einem gut verdünnt werden, um all die Transfektion auf der gleichen Platte haben. Jede Platte wird auf einen bestimmten Erholungszeit und einem nicht schockiert Referenzplatte entsprechen. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Representative gutes Ergebnis. A. Anteil der Rückfaltung direkt von Firefly-Luciferaseaktivität gemessen. Jeder Balken stellt den Prozentsatz der Rückfaltung in Abwesenheit (schwarze Balken) und in Anwesenheit (rote Balken) von einem molekularen Chaperon an verschiedenen Recovery-Zeit Punkte. B. Zusammenhang zwischen Zeit und Rückfaltung in Abwesenheit (schwarze Linie) und in Anwesenheit (rote Linie) von Chaperon. Die r quadrierten Werte zeigen eine gute Korrelation. In Fig.3A ist eine repräsentative Ergebnisse, wo Zellen 15, 30, 45, 60 und 120 Minuten nach Hitzeschock in Abwesenheit (schwarze Balken) und in Anwesenheit (rote Balken) der molekularen Chaperon gesammelt wurden gezeigt. Anteil der refolded Luciferase steigt mit längerer Erholungszeit und die Transfektion der molekularen Chaperon. Die Korrelation zwischen Rückfaltung und Zeit für die Kontrolle (Abb. 3B, schwarze Linie) und der molekularen Chaperon-transfizierten Zellen (Abb. 3B, rote Linie) gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Representative schlechtes Ergebnis. A. Anteil der Rückfaltung direkt von Luciferaseaktivität gemessen. Jeder Balken stellt den Prozentsatz der Rückfaltung in Abwesenheit (schwarze Balken) und in Anwesenheit (rote Balken) von einem molekularen Chaperon an verschiedenen Recovery-Zeit Punkte. B. Zusammenhang zwischen Zeit und Rückfaltung in Abwesenheit und in Anwesenheit (rot line) von Chaperon. Die r quadrierten Werte zeigen schlechte Korrelation. Abbildung 4A. Zeigt eine repräsentative Ergebnis eines Experiments nicht ordnungsgemäß ausgeführt. Sowohl die Steuerung (schwarze Balken) und der molekularen Chaperon-transfizierten Zellen (rote Balken) nicht zeigen einen Anstieg der Protein-Faltung mit der Zeit. Darüber hinaus hat die Transfektion der molekularen Chaperon nicht zu einer Erhöhung der Rückfaltung führen. Diese schwache Korrelation ist in Abb. bestätigt. 4B zeigt eine r Quadrat-Wert von 0,6619 und 0,1882 jeweils für die Kontrolle (schwarze Linie) und der molekularen Chaperon-transfizierten Zellen (rote Linie).

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	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur intrazellulären Rückfaltung Aktivität der molekularen Chaperone Maßnahme vorgestellt. Der ganze Test kann in 3 bis 4 Tagen durchgeführt werden, wie die Übersicht in Abb. gezeigt. 1. Die Robustheit und Linearität des Lichtsignals durch die Glühwürmchen und die Renilla-Luciferase produziert stellen eine solide Basis für die Reproduzierbarkeit des Protokolls. Der entscheidende Schritt des Tests ist d...

Aus diesem Experiment wurde ein Luminometer Form Perkin Elmer &#39;1420 Lumineszenz Counter &#39;Vector Light&#39; wurde verwendet, Programme für das Luminometer: Renilla: Pumpe 1, 100 ul Injektion Reaction Buffer: Pump1, 70 ul Injektion Luciferin: Pumpe2, 30μl Injektion Für die Puffer bereiten diese Stammlösungen in doppelt destilliertem Wasser: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O in 1 Liter </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA in 1 Liter </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 in 1 Liter </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O in 1 Liter </li><li> - 5M NaCl: 292,2 g NaCl in 1 Liter </li><li> - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA · 2H 2 O in 1 Liter &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-Puffer: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Für 1 Liter Einsatz 3,3 g Glycylglycin, 15ml einer 1M MgSO4-Lösung und 8ml einer 0,5 M EGTA-Lösung. Lösen in Wasser, pH-Wert auf 7,8 und bringen bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter. Reaktionspuffer für Renilla / Coelenterazin Puffer: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA </li></ul> Für 1 Liter nutzen 13,4 ml einer 1M KH 2 PO 4-Lösung, 86,6 ml einer 1M K 2 HPO 4-Lösung, 100ml einer 5M NaCl-Lösung und 2 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung. <table border="1"><tr><td></td><td> Firma </td><td> Katalog / Artikelnummer: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Gold- </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 DNA Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbeccos Phosphate Buffered Saline 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Passive Lysis Buffer 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Luciferin Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazin </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> ATP (Adenosin Triphosphat) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um die enzymatische Aktivität der molekularen Chaperone in der Zelle-basierten System und die möglichen Auswirkungen von Verbindungen mit inhibitorischen / stimulierende Aktivität zu messen. Molekulare Chaperone sind Proteine, die bei der Regulation der Proteinfaltung 1 beteiligt und spielen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der das Überleben der Zelle auf Stress Beleidigungen wie Hitzeschock 2, Nährstoff Hunger und die Exposition gegenüber Chemikalien / Gifte 3. Aus diesem Grund Chaperone gefunden werden, um in Veranstaltungen wie Tumor-Entwicklung, chemioresistance von Krebszellen 4 sowie Neurodegeneration 5 beteiligten werden. Design von kleinen Molekülen in der Lage zu hemmen oder stimulieren die Aktivität dieser Enzyme ist daher eine der am besten untersuchten Strategien zur Krebstherapie 7 und neurodegenerativen Erkrankungen 9. Der Test hier beschrieben bietet die Möglichkeit, die Rückfaltung Aktivität eines bestimmten molekularen Chaperon zu messen und die Wirkung von comp-Studieounds über ihre Tätigkeit. Bei dieser Methode wird das Gen des molekularen Chaperon untersucht wird zusammen mit einem Expressionsvektor kodiert für die Firefly-Luciferase-Gen transfiziert. Es wurde bereits beschrieben, dass denaturierte Luciferase durch molekulare Chaperone 10,11 kann gefaltet. Als Normalisierung Transfektion kontrollieren, ist ein Vektor-Codierung für die Renilla-Luciferase-Gen transfiziert. Alle Transfektionen in diesem Protokoll beschriebenen sind mit X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 Zellen durchgeführt. Im ersten Schritt wird die Proteinsynthese durch Behandlung der Zellen mit Cycloheximid gehemmt. Danach Proteinentfaltung wird durch Hitzeschock bei 45 ° C für 30 Minuten induziert. Nach Wiederaufnahme bei 37 ° C, sind Proteine ​​wieder zusammengefaltet in ihre aktive Konformation und Aktivität der Firefly-Luciferase als read-out verwendet: je mehr Licht produziert wird, desto mehr Protein wird die ursprüngliche Konformation wieder gewonnen. Non-Hitzeschock-Zellen sind als Referenz (100% des refolded gesetztLuciferase).

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Intracellular Refolding Assay

In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology. In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

Serie: Intracellular Refolding Assay

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Aortic Ring Assay

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis assays involve the study of individual endothelial cells in culture conditions (1). The aortic ring assay is an angiogenesis model that is based on organ culture. In this assay, angiogenic vessels grow from a segment of the aorta (modified from (2)). Briefly, mouse thoracic aorta is excised, the fat layer and adventitia are removed, and rings approximately 1 mm in length are prepared. Individual rings are then embedded in a small solid dome of basement matrix extract (BME), cast inside individual wells of a 48-well plate. Angiogenic factors and inhibitors of angiogenesis can be directly added to the rings, and a mixed co-culture of aortic rings and other cell types can be employed for the study of paracrine angiogenic effects. Sprouting is observed by inspection under a stereomicroscope over a period of 6-12 days. Due to the large variation caused by the irregularities in the aortic segments, experimentation in 6-plicates is strongly advised. Neovessel outgrowth is monitored throughout the experiment and imaged using phase microscopy, and supernatants are collected for measurement of relevant angiogenic and anti-angiogenic factors, cell death markers and nitrite.

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from pre-existing vasculature, is associated with both natural and pathological processes. Here we demonstrate an aortic ring assay that allows angiogenic potentiators and inhibitors to be directly added to aortic rings in culture. Sprouting and neovessel outgrowth can be determined by inspecting the aortic rings over a period of 6-12 days.

Aorten-Ring-Test

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPase-Aktivierungs-Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His)<sub&gt; 6</sub&gt; -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

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