Bu çalışma Rejeneratif Tıp (RB3-02266) için California Institute ve NIH (DK54441) tarafından desteklenmiştir.

Başlamadan önce Notlar: <ol><li> Insan fetal pankreası Doğum Kusur Research Laboratory, doku hasat University of Washington (Seattle, Washington, ABD) elde edilmiştir. Numunelerin doku bağışı, depolama ve kullanım için bilgilendirilmiş onam merkezi tarafından donörlerden elde edilmiştir. Protokol rıza beyanı yazılı olarak sunulan ve Kaliforniya Üniversitesi, San Diego İnsan Araştırma Koruma Programı bütün çalışma (Protokol # 081237XT) kabul edildi. </li><li> Bu insan fetal pankreas ve tüm prosedür sırasında buz üzerinde pankreas tutan kabı hem de korumak için gereklidir. Ayrışma ve sindirim mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. </li><li> Insan fetal pankreas depolama ve pankreas taşınması için tampon elde edildi klinik gönder. (RPMI-1640 +% 10 normal insan serumu (NHS), 300 mM trehaloz SG, penisilin / streptomisin ve fungizon). </li></ol>İnsan Fetal Pankreas 1. Diseksiyon <ol><li> 2.5 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon vermek üzere HBSS RT kolajenaz XI&#39;, 5 mg çözülür. 4 ° C&#39;de steril (otoklav) sintilasyon şişesine ve deposuna bir 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu sterilize Bir doku kültürü kaputu, 2 steril Petri kapları, steril küçük pota (bir pota kullanılamaz ise, küçük bir bardak ikame edilebilir), sterilize makas ve forseps yola. Pankreas yıkamak için bir Petri kabı 2 ml HBSS ekleyin. Yaklaşık 1 ml bırakarak fetal pankreas içeren tüp aspire sıvı. </li><li> HBSS&#39;nin olmadan 60 mm Petri kabı içine forseps ile pankreas kaldırmak. Bu deneyler için, fetal SKK, 9 ila 23 hafta arasında değişen, gebelik yaşı taze pankreastan oluşturulur. Daha önce gestionational yaşlarda pankreastan izolasyonu nedeniyle pankreas boyutuna zordur. Protokol 23 hafta, p ancak satın ötesine gestasyonel yaşları muhtemelen geçerlidirancreata Bu saatten sonra, çünkü federal (US) kısıtlamaları zordur. Bazen, fetal pankreas dalak, yağ, ya da orijinal diseksiyonu bağlı bağ dokusu ile geldi. İlave doku, çıplak gözle kolayca görülebilir ve protokolü başlamadan önce pankreas çıkarılmalıdır. </li><li> Petri kabındaki soğuk HBSS (~ 0.5 mi) bir minimal hacimde pankreas durulayın. </li><li> Bir buz kovası steril forseps ve yer kullanarak küçük steril potaya temizlenmiş pankreas taşıyın. 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü için bir tutucuya yerleştirin ve pota, makas 2 çiftleri kullanılarak, kuvvetli bir şekilde birkaç dakika pankreas dilim. (Genellikle 2-5 dakika, ancak zaman dokusunun boyut ve sertlik bağlıdır). Kesme tekniği önemlidir. Sadece karşıt hareket eden kolları sabit bir pozisyonda makas bir şekilde tutun. Makas uçları krozenin dibine üzerinde olmalıdır. Küçük içine pankreas kırmak için hızlı makas hareketi ile devamadettir. Doku parçaları kadar küçük olursa, o kadar iyi kolajenaz çalışacaktır. </li><li> Kadar 10 dakika boyunca 200 rpm&#39;de 37 ° C bir su banyosu çalkalama kümesindeki kolajenaz ve yeri ihtiva eden şişeye HBSS + kıyılmış pankreas 1.5 ml ilave edilir. Ilk 5 dakika boyunca daha sık birden kontrol etmeyin. Sindirim süresi, doku kalitesine bağlıdır, az 6 dakika kadar yeterli olabilir. Parçacıkların küçük ve homojen ise bitiş noktasıdır. </li><li> Kollajenaz aktivitesini durdurmak için soğuk HBSS flakon (10-15 ml) doldurun. Buz üzerine yerleştirin ve 10 dakika için kümeleri yerleşmek için izin verir. Genellikle bu noktada, bazı hücre ölümü meydana geldi ve DNA ortama salınır. Bu medya kılçıklı &#39;yapabilir; Bu durumda, söz konusu çözeltiye 100 ul DNase (10 mg / ml stok) ilave edilir. </li><li> Sintilasyon flakon doku (7-8 ml) hafif yarısı dolu daha az bırakarak üst tabakası kapalı 10 dakika, aspiratı için yerleştikten sonra. Bir 15 ml konik tüp hücreleri aktarın, 5 ml HBSS ekleyin. 300 x g, 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> HBSS aspire ve RPMI-1640, Glutamax,% 10 normal insan serumu (NHS), 10 mM HEPES pH 7.2, penisilin / streptomisin ve fungizon içeren 5 ml ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. 60 mm Petri kabı üzerinde Plate. Β hücreleri üretmek için çalışıyoruz araştırmacılar için, medyaya HGF (10 ng / ml nihai) ekleyin. Buna ek olarak, grup bir dizi iç salgı bezi hormonu GLP-1 ile kültür ortamı ilave da β hücreleri 28 artırdığını göstermiştir. Hücreler ÜAK&#39;lerin toplam ve oluşturulması için 72 saat boyunca süspansiyon içinde bırakılmalıdır. </li><li> Süspansiyon 72 saat sonra, hücreler daha önce tarif edildiği gibi 29, insan hücre hattı HTB9 matrisinin matris üzerine kaplanabilir. Ne olursa olsun büyüme koşulları içinde, ortam her 48 saat değiştirilmelidir. </li></ol> Süspansiyon Yetiştirilen ICCS Endokrin Hücre çoğalması ve olgunlaşması belirteçleri 2. İmmünofloresan Tek tabakalı veya cam lamelleri <ol><li> Hücre çoğalmasını ölçmek için, süspansiyon içinde yapışık hücreler veya hücre ya BrdU etiketleme önce PFA tespiti için 12 saat boyunca gerçekleştirilir. BrdU reaktif 1:100 inceltilir ve RPMI-1640 içinde steril filtre Glutamax,% 10 NHS, 10 mM HEPES pH 7.0, penisilin / streptomisin ve fungizon. </li><li> Süspansiyon hücreleri için: 300 x g ve aspirat kültür ortamı 5 dakika boyunca santrifüjleyin. 300 xg ve aspirat az 5 dakika boyunca, santrifüj ÜAK&#39;lerin yıkamak için 10 ml PBS ilave edin. SKK, parafin gömülü olacak ise, isteğe bağlı protokol 3,1-3,17 takip edin yapışık hücreleri için:. Kültür ortamı çıkarın ve yukarıda açıklandığı gibi PBS ile hücreleri yıkayın. Daha sonra PBS ile iki kere yıkayın, oda sıcaklığında% 4 PFA ile 20 dakika boyunca, hücreler. Bu noktada, plakalar Parafilm ile sarılmış olabilir ve en fazla 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde depolanır. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 Triton-X-100 ile inkübe hücreleri. PBS ile iki kez yıkanır ve hücreler Bloklama Tamponu uygulanır (% 2 donTuş serumu,% 2 sığır serum albümini, 1 saat boyunca PBS) içerisinde seyreltilmiş 50 mM glisin. (Tampon 1:10 seyreltilmiş Engelleme) Çalışma Tamponu ile hücreleri yıkayın. Çalışma tamponu içinde antikor seyreltin. Cam kapak slipleri üzerinde yetiştirilen hücreler, 60 ul toplam hacim içinde antikor seyreltin. 6-çukurlu tabak hücreleri için, 600 ul toplam hacim içinde antikor seyreltin. Çoklu epitop leke için, antikor bir kokteyl tatbik edilebilir. Bir kontrol olarak, IgG kullanımı veya belirli bir antikor yerine immün serum pre. Birincil antikor olarak kullanılan Kontrol numuneleri aynı türden kontrol IgG ile inkübe olması gerekir. </li><li> 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N C&#39;de 1.5 saat ya da birincil antikor inkübe Birincil antikor aspire ve oda sıcaklığında Çalışma Tamponu ile 3 kez yıkayın. </li><li> Alexa konjuge antikor için 1:1000 - Rhodamine ve FITC konjuge antikor, 1:500, 1:200 için de ikincil antikor seyreltin. Tüm ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Kapak örneklerisinyal kaybını önlemek için bir alüminyum folyo içinde. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. İSTEĞE BAĞLI: çekirdekleri görselleştirmek için, DAPI ikincil inkübasyon sırasında 1:500 eklenebilir. Bu durum toplam hücre popülasyonunda protein ekspresyonunun ölçülmesi için yararlıdır. </li><li> İkincil antikor aspire ve oda sıcaklığında Çalışma Tamponu ile 3 kez yıkayın. Tampon dalmış iken bir lamel yetiştirilen hücreler için, forseps ile yavaşça lamel kaldırın; PBS içinde daldırılması ile yıkayın. , 6-çukurlu bir plaka içerisinde yetiştirilen hücreler için, PBS yıkama ve aspirasyon ekleyin. Bu noktada onlar ters bir mikroskop altında incelemek için hazırız. </li><li> Aşırı PBS kurtulmak için bir Kimwipe hafifçe lamel kenarına dokunun. Bir cam slayt montaj jel damla ekleyin ve slayt üzerine lamel ters çevirin. Aspirasyon ile aşırı montaj jel çıkarın. Kabarcıklarını çıkarmak için 200 ul pipet ucunun arka hafifçe lamel dokunun. </li><li> 4 ° C&#39;de yaklaşık 20 dakika ya da O / N, oda sıcaklığında ve bir fl altında incelemek Kuruuorescent veya konfokal mikroskop. </li></ol> Parafin Gömülü ICCS Proteinlerin 3. (İsteğe bağlı) Immunofluorescent Boyama <ol><li> % 3 agaroz çözüm hazırlayın ve serin 55-60 ° C&#39;yi izin </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de, 15 ml konik tüp süspansiyon içinde inkübe ÜAK&#39;lerin ve santrifüj aktarın. </li><li> Hücrelerden ortam aspire ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 ul% 4 PFA ile tamir. Pelet çok büyük olmadığı sürece, pelet karışmaz. </li><li> 750 ul PBS ile iki kez pelet yıkayın. % 4 PFA gibi, bu atık tehlikeli olarak kabul edilir ve kurumun tehlikeli atık özelliklerine göre atılmalıdır. </li><li> Yavaşça 15 ml konik tüp duvarında aşağı agaroz 150-200 ul gevşetin ve eklemek üzere hücre pelleti hafifçe vurun. </li><li> Yavaşça tüp hafifçe karıştırın, ama kabarcıkları oluşturmaz. </li><li> 5-10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de katılaşmaya izin verin. </li><li> Çıkarmak için bir 21 G iğne kullanıntaze 15 ml konik bir tüp içinde pelet ve bir yer. </li><li> Slaytlar üzerinde parafin gömme ve bölümlerin hazırlanması mikrotom kullanılarak sitesinde ya da çekirdek mikroskopi tesisleri yapılabilir. </li><li> Dokusu, hidrat Deparaffinize ve hızlı bir şekilde su ile yıkayınız. </li><li> Kalan aldehit söndürmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 0.2 M glisin ekleyin. </li><li> 2 dakika her biri için iki kez PBS ile yıkayın slayt. </li><li> Antijen toplamak için, sıcak bir plaka üzerinde kaynatmak için 10 mM sitrat tampon maddesi (pH 6.0) getirir. Geri bir raddeye gelmesini bekleyin ve 15 dakika bekleyin, tampon slaytlar daldırın. </li><li> Ocak gelen beher çıkarın. Tampon soğumaya slaytlar için yaklaşık 40 dakika bekleyin. </li><li> , 5 dakika her biri için, H2O ile iki kez yıkanır slaytlar her biri 5 dakika boyunca PBS ile iki kere yıkayın slaytlar 1 saat için PBS içinde% 2 normal eşek serumu ile bloke eder. </li><li> % 0.2 Triton X-100 ihtiva eden Çalışma Tampon doğru konsantrasyona seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.Genel olarak, birinci antikor, bir gece boyunca inkübe edilir transkripsiyon faktörleri ve 1.5 saat için boyama durumunda ise hormonlar, proliferasyon işaretleri ve / veya farklılaşması için boyama. </li><li> Yukarıda tarif edilen adımları 2,3-2,9 izleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+explants+transplanted+into+nude+mice.">Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice.</a> Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).</li><li>Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+hormonal+content+of+human+fetal+pancreas+passaged+in+athymic+mice.">Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice.</a> Diabetes. 35, 464-469 (1986).</li><li>Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+pancreas:+Potential+for+transplantation.">Human fetal pancreas: Potential for transplantation.</a> Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).</li><li>Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+cryopreservation+and+transplantation+of+human+fetal+pancreas.">Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas.</a> Diabetes. 38, 448-453 (1989).</li><li>Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+by+human+fetal+pancreas.">Reversal of diabetes by human fetal pancreas.</a> Transplantation. 51, 557-562 (1991).</li><li>Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+fetal+pancreas:+fresh+vs.+cultured+fetal+islets+or+ICCS.">Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS.</a> J Mol Med. 77, 70-73 (1999).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+pancreatic+insulin-producing+cells+proliferate+in+vitro.">Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro.</a> J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).</li><li>Kayali, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SDF-1alpha/CXCR4+Axis+is+Required+for+Proliferation+and+Maturation+of+Human+Fetal+Pancreatic+Endocrine+Progenitor+Cells.">The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Otonkoski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+has+insulinotropic+activity+in+human+fetal+pancreatic+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells.</a> Diabetes. 43, 947-953 (1994).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoderm+and+pancreatic+islet+lineage+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells.">Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).</li><li>Shim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+towards+a+pancreatic+cell+fate.">Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate.</a> Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).</li><li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo.">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).</li><li>Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Lees, J. G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+beta-cell+surrogates+guided+by+ontogeny.">Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny.</a> Regen Med. 1, 327-336 (2006).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice.">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).</li><li>Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+enhances+production+of+insulin+in+insulin-producing+cells+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).</li><li>Semb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+endoderm:+a+key+step+in+coaxing+human+embryonic+stem+cells+into+transplantable+beta-cells.">Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells.</a> Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).</li><li>Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+endoderm+in+patterned+size-controlled+clusters.">Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters.</a> Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).</li><li>Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+function+of+human+fetal+pancreatic+cells+after+cryopreservation.">Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation.</a> Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).</li><li>Sandler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+human+fetal+pancreas.+Effects+of+nicotinamide+on+insulin+production+and+formation+of+isletlike+cell+clusters.">Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A., Sharvetnick, N., Landes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pancreatic regeneration. , (1997).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+is+a+potent+inducer+of+endocrine+differentiation+in+cultured+human+fetal+pancreatic+cells.">Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells.</a> J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).</li><li>Xie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+remodeling+mediated+by+polycomb+proteins+orchestrates+pancreatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).</li><li>Hardikar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+fetal+porcine+beta-cells+by+glucagon-like+peptide+1+and+cholecystokinin.">Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin.</a> Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).</li><li>Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+human+pancreatic+endocrine+cells.">Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose:+a+cryoprotectant+that+enhances+recovery+and+preserves+function+of+human+pancreatic+islets+after+long-term+storage.">Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage.</a> Diabetes. 46, 519-523 (1997).</li><li>Hayek, A., Beattie, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transplantation+of+human+fetal+and+adult+pancreatic+islets.">Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada sunulan yöntemler, hücre çoğalması ve pankreas endoderm belirteçleri, insan fetal, pankreas ve daha sonra görüntü ÜAK&#39;lerin oluşturmak için bir olanak sağlar. Insan fetal pankreas ayrışma işlemi, 72 saat ICC oluşum süresi, fare hücre β projenitör hücreleri izole etmek için protokolleri esas olarak farklı olan bir yaklaşım, ardından yaklaşık 90 dakika gerektirmiştir. Burada sunulan protokol araştırmacı insan fetal pankreas gelişimini keşfetmek sağlayan bir tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Uzunlamasına çalışmalarda iki farklı yapılabilir. İlk olarak, farklı gebelik yaşı fonksiyonel pankreatik hücre tipleri (duktal hücreleri, ekzokrin hücreleri ve hormon pozitif hücreler) oluşturmak üzere potansiyel transplantasyonundan sonra değerlendirilebilir. İkinci olarak, tek gebelik yaşından SKK, kültür içinde yetiştirilen seçilmiş farmakolojik maddeler ile tedavi edilen ve farklılıkları keşfetmek için ICC kültür sırasında farklı zaman noktalarında transplante edilebilirhücre kaderi. Şu anda, insülin üreten hücreler içine HESC farklılaşması yönelik olan büyük bir çaba ile, fizyolojik uyarıcıya tepki olarak insülin salgılanmasının ilişkili sorunlar tekrar gündeme edilmektedir. İnsan SKK fetal pankreas hücre çoğalması ve β hücre gelişimi bu kritik yönünü incelemek için eşsiz bir model sistem sağlar. Dokulardan hücreleri izole etmek için bir protokol ile olduğu gibi, detayları başarısı için kritik öneme sahiptir. Parametrelerin sayısı deneyi gerçekleştiren laboratuvar personelinin kontrolü dışında ne yazık ki. Bu laboratuvar tarafından karşılaşılan iki problem zayıf başlangıç ​​malzemesinin kalitesi ve pankreatik olmayan doku verilmesini içerir. Sağlıklı fetal pankreas dokusu bir makas kesim firmadır. Doku kesim çok kolay ise, pankreas enzimlerinin pankreas kendisi sindirimi başlamış olması bir işaretidir. Bundan hiçbir iyileşme ne yazık ki ve hazırlık iyi iptal edilir. Nadiren, bir inpankreas çıkarmadan deneyimli teknisyen pankreas için bağırsak bölümleri karıştırmayın olacaktır. Bu örnekler, pankreas çok daha fazla esnekliğe sahip olacak ve dikkate değer bir lümen mevcut olacaktır. Yine, bu örnekler atılmalıdır. Yukarıda da değinildiği gibi protokol takip edildiğinde, pist dışında izolasyon atmak için ortaya herhangi bir sorun nadiren vardır. Pürüzsüz bir izolasyon sağlamak için hatırlamak için birkaç puan hassas pankreas kesim için keskin bir makas kullanın ve sindirmek için çok büyük herhangi bir doku örneği bırakmaz emin olmak için, içerir. Keser kadar küçük değilse, o zaman kollajenaz etkin çalışmaz ve birkaç SKK oluşur. Kolajenaz yeni bir toplu kullanırken sindirim için IU (uluslararası birim), daha önce kullanıldığı haliyle, tersine, eğer benzer bir seviyesi ile başlar. Ancak, aşırı sindirim oluşmaz sağlamak için kuluçka süresini azaltmak. Bu sorun giderme teknik IU etiket partiden ba anlamlı farklılık olmamasını sağlarltak. Açıdan ele alındığında, insan fetal ICCS izolasyonu için bu teknik alanda oldukça standarttır. Çoğu laboratuarlar medyaya HGF&#39;ün eklenmesi hücreleri 33 hayatta ve çoğalırlar yardımcı olur bizim bulgularını doğruladı. Özetle, biz 9 ila 23 hafta arasında değişen gebelik yaşları ile insan fetal ICCS taze pankreastan izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Hücreler, pankreatik endokrin transkripsiyon faktörlerini ve insan insülini görselleştirmek için bir tek tabaka ya da deneyleri için süspansiyon olarak yetiştirilebilir.

Tip 1 diyabette hücre bazlı ensülin değiştirme tedavileri için bir birinci sınırlama nakli için insan adacık yetersizliği olan. Bir insülin eksikliği devlet metabolik ihtiyaçlarını karşılamak insülin üreten hücrelerin, insan pankreatik ön madde hücrelerinin çoğalmasını ve farklılaşmasını düzenleyen yeteneği, tip 1 diyabet tedavisi için hücre bazlı bir tedavi için çok önemli bir yapı taşıdır kalır. HESC türetilmiş insülin üreten hücrelerin, insan fetal endokrin pankreas hücreleri veya bunların öncülerinin gelişi klinik nakli için hücrelerin olası kaynağı olarak görüldü kadar. Bilimsel ve düzenleyici manzara son birkaç yıl içinde değişmiş olsa da, insan fetal pankreas geliştirir anlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Çoğu artık hücreleri genişletmek için etkin ve güvenilir bir yöntem kurulmuştur halinde olası Bununla birlikte, bu hücrelerin tedavi amaçlı kullanımı olabilir ag insan fetal hücrelerin tedavi amaçlı kullanım elaraştırılmalıdır ain. Geriye kalan diğer bir önemli engel daha duyarlı glikoz içine insan fetal pankreas hücreleri agrega (SKK) in vitro dönüşüm içinde, endokrin salgılayan hücreler insülin şu anda verimsiz bir süreç olmasıdır. Çok iş fazla yaklaşık 30 yıldır açıklanmış ve endokrin pankreas gelişimi için gerekli transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarını tarif olmasına rağmen, boşluklar transkripsiyon faktörlerinin geçici ekspresyonu düzenlenmiş ve hücre fonksiyonu ile ilgili olduğunu hakkındaki bilgi orada kalır. HESC türetilmiş insülin üreten hücrelerin, insan fetal endokrin pankreas hücreleri veya bunların öncülerinin gelişi klinik nakli için hücrelerin olası kaynağı olarak görüldü kadar. Bilimsel ve düzenleyici manzara son birkaç yıl içinde değişmiş olsa da, insan fetal pankreas geliştirir anlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Birçok şimdi, ancak eğer etkili olası gibi insan fetal hücrelerin terapötik kullanımını görüntüleyebilirve hücreler kurulmuştur genişletmek için güvenli bir yöntem, bu hücrelerin tedavi amaçlı kullanımı daha araştırılabilir. Geriye kalan diğer bir önemli engel daha duyarlı glikoz içine insan fetal pankreas hücreleri agrega (SKK) in vitro dönüşüm içinde, endokrin salgılayan hücreler insülin şu anda verimsiz bir süreç olmasıdır. Çok iş fazla yaklaşık 30 yıldır açıklanmış ve endokrin pankreas gelişimi için gerekli transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarını tarif olmasına rağmen, boşluklar transkripsiyon faktörlerinin geçici ekspresyonu düzenlenmiş ve hücre fonksiyonu ile ilgili olduğunu hakkındaki bilgi orada kalır. Son zamanlarda, kök hücre alan olgun endokrin hücre işaretçileri eksprese eden hücrelerin üretimini sürmek için doku adacığı gelişimi sırasında zamansal transkripsiyon faktörü ifadesi ile ilgili bilgi birikimi uygulamaktadır. HESC ve uyarılmış pluripotent hücreler (iPSC) insülin üreten hücrelerin oluşumu önemli yapılan ve rağmen- bir sözde &quot;kara kutu bunu takiben de 2, pankreas ön-madde transkripsiyon faktörleri) nakli sonrası in vivo olgunlaşma ifade eden hücreleri üretmek için 1) erken in vitro farklılaşması: son yıllarda önemli gelişmeler, en etkili protokolleri, iki ayrı faz farklılaşması gerektirir &quot;dönemi. Ileriye taşımak için, ne olursa olsun hücre kaynağı, bir biyokimyasal düzeyde anlaşılması gerektiğini, in vivo biyoloji yatan adacık olgunlaşmasını anlamada ilerler. ICCS ve HESC ile elde edilen sonuçlar arasındaki benzerlik, in vitro olarak, olgun, glikoz cevap veren, insülin salgılayan hücrelere ön-madde insan pankreas hücrelerinin geçiş düzenleyen önemli bir biyokimyasal süreçlerin bir dizi bilinmemektedir olduğunu göstermektedir. Bu anlayış merkezi bir kısmı pankreas progenitör hücrelerin fonksiyonel endokrin hücre popülasyonlarının türetmek için yeni yöntemler geliştirmek olacaktır ve HESC biyokimyasal yak sadece gerektirirdeğişiklikleri analiz olgunlaşma olayları, ancak yöntemleri aydınlatmak oaches. Neden insan fetal pankreas hücreleri görüntüleme adacık olgunlaşmasında değişikliklerin belirlenmesi kritik bir yönü olduğunu inanıyor musunuz? Cevap insülin üreten hücreleri üretmek için tarihsel arayış içinde kısmen yatıyor. Pankreas öncüleri ve adacıktan için model ve doku kültürü sistemleri, hem araştırmacılar, in vitro hayvan ve insan adacık adacık olgunlaşma arasındaki mevcut önemli farklılıkları keşfetmek için izin vermiş. Insan fetal pankreas gelişim keşif için bir sınırlama yasal olarak kullanılabilir gebelik yaşları sadece heterojen hücre agrega yol vermesidir. İzole edilmiş fetal insan hücreleri adacıklar, boyama, gebelik yaşı 9-23 hafta in vitro kültür sonra en az% 15 en adacık hücreleri, hormonlar için boyama ile değil, endokrin hücreleri için belirteçler içerir ortaya koymaktadır, ancak benzer. Bununla birlikte, transplantasyon sonrası veolgunlaşmasını vivo, hücrelerin büyük bir çoğunluğu endokrin belirteçler 6,25 ifade eder. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar in vitro farklılaştırma sonra hormon pozitif hücre popülasyonlarını arttırmak için. In vitro yöntemler muhtemelen in vivo adacık fikir verecektir sadece tek hormon pozitif endokrin hücreleri mütevazı nüfusu üretebilir HESC farklılaşma protokolleri bugün yankılandı ediliyor olgunlaşma. Dahası, insan fetal pankreas gelişimini sürücü moleküler olayları anlamaya olasılıkla HESC insülin üreten hücreleri elde etmek ve daha fazla β hücre yenilenmesini ve pankreas hücre transdiferansiasyon düzenleyen mekanizmaları tanımlamak için çabalarını artıracaktır. Insan fetal pankreatik hücre ve HESC olgunlaşma arasındaki benzerlikler hücre fonksiyonu için uzatılabilir. Murin hücreleri gibi insan fetal hücreleri ve farklı HESC hem glikoza tepki olarak insülin serbest bırakmak için mümkün değildirin vitro 26,27 doku adacığı neoformasyon sonra. Bununla birlikte, çıplak farelerde ve olgunlaşması, hem insan adacık benzeri kümeler ve HESC sergi bir endokrin fenotip türetilmiş insülin üreten hücrelere nakli üzerine. Üç ay aşılama sonra, nüfus birinden nakledilen hücrelerin hemen hemen% 90 insülin pozitif, ve C-peptid 17,26 serbest bırakılması tarafından belirlenen normal işlev. Bu sonuçlar transplantasyonu, adacık olgunlaşmasını teşvik bağlam ve tanımlanamayan ipuçları sağladığını göstermektedir. Örneğin insan fetal pankreas hücreleri olgunlaşma modüle ve hızlandırmak faktörleri belirlemek için arama yardımcı olacak için, burada açıklanan biri olarak optimize görüntüleme protokolleri,. Gelişme bu aşamada bir endokrin hattına doğru farklılaştırılmış insan fetal pankreas hücreleri ve HESC Temel biyokimyasal keşif olgunlaşma verimliliğini ölçmek için gereklidir. Figür özetlenen Aşağıdaki protokol,e 1, bu hücrelerin bütün insan fetal pankreas ve görüntüleme ikinci SKK adlandırılan insan fetal pankreas hücrelerinin izolasyonu için mevcut bir yöntem sağlar. Bu protokol daha sonra bir tek tabaka ya da süspansiyon halinde yetiştirilebilir dokudan hücrelerin bir ilk hazırlanmasını gerektirir. Endokrin hücresi çoğalması ve olgunlaşması ve yaygın olarak kullanılan belirteçlerinin görüntüleme için hücrelerin hazırlanması tarif edilmektedir. Kimyasal modifiye ajanlar çeşitli yokluğunda veya varlığında, üretimi ve ICCS görüntüleme kültür koşulları ve tam olarak işlevsel ekzokrin, duktal, ya da, insan fetal pankreatik hücrelerin maturasyonu bileşiklerin belirlenmesi için, transplantasyon modelleri ile karşılaştırıldığında hızlı bir yöntem sağlar hormon pankreas hücrelerinin üretilmesi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

Yaklaşık 30 yıldır, bilim adamları, glikoz 1-9 uyarımı takiben insan C-peptidi dolaşan önemli bir artışla kanıtlandığı gibi çıplak farelerin böbrek kapsülü altından nakledilen insan fetal SKK, endokrin hücreleri saptanmıştır olgunlaşarak olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte in vitro olarak insan fetal ICCS insülin üreten hücrelerin oluşumu düşük 10; insan embriyonik kök hücreleri (HESC) ile yapılan son deneylerin sonuçları andıran, tip 1 diyabet için potansiyel bir terapötik tedavi olarak çok ümit vericidir hücreleri, yenilenebilir bir kaynak. ICCS gibi, kısmen farklılaşmış HESC nakli glikoz duyarlı, insülin üreten hücreleri üretmek, ancak HESC insülin üreten hücrelerin in vitro oluşumunda çok daha sağlam 11-17 olduğunu. Endokrin öncü hücrelerin büyümesini ve farklılaşmasını etkileyen faktörlerin tam bir anlayış olası veri ICCS ve o hem üretilen gerektirecektirSC. Protokoller bir dizi in vitro 11-22, SKK, 10,23,24 için çok daha az varoldukları için de HESC insülin üreten hücreleri üretmek için var iken. Bu tutarsızlık parçası muhtemelen insan fetal pankreas ile çalışma zorluğu geliyor. Bu amaç doğrultusunda, biz değişen gebelik yaşı insan fetal adacıklar pankreaslarından izole etmek için mevcut yöntemler üzerine inşa etmek için devam 12 ila 23 hafta, bir tek tabaka veya süspansiyon içinde hücrelerin büyümesi ve hücre proliferasyonu, pankreas belirteçler ve insan hormonlar için görüntü glukagon ve C-peptid de dahil olmak üzere. SKK taze doku naklinden 6 ile elde edilen C-peptid seviyeleri ile benzer olan çıplak farelerin böbrek kapsülü altında transplantasyonundan sonra C-peptid açıklamasında sonucunda, aşağıda tarif edilen protokole göre üretilen. Burada yer alan örnekler, pankreatik β endoderm çoğalması ve hücre oluşumu üzerine odaklanmak, ancak protokol pankreas geliştirme diğer yönlerini incelemek için kullanılabilecektir, Ekzokrin, duktal ve diğer hormon üreten hücreler de dahil olmak üzere.

Fetal ICCS dikkatli hazırlanması, bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. Hücreler tipik olarak kaplama tanımlanacağı dönemlerde bak nasıl Örnek resim, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Saflaştırmadan sonra, taze kaplama hücre agregatları az hücreleri (Şekil 2A) içeren küçük, seyrek açık kümeleri görünür. İlk 24 saat (Şekil 2B) sonra, hücre kümeleri çok daha büyük olur, ancak çok sayıda küçük kümeler kalır. 48 saat ile, kümeler önemli ölçüde genişletilmiş, ancak (Şekil 2C) asimetrik kalır gelmiştir. 72 saat sonra, SKK, boyutu ve şekli (Şekil 2D) nispeten homojen bir açık olmalıdır. Bu tür hücreler ya HTB-9, 24 saat önce, bağışıklık ya da gen ifadesini değiştirebilir ya da yokluğunda kimyasal madde veya ilaç varlığında, diğer bir 72 saat için büyümeye bırakılmıştır olarak matrisler, üzerinde kaplama olabilir, bu noktada pankreatik endokrin hücre g için gereklidireneration. 3 vurgulamaktadır pankreas endoderm karşı ICC proliferasyonu veya farklılaşmasını ya değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir antikor, bir dizi Şekil. Şekil 3A&#39;da, SKK, HTB-9 ekildi 4 gün boyunca yetiştirilir ve PDX1, pankreas gelişiminin önemli bir marker için boyandı. ICCS in vitro boyama laboratuvarımızda rutin olmasına rağmen, daha sık olarak, insan fetal SKK, çıplak farelerin böbrek kapsülü altında yerleştirildi ve çoğalırlar ve in vivo 6,9,30-32 olarak ayırt etmek için izin verilir. Transplantasyonundan sonra belirli zamanlarda, fareler kurban edilir ve nakledilen ÜAK&#39;lerin içeren böbrek çıkartılır,% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve parafin içine gömülmüştür. Sıralı 5 mikron bölümleri mikrotom kullanılarak sitesinde veya bir çekirdek mikroskopi tesisi yoluyla oluşturulur. Epitop olduğunu ortaya çıkarması ve immünofloresan mikroskopi için parafin dokusundan proteinlerin boyama isteğe bağlı protokol 3,10-3 tarif edilmektedir.. Hücre çoğalmasını değerlendirmek için ve Ki67 (kırmızı) ile, 17 Şekil 3B&#39;de olarak, nakledilen SKK epitel hücre işaretleyici pan sitokeratin (yeşil PanCK) ile boyandı. Bir başka örnekte, insan insülini (yeşil) ve glukagon (kırmızı) hem de çıplak bir fare (Şekil 3C) ve böbrek kapsülü altında nakli ve olgunlaşma sonra tespit edilmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. Immünofloresans insan fetal ICC hazırlanması ve boyama akış şeması. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2,. 0 ° C&#39;de Örnek fetal SKK hazırlanması, sonra kaplama 24, 48, ya da 72 saat. (A) SKKsüspansiyonu hemen sonra kaplama görüntülenmiştir, kaplama ya da (D) kaplama sonrası 72 saat sonra, (B) 24 saat sonra kaplama, (C) 48 saat. AC Ölçek çubuğu, 10X büyütme = 300 mikron, D ölçek bar = 100 mikron 20 büyütme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> .. (, Yeşil pan-CK) ve çoğalma (Ki67, kırmızı), (C) insülin kaplamalı ICCS Şekil 3 İmmünofloresan Rutin, SKK, (A) pankreas Ceninin işaretleyici PDX1 (yeşil), (B) endokrin hücreleri için görüntülü (yeşil) ve glukagon (kırmızı). AC Ölçek çubuğu, 40X büyütme = 20 um.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters at JoVE.com

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK&#39;lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir.

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K Görüntüleme.  University of California, San Diego.  Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK'lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir. 

Video: Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Tıp

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Bebeklerde Serebral Metabolizma ve Hemodinamiğin Noninvaziv Optik Ölçüm

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Scarless Yara Repair Fare Fetal Cilt Modeli

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...