بروتوكول تفكك أنسجة البنكرياس الموضح بسيط ويوفر أداة لعزل الخلايا المفردة القابلة للحياة من أنسجة البنكرياس في مراحل مختلفة أثناء عملية الورم الخبيث ، بما في ذلك الأورام الصلبة. استعادة الخلايا العنيبية السليمة والقابلة للحياة هو تحد كبير. يمكن للبروتوكول استعادة الخلايا المفردة القابلة للحياة من البنكرياس الطبيعي ، أو البنكرياس الذي يعاني من آفات ما قبل خبيثة ، أو أورام البنكرياس التي تحتوي على العديد من الخلايا اللحمية والمناعية.
يمكن أن يساعد استخدام هذا البروتوكول لتشريح أورام البنكرياس البشرية أو البنكرياس الملتهب في التحقيق في هذه الأمراض للعثور على مؤشرات حيوية وعلاجات جديدة. الطريقة سهلة الاستخدام ويمكن أن توفر النتائج المرجوة مع الحد الأدنى من الممارسة. سيساعد هذا الفيديو في عرض التفاصيل الصغيرة للبروتوكول.
قبل البدء في التشريح ، احتفظ بجميع الأدوات والمعدات جاهزة على الجليد. بعد تثبيت الفأر الرحيم ، قم برش بطنه بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام المقص والملقط ، قم بعمل شق على شكل حرف V يبلغ 2.5 سم في المنطقة التناسلية للحيوان ، وانتقل إلى الأعلى لفتح تجويف البطن بالكامل.
حدد موقع المعدة على الجانب الأيسر من الماوس والبنكرياس ، بالقرب من الطحال. باستخدام ملقطين ، افصل البنكرياس عن المعدة والاثني عشر دون تمزيق. استمر وافصل البنكرياس عن الأمعاء الدقيقة والصائم والدقاقي.
حرك البنكرياس إلى الجانب الأيمن وافصل الوصلات المتبقية بين البنكرياس والتجويف الصدري بالملقط لفصل البنكرياس والطحال المتصل به تماما. بعناية ، قم بإزالة البنكرياس بدون دهون مساريقية أو أنسجة مجاورة أخرى ، وانشرها للفحص في طبق بتري على الجليد. باتباع التركيبة المذكورة في النص ، قم بإعداد المخازن المؤقتة للتفكك 1 و 2 ، وغسل المخزن المؤقت ومحلول إيقاف نشاط الإنزيم مسبقا.
ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 ملليلتر على الثلج واشطفه في مصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، أو FBS ، ومحلول ملح هانك المتوازن ، أو HBSS. سوف تطفو الدهون وسوف يغرق البنكرياس. هذه طريقة سهلة لتصور وإزالة الأنسجة الدهنية البيضاء الملوثة التي لا تزال متصلة بالبنكرياس بسرعة.
بعد ذلك ، قم بنقل أنسجة البنكرياس الفأر والاحتفاظ بها في طبق بتري معقم يحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS على الجليد حتى يقطع. باستخدام مقص Noyes ومشرط ، قم بقطع البنكرياس إلى قطع صغيرة من واحد إلى ثلاثة ملليمترات مكعبة. بعد نقل الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي ، قم بطردها عند 350 جيجا وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
نضح وتخلص من المادة الطافية لإزالة شظايا الخلايا وخلايا الدم. أعد تعليق تعليق القطع في مخزن التفكك 1 الذي يحتوي على 0.02٪ trypsin-C و 0.05٪ EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع التقليب. اغسل على الفور باستخدام 10٪ FBS و Dulbecco's Modified Eagle's Medium ، أو DMEM ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 350 جم وأربع درجات مئوية.
اغسل مرة أخرى عن طريق تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل ، والطرد المركزي كما كان سابقا لمدة خمس دقائق قبل خطوة التفكك التالية. احتضان البنكرياس في مخزن التفكك 2 لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع التحريض عند 180 دورة في الدقيقة. بعد 15 دقيقة ، قم بإجراء التفكك الميكانيكي عن طريق سحب شظايا البنكرياس بقوة لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصات مصلية معقمة.
كرر استخدام ماصات ذات حجم متناقص ، بدءا من 25 ، 10 ، إلى 5 ملليلتر. احتضان العينة للوصول بها إلى 37 درجة مئوية. استخدم الفحص المجهري الضوئي لمراقبة التفكك وفقا لكمية الخلية المفردة في التعليق.
مراقبة صلاحية الخلية باستخدام تريبان الأزرق. استمر في الحضانة وتحقق من التفكك عن طريق أخذ عينات كل خمس دقائق. احتضان حتى يتم فصل 90٪ من الخلايا إلى خلايا واحدة.
بعد فصل أنسجة البنكرياس جيدا ، والتي يشار إليها باختفاء شظايا البنكرياس وزيادة تعكر المحلول ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق الغسيل مرتين بمحلول إيقاف نشاط الإنزيم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. من هذه الخطوة ، احتفظ بتعليق الخلية على الجليد. مرر تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون 70 ميكرون.
قد يقلل حجم شبكة النايلون الأصغر من صلاحية الخلية. تحقق من صلاحية الخلية تحت المجهر. أعد تعليق الحبيبات واغسلها ب 5 إلى 10 ملليلتر من محلول الغسيل المخزن بالثلج البارد قبل عد الخلايا.
إذا لوحظت عدة خلايا دم حمراء ، عالج الخلايا بمحلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. في الحالات التي لوحظت فيها كتل ، يجب معالجة العينات مرة أخرى بالتربسين ، كما هو موضح سابقا. إذا كانت الصلاحية أقل من 80٪ ، فيجب عزل الخلايا الحية باستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا ، أو مجموعة إزالة الخلايا الميتة MACS مع أعمدة MACS MS.
نتج اللون الأحمر لأنسجة البنكرياس المعزولة عن التعبير عن tdTomato في الخلايا العنيبية. في مرحلة مبكرة من التفكك ، كانت هناك أعداد قليلة من الخلايا المعزولة وأعداد كبيرة من الكتل. في وقت لاحق ، تم الحصول على خلايا معزولة قابلة للحياة مع تجنب تقليل عدد الخلايا القابلة للحياة.
الحضانة الأطول قللت من صلاحية الخلايا. تم تقدير الخلايا الإيجابية tdTomato باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. دعم بروتوكول التفكك اللطيف استعادة أنواع متعددة من الخلايا ، مع قابلية عالية تسمح بمتابعة فرز الخلايا لأنواع الخلايا المرغوبة.
تم إجراء العد من خلية حية إلى خلية ميتة باستخدام مقياس الدم. أظهرت الصور الفلورية لأقسام البنكرياس المجمدة الخلايا الأسينار الإيجابية tdTomato . أكد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية اكتشاف جميع أنواع الخلايا المكتشفة في فرز الخلايا المنشط بالتألق في كل نسيج مقطوع من جميع النقاط الزمنية.
تمت دراسة تعبير carboxypeptidase1 ، أو CPA1 في الخلايا الأسينار ، مما يشير إلى الحد الأدنى من التلوث مع نسخ أنواع الخلايا الأخرى. من المهم ملاحظة أن أوقات الحضانة الأطول قللت من صلاحية الخلايا ، لذلك من المهم مراقبة العينة ومراقبة تفكك الأنسجة وصلاحية الخلية كل بضع دقائق تحت المجهر. يمكن استخدام بروتوكول عزل الخلية لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو زراعة الخلايا ، أو كمواد أولية للعضويات.
تسمح هذه التقنية باستكشاف كيفية تطور سرطان البنكرياس ، والتحقيق في التفاعلات بين الخلايا التي تتسلل إلى الأنسجة الملتهبة أو السرطانية.
