Agradecemos al Departamento de Seguridad Nacional de EE.UU. para proporcionar parte de la financiación.

1. Cepas bacterianas y preparación de plantillas de ADN <ol><li> Crecer cepas bacterianas de E. coli O157: H7, no-O157, y otras especies de patógenos, tales como Salmonella y Shigella, a 37 ° C durante la noche con agitación. </li><li> Extracto de ADN a partir de cultivos bacterianos utilizando el kit apropiado (véase la tabla de materiales) y siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Medir la densidad óptica (DO 260) para determinar las concentraciones de ADN mediante el uso de un espectrofotómetro. </li></ol> 2. Primer y Sonda de diseño para el ensayo de qPCR <ol><li> E. coli O157: H7 son secuencias de GenBank número de acceso AE00517411. Cebadores y sondas de diseño utilizando el software apropiado para la imprimación y diseño de la sonda para PCR en tiempo real (véase la tabla de materiales para más detalles). Las secuencias de cebadores y la sonda son las siguientes: Z3276-hacia adelante (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276-Reverse (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li> Reconstituir el polvo de imprimación con agua, resultando en una concentración de 10 mM como una solución de trabajo de imprimación. </li><li> Diluir las sondas a 10 mM como soluciones de trabajo de la sonda. Las sondas marcadas que varían en potencia con lotes. Por lo tanto, se valora cada lote de sondas marcadas antes de usar para un rendimiento óptimo qPCR. </li></ol> 3. Ajuste de las Condiciones de ensayo qPCR <ol><li> Preparar la mezcla de reacción, que consiste en 25,0 l de tiempo real mezcla maestra de PCR 2x, 200 nM de cebador directo, 200 nM de cebador inverso, y 100 nM de la sonda. </li><li> Añadir 5 l de ADN de la muestra (100 pg) y un volumen apropiado de agua para alcanzar un volumen final de 50 l. </li><li> Para el control sin plantilla, utilice 5 l de agua para reemplazar la muestra de ADN. </li><li> Establecer las condiciones de qPCR de la siguiente manera: 95 ° C durante 10 min para la activación de TaqMan; seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 10 seg para la desnaturalización y 60 y# 176; C durante 1 min para reasociación / extensión. </li></ol> 4. qPCR prueba de sensibilidad <ol><li> Hacer una dilución de 10 veces en serie de una cultura de mediados de la fase exponencial (OD 600 = 0,5; aproximadamente 1,5 x 10 8 UFC / ml en placas). </li><li> Añadir 100 ml de diluciones de células en una placa de 96 pocillos por triplicado. </li><li> Centrifugar la placa a 2.500 xg durante 10 min. </li><li> Añadir 50 ml de solución de extracción de ADN a cada pocillo. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares con una pipeta multicanal. </li><li> Sellar la placa con una película, hervir la placa en un baño de agua durante 10 minutos y centrifugar a 2500 xg durante 2 min. </li></ol> 5. Preparación de mezclas de células vivas y muertas para PMA Tratamiento <ol><li> Crece 10 ml de E. coli O157: H7 a 37 ° C a mediados de la fase exponencial y dividir la cultura en dos alícuotas. </li><li> Hervir una alícuota de células durante 10 min en un baño de agua para las células muertas y dejar la otra alícuota de células vivas. </li><li> Verifique lare hay células vivas de la alícuota de muertos por calor de placas las células en placas de agar LB. </li><li> Tome 2 ml de las células vivas y muertas por calor y ajustar la concentración de 8 x 10 6 UFC / ml con medio LB. Crear cuatro conjuntos de diluciones de células que van desde 8 x 10 0 a 8 x 10 6 UFC / ml. </li><li> Utilice los dos primeros conjuntos de diluciones de células para las células vivas tratadas con PMA o sin tratar. </li><li> Para la tercera y cuarta series de diluciones de células, añadir 8 x 10 6 células muertas para cada dilución de células (8 x 10 0-8 x 10 6) para hacer mezclas de células vivas y muertas. </li><li> Tratar el tercer juego de la dilución con PMA y utilizar el cuarto juego de la dilución para el control. </li></ol> 6. El tratamiento de las células con PMA <ol><li> Disolver la PMA en sulfóxido de dimetilo (o agua) para hacer 10 mM de solución stock y se almacenaron a -20 ° C en la oscuridad. </li><li> Alícuota de 400 l de las células vivas, células muertas, y mezcla de células vivas y muertas entres microtubos separadas. </li><li> Añadir 2,0 ml de PMA 10 mM a cada alícuota de células a una concentración final de 50 mM. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad, agitando suavemente unas cuantas veces, 3 segundos cada vez. </li><li> Añadir 100 l de muestras en una placa de 96 pocillos. </li><li> Sellar la placa con una película óptica y poner la placa en el hielo. </li><li> Coloque la placa de 20 cm de un W fuente de luz halógena de 650 y exponer durante 2 minutos para la exposición de luz. </li><li> Centrifugar la placa a 2500 xg durante 10 min, deseche con cuidado el sobrenadante y escurrir con cuidado la placa en un pedazo de papel absorbente. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares en 50 l de solución de extracción de ADN por pipeteando arriba y abajo veinte veces con un multi-canal Pipetman. </li><li> Sellar la placa con una película, hervir durante 10 minutos en un baño de agua, y se centrifuga a 2500 × g durante 2 min. El sobrenadante de la placa es el ADN de las células tratadas con PMA y listo para la qPCR. </li><li> Realice qPCR como descricama de arriba, usando 5 l de ADN. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. 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Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. 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Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un objetivo primario del estudio implica el uso de un ORF Z3276, una única a E. coli O157: H7, como un biomarcador único para el ensayo de qPCR. En la actualidad, la mayoría de los ensayos de qPCR se dirigen a los genes de virulencia, como stx1, stx2 y eaeA 1,2,5,6 o genes fenotípicas comunes, como uidA 3,4, rfbE y genes fliC 8,9. De vez en cuando, una especie o cepa pueden no ser definitivamente identificados por el gen (s) de la virulencia, tales como stx 1 y STX 2 genes, como los genes están presentes en diferentes especies o cepas 16, así. Usando rfbE y fliC de genes objetivo, se necesitan los dos genes que se utilizará para la identificación completa 17. Uso de ORF Z3276 como un biomarcador, este ensayo qPCR ha demostrado ser ensayo sensible y específica (Tabla 1). Este ensayo ha sido sometido a la inclusión y la exclusividad pruebas estrictas, incluyendo O157: H7 (n = 367), más de 100 cepas no-O157 y otras especies de patógenos, como Salmonella y Shigella. Todos los O157: H7 Fueron detectadas positivamente, y sin reactividad cruzada se encontró a partir de las cepas no-O157 (Tabla 1), lo que indica que la ORF Z3276 es un biomarcador único y fuerte para la detección de E. coli O157: H7. El otro objetivo del estudio es detectar de forma selectiva las células vivas de células muertas por tratamiento con PMA antes de la extracción de ADN. PMA puede penetrar en las células muertas con membrana comprometida y unirse al ADN, y por lo tanto inhibe la amplificación de ADN de las células muertas en la PCR 13. Hemos modificado el procedimiento PMA-tratamiento, y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para el procedimiento. La intensidad de la derecha de exposición a la luz es esencial para obtener el efecto óptimo de reticulación. Anteriormente, microtubos se han utilizado en este paso 13-15. Sin embargo, microtubos separadas son difíciles de manejar en la ex luzpaso exposición, y estos tubos no son absolutamente transparente para obtener el mejor gusto cruz. El uso de una placa de 96 pocillos, mejoramos la eficiencia del PMA-tratamiento. Estos cambios pueden afectar el ensayo de varias maneras: hacen que sea más fácil obtener un efecto de la reticulación completa y uniforme, especialmente con numerosas muestras, las muestras tratadas se pueden mover de una placa a otra para hacer posible que la detección de un gran número de las muestras, y que proporcionan este ensayo PMA-qPCR con potencial para la automatización de todo el proceso. La limitación de este ensayo PMA-qPCR es que el tratamiento de PMA aumenta el costo ensayo de PCR algo y reduce ligeramente la sensibilidad del ensayo de PCR.

La PCR es una técnica común para la detección de E. coli O157: H7 en las muestras de alimentos y ambientales. La identificación de marcadores biológicos específicos para E. coli O157: H7 es uno de los factores clave para la detección de éxito en los ensayos de PCR. Los biomarcadores usados ​​comúnmente en ensayos de PCR para la detección de E. coli O157: H7 incluyen toxinas Shiga (STX 1 y stx 2) 1,2, 3,4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7, y fliC genes 8,9. Estos biomarcadores pueden proporcionar eficiencia variable para la identificación, sin embargo, la mayoría de los biomarcadores no se puede utilizar como un biomarcador único para la detección de E. coli O157: H7. Esta insuficiencia de poder de diferenciación de los genes diana pide biomarcador (s) más específico y más fuerte para la identificación de E. coli O157: H7 10. Numerosas sondas para los genes o marcos de lectura abiertos (ORFs) hipotéticas en E. coliO157: H7 11 fueron diseñados para ensayo qPCR basado en las pistas de microarrays de genotipado de ADN de nuestro laboratorio y por la búsqueda dentro de la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information. La secuencia de ORF Z3276, que es un gen fimbrial 11, se seleccionó para ensayo qPCR. Posteriormente, un ensayo de qPCR se desarrolla a través de numerosos ensayos sobre los parámetros de PCR tales como las concentraciones de cebadores y sondas, así como temperaturas de recocido y extensión (datos no presentados). Después de las pruebas de inclusividad de incentivos y en Exclusividad en cepas de referencia, tales como E. coli O157: H7, no O157 y Shigella en la qPCR, la ORF Z3276 fue identificado como un marcador genético específico y fuerte para la identificación de E. coli O157: H7. A continuación se desarrolla un nuevo método de qPCR utilizando este biomarcador único para la identificación de E. coli O157: H7. Otro reto en la detección de E. coli O157: H7 en la contaminada foods y el medio ambiente es la determinación precisa de las células vivas de las muestras. La presencia prolongada de ADN de las células muertas y la incapacidad de diferenciar la viabilidad en el ensayo de PCR podría causar lecturas de falsos positivos, lo que resulta en una sobreestimación del número de células vivas en la detección. En consecuencia, esto limita el uso de la PCR en la detección precisa de patógenos transmitidos por los alimentos 12. Un nuevo enfoque para diferenciar el ADN de las células muertas se ha tomado mediante la combinación de tratamiento monoazida de propidio (PMA) con el procedimiento de la PCR en los últimos años 13-15. PMA es capaz de ir en el interior de las células muertas, y intercalarse en el ADN cuando se expone a la luz, pero no puede ir dentro de células vivas para reaccionar con el ADN de las células vivas. Por lo tanto, en las mezclas tratadas con PMA de células vivas y muertas, el ADN de las células muertas no puede ser amplificado en la PCR 13. Se combinaron los PMA tratamiento con el ensayo de qPCR de nuevo desarrollo para detectar selectivamente E. vivo coli O157: H7 células. Además, hemos hecho el PMA-qPCR unssay posible para la detección de alto rendimiento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

Un marco de lectura abierta única (ORF) Z3276 fue identificado como un marcador genético específico para E. coli O157: H7. Un ensayo qPCR fue desarrollado para la detección de E. coli O157: H7 apuntando ORF Z3276. Con este ensayo, podemos detectar un precio tan bajo como algunas copias del genoma de ADN de E. coli O157: H7. La sensibilidad y especificidad del ensayo fueron confirmados por pruebas de validación intensivas con un gran número de E. coli O157: H7 (n = 369) y cepas no-O157 (n = 112). Además, hemos combinado procedimiento monoazida de propidio (PMA) con el protocolo de qPCR recientemente desarrollado para la detección selectiva de las células vivas de las células muertas. La amplificación de ADN de las células muertas tratadas con PMA fue casi completamente inhibida en contraste, la amplificación casi independiente de ADN a partir de células vivas tratadas con PMA. Además, el protocolo se ha modificado y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para un manejo fácil y consistente de un gran número de muestras. TSe espera que su método para tener un impacto en microbiológico preciso y vigilancia epidemiológica de la seguridad alimentaria y fuente ambiental.

La detección de E. coli O157: H7 por qPCR utilizando ORF Z3276 Uno de los factores clave de este ensayo es la sensibilidad y especificidad de la sonda Z3276 utilizado en la qPCR. Es capaz de detectar tan bajo como algunas copias del genoma de ADN de E. coli O157: H7 como se muestra en la Figura 1A. De las 120 cepas no-O157 examinados, incluyendo los seis principales cepas no-O157 STEC, O104: cepas H4, Salmonella, y las cepas de Shigella, sin reactividad cruzada se encontró, como se muestra en la Tabla 1. La combinación del tratamiento con PMA con qPCR Incubando E. coli O157: H7 células con PMA (50 mM) durante 5 minutos en la oscuridad y la exposición a la luz durante 2 min fueron seleccionados para las condiciones de tratamiento de EPM. Además, hemos modificado el procedimiento PMA tratamiento. En comparación con varios microtubos transparentes usados ​​en la etapa de reticulación, una placa de 96 pocillos se encontró que era más eficiente aalcanzar el efecto de entrecruzamiento óptimo y más conveniente que el manejo de un gran número de tubos de muestra durante el proceso de exposición a la luz. La amplificación de ADN a partir de células vivas y muertas tratadas con PMA en la qPCR Los efectos de la inhibición mediada por PMA de la amplificación de ADN a partir de células muertas en este ensayo qPCR se muestran en la Figura 1 mediante el uso de ADN derivado a partir de dos en serie de 10 veces diluciones de células vivas o muertas. Los resultados muestran que las curvas generadas a partir de las células vivas tratadas con PMA (curva roja) y sin PMA (curva azul) parecen lineales y casi idénticas entre sí. Ligeras diferencias de valor CT se muestran entre las células vivas tratadas con PMA y sin PMA (Figura 1A), lo que sugiere que PMA tratamiento tuvo poco efecto en la amplificación de ADN de las células vivas en la qPCR. Sin embargo, un 15 - diferencia de valor de CT (32000 veces) se muestra entre las células muertas tratadas con PMA y sin PMA, de demostraciónnstrating que el tratamiento de PMA suprimió eficazmente la amplificación de ADN de las células muertas (Figura 1B). La detección de células vivas a partir de mezclas de células vivas y muertas en qPCR Dos conjuntos de diluciones de células vivas (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC) se trataron con PMA o sin PMA para detectar células vivas a partir de mezclas de células vivas / muertas. Los resultados qPCR (Figura 2A) demostraron una antiparalelo tendencia progresiva de los valores de TC en relación con el número de células vivas tratadas (barras de color púrpura) a las muestras no tratadas (barras azules). Las células vivas tratadas produjo un CT valores algo más altos que los de las células vivas no tratados. Una tendencia similar progresiva inversa en valores de CT se observó con el número real de células vivas en las mezclas de células vivas / muertas tratadas con PMA (barras verdes), así como en la Figura 2B. Además, esta tendencia a la baja de los valores de TC fueobservado con el número de células vivas en las mezclas a pesar de la presencia de 106 células muertas. Estos resultados mostraron que los valores CT de las mezclas de células vivas / muertas representados el ADN de las células viven solas, mientras que la amplificación de ADN de las células muertas fue suprimida de manera eficiente por el tratamiento con PMA. Pero, los valores CT de mezclas de células vivas / muertas tratadas con PMA se fluctuaron y no lograron refleja el número de células vivas en las mezclas en la Figura 2B (barras amarillas). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> Figura 1. Vivir y las células muertas tratadas con PMA o sin PMA en ensayo qPCR. (A) Una serie de 10 veces diluido-E. directo coli O157: H7 diluciones de células (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC) se trataron con PMA o sin PMA.Los valores de CT representan los Valores promedio computarizadas de los triplicados en el ensayo qPCR. (B) Comparación amplificación ADN células vivas y células muertas tratadas con PMA sin PMA en ensayo qPCR comparación q. ARn refiere a la fluorescencia cambio de intensidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> Figura 2. La diferenciación de las células vivas de mezclas de células muertas / en vivo por PMA-qPCR Cuatro conjuntos de diluciones de 10 veces de cultivos de células (8 x 10 0 - 8 x 10 6 UFC). Se realizaron como se indica. (A) El primer conjunto de dilución celular fue tratado con PMA, mientras que la segunda dilución celular fue o no tratada antes de la extracción de ADN.(B) 8 x 10 6 células muertas se mezclaron con los tercero y cuarto conjuntos de diluciones de células para hacer dos conjuntos de mezclas de células vivas / muertas como se indica. Un conjunto de las mezclas de células fue tratada con PMA y el otro conjunto se trató sin PMA antes de la extracción de ADN. Cada barra representa los valores medios de CT de un experimento por triplicado ± SD. <table><tbody><tr><td> Organismo </td><td> El serotipo </td><td> N º de cepas probadas </td></tr><tr><td rowspan="15"> E. coli </td><td> 2006 espinaca O157: H7 aislados </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 Taco Bell O157: H7 aislados </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 Taco John O157: H7 aislados </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Colecciones de cepas DMB de otros O157: H7 </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Otro </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Salmonela </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Newport </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Dysenteriae Shigella </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Sonnei Shigella </td><td> Desconocido </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Boydii Shigella </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Total </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tcapaz 1. Las cepas utilizadas para la validación en el ensayo de PCR en tiempo real para la identificación de E. coli O157: H7.

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Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Un ensayo qPCR fue desarrollado para la detección de Escherichia coli O157: H7 dirigidas a un marcador genético único, Z3276. El qPCR se combinó con monoazida propidio (PMA) de tratamiento para la detección de células vivas. Este protocolo se ha modificado y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para la manipulación fácil y consistente de numerosas muestras

La detección de vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.5K vistas.  Food and Drug Administration.  Un ensayo qPCR fue desarrollado para la detección de Escherichia coli O157: H7 dirigidas a un marcador genético único, Z3276. El qPCR se combinó con monoazida propidio (PMA) de tratamiento para la detección de células vivas. Este protocolo se ha modificado y adaptado a un formato de placa de 96 pocillos para la manipulación fácil y consistente de numerosas muestras 

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An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Investigación

Biología

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Los protocolos para la implementación de un<em&gt; Escherichia coli</emSistema&gt; Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos