우리는 자금의 일부를 제공하기 위해 국토 안보부의 미국학과 감사합니다.

1. 균주와 DNA 템플릿 준비 <ol><li> E.의 균주를 성장 대장균 O157 : H7, 비 O157, 밤새 진탕과 같은 37 ° C에서 살모넬라와 쉬 겔라, 다른 병원성 종. </li><li> 해당 키트 (재료의 표 참조)을 사용하여 제조 업체의 지침에 따라 세균​​성 문화에서 DNA를 추출합니다. </li><li> 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 결정하기 위하여 광학 밀도 (OD 260)를 측정한다. </li></ol> 2. 프라이머의 qPCR 분석을위한 조사 설계 <ol><li> 대장균 O157 : H7 서열은 GenBank 등록 번호 AE00517411에서이다. 디자인 프라이머 및 (세부 사항에 대한 자료 표 참조) 실시간 PCR을위한 프라이머 및 프로브 디자인에 적합한 소프트웨어를 사용하여 프로브. 프라이머 및 프로브의 순서는 다음과 같다 : Z3276 포워드 (F) 5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 &#39; Z3276 - 후진 (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &#39; Z3276 - 프로브, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li> 프라이머 작업 용액으로서 10 μM의 농도의 결과, 물과 프라이머 분말 재구성. </li><li> 프로브 작업 솔루션과 같은 10 μM에 프로브를 희석. 레이블이 프로브는 배치와 힘에 따라 다릅니다. 따라서, 최적의 qPCR의 성능을 사용하기 전에 레이블이 프로브의 각 배치를 적정한다. </li></ol> 3. qPCR에 분석 조건을 설정 <ol><li> 배 실시간 PCR 마스터 믹스의 25.0 μL, 앞으로 프라이머의 200 nm의 역 프라이머의 200 nm의 프로브 100 ㎚의 구성, 반응 혼합물을 준비합니다. </li><li> 50 μL의 최종 볼륨에 도달하기 위해 5 샘플 DNA (100 PG) ㎕의 물과 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 비 템플릿 기반 컨트롤을 위해 DNA 샘플을 대체하는 물 5 μl를 사용합니다. </li><li> , 10 변성 초 60 &amp; 95 ° C의 40주기 다음 95 ° C를의 TaqMan의 활성화에 10 분 동안 다음과 같이 qPCR에 조건을 설정# 176; C 어닐링 / 확장을위한 1 분. </li></ol> 4. qPCR에 감도 테스트 <ol><li> (; 도금 약 1.5 × 108 CFU / ㎖ OD 600 = 0.5) 중간 지수 단계의 문화에서 직렬 10 배 희석을합니다. </li><li> 세중 96 - 웰 플레이트에 세포 희석액 100 ㎖를 추가합니다. </li><li> 10 분 동안 2,500 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 물론 각각의 DNA 추출 용액 50 ㎖를 추가합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 10 분 동안 물을 욕조에 판을 끓여 필름 플레이트를 밀봉하고, 2 분 동안 2,500 XG에 원심 분리기. </li></ol> 5. PMA 처리를 위해 살고 죽은 세포의 혼합물을 준비 <ol><li> E. 10 ㎖를 성장 대장균 O157 : 중간 지수 단계로 37 ° C에서 H7과 두 분주로 문화를 나눕니다. </li><li> 죽은 세포의 물을 욕조에 10 분 동안 세포 중 하나가 나누어지는 삶아 및 살아있는 세포에 대한 다른 나누어지는 둡니다. </li><li> 확인다시 LB 아가 플레이트상의 세포를 도금에 의한 열 살해 분취로부터 생균 없다. </li><li> 라이브 및 열 살해 세포의 2 mL를 취하여 8로 농도를 조절 × 106 CFU / LB 배지와 ML. 8 × 10 0 ~ 8 × 106 CFU / ㎖에 이르기까지 세포 희석 4 세트 만듭니다. </li><li> PMA 또는 미처리로 처리 생균 대한 세포 희석액의 처음 두 세트를 사용한다. </li><li> 라이브 및 죽은 세포 혼합물을 만들기 위해 - 세포 희석의 세 번째와 네 번째 세트에 각 셀의 희석 (8 × 10 6 8 × 10 0)에 8 × 10 6 죽은 세포를 추가합니다. </li><li> PMA 희석의 세 번째 치료 및 관리에 대한 희석의 네 번째 세트를 사용합니다. </li></ol> 6. PMA와 세포 치료 <ol><li> 10 mM의 원액과 어둠 속에서 -20 ° C에 저장할 수 있도록 디메틸 설폭 사이드 (또는 물)에 PMA를 녹인다. </li><li> 살아있는 세포, 죽은 세포, 라이브와 죽은 세포의 혼합물의 나누어지는 400 μL세 개의 모세관. </li><li> 50 μM의 최종 농도에 대한 각 셀 나누어지는 10 mM의 PMA의 2.0 ML을 추가합니다. </li><li> 가볍게 몇 번, 3 초마다 흔들리는 어둠 속에서 5 분 동안 주위 온도에서 샘플을 품어. </li><li> 96 - 웰 플레이트에 샘플 100 μl를 추가합니다. </li><li> 광학 필름과 플레이트를 밀봉하고 얼음에 접시를 넣어. </li><li> 20cm 650 W의 할로겐 광원에서 접시를 설정하고 빛의 노출을위한 2 분간 노출. </li><li> 10 분 2,500 XG에서 접시를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 취소하고 신중하게 흡수 종이에 접시를 배출. </li><li> 로 pipetting에 의해 멀티 채널 Pipetman와 20 번 아래로 DNA 추출 용액 50 μL의를 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 2 분 2,500 XG에 10 수욕 분, 원심 분리 끓여, 필름 플레이트를 밀봉. 접시에 뜨는 PMA 및 qPCR에 대한 준비로 처리 된 세포의 DNA입니다. </li><li> descri로의 qPCR을 수행위의 침대, DNA의 5 μl를 사용하여. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+by+multiple+PCR.">Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).</li><li>Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+specific+for+Escherichia+coli+O157+based+on+the+rfb+locus+encoding+O157+lipopolysaccharide.">A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).</li><li>Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+gene+encoding+H+antigen+in+Escherichia+coli+and+development+of+a+PCR-restriction+fragment+length+polymorphism+test+for+identification+of+E.+coli+O157:H7+and+O157:NM.">Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).</li><li>Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+stx1,+stx2,+and+eae+genes+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+using+SYBR+Green+in+a+real-time+polymerase+chain+reaction.">Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).</li><li>Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+bacteria+in+drinking+water+and+river+water.">Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

연구의 주요 목적은 E.에 ORF Z3276, 고유의 사용을 포함한다 대장균 O157 : H7, qPCR에 분석을위한 유일한 바이오 마커로. 현재, 대부분의 qPCR 분석은 stx1, stx2 및 eaeA 1,2,5,6 또는 uidA 3,4, rfbE 및 플릭 유전자 8,9와 같은 공유 표현형 유전자와 같은 독성 유전자를 대상으로하고 있습니다. 그 유전자가 다른 종 또는뿐만 아니라 변종 (16)의 존재로 때때로, 종이나 변형은 확실히 같은 STX로 천이됨을 STX 2 유전자로, 독성 유전자 (들)에 의해 식별 할 수 없습니다. 표적 유전자에 대한 rfbE 및 플릭을 사용하여, 두 유전자는 완전한 식별 (17)에 사용될 필요가있다. 바이오 마커로 ORF Z3276을 사용하여,이 qPCR의 분석은 민감하고 특정 분석 (표 1)로 입증되었습니다. H7 균주 (N = 3이 분석은 O157 등의 엄격한 포괄 성 및 독점 테스트를 받게되었습니다살모넬라와 쉬 겔라 등 67), 100 개 이상의 비 O157 균주 및 기타 병원성 종. 모든 O157 : H7 시험 균주를 긍정적으로 감지하고, 더 교차 반응은 비 O157 균주 (표 1)에서 찾을 수 없습니다, ORF Z3276은 E.의 검출을위한 독특하고 강력한 바이오 마커임을 표시 대장균 O157 : H7. 이 연구의 목적은 선택적으로 다른 DNA 추출 전에 PMA 처리에 의해 사균의 생균을 검출하는 것이다. PMA는 손상된 막과 죽은 세포로 침투하여 DNA에 결합하고, 따라서 PCR (13) 죽은 세포의 DNA 증폭을 억제 수 있습니다. 우리는 PMA 처리 절차를 수정 및 절차 96 - 웰 플레이트 형식으로 적응시켰다. 빛의 노출의 오른쪽 강도는 최적의 가교 효과를 얻을하는 것이 필수적이다. 이전 모세관이 단계 13 ~ 15에 사용되었습니다. 그러나 별도의 마이크로 튜브는 빛을 전에서 처리하기 어려운하여 노출 단계,이 튜브는 최고의 크로스대로를 얻을 절대적으로 투명하지 않습니다. 96 - 웰 플레이트를 사용하여, 우리는 PMA 처리의 효율성을 향상시켰다. 이러한 변화는 여러 방법으로 분석에 영향을 미칠 수 : 그들은 특히 수많은 샘플, 쉽게 철저하고 균일 한 가교 효과를 얻을 수 있도록, 처리 된 샘플은 가능한 있도록하는 또 다른 하나의 플레이트로부터 이동 될 수있다 다수의 검출 샘플로하고, 그들은 전체 프로세스에 대한 자동화 가능성이 PMA-qPCR의 분석을 제공합니다. 이 PMA-의 qPCR 분석의 한계는 PMA 처리 다소 PCR 분석 비용을 증가시키고 약간 PCR 분석법의 민감도를 감소한다는 것이다.

PCR은 E.의 검출을위한 공통의 기술입니다 대장균 O157 : 식품 및 환경 시료에서 H7. E. 특정 생체 식별 대장균 O157 : H7는 PCR 분석 실험에 성공 검출을위한 핵심 요소 중 하나입니다. 일반적 E.의 검출을 위해 PCR 분석법에 사용되는 생체 대장균 O157 : H7는 시가 독소 (STX 1 STX 2) 1, 2, 3, 4 uidA, eaeA 5,6, rfbE 7 및 플릭 유전자 8,9 있습니다. 이러한 바이오 마커는 식별을위한 가변 효율이 제공 할 수 있지만, 바이오 마커의 대부분은 E.의 검출을위한 고유 한 바이오 마커로 사용될 수 없다 대장균 O157 : H7. 표적 유전자의 차별화 전력이 부족함은 E.의 식별을위한보다 구체적인 강한 바이오 마커 (들)에 대한 호출 대장균 O157 : H7 10. E. 유전자 또는 가상의 오픈 리딩 프레임 (ORF를)에 대한 다수의 프로브 대장균O157 : H7 (11)가 실험실에서 DNA의 유전자형 마이크로 어레이에서 생명 공학 정보를위한 국립 센터의 GenBank 데이터베이스에서 검색하여 단서에 따라 qPCR의 분석을 위해 설계되었습니다. fimbrial 유전자 11입니다 Z3276 ORF,,의 순서는 qPCR에 분석을 위해 선정되었다. 이어서,의 qPCR 분석은 이러한 프라이머 및 프로브의 농도뿐만 아니라, 어닐링 및 연장의 온도 (데이터는 미도시)와 같은 PCR 매개 변수에 대한 다수의 임상 시험을 통해 개발되었다. 같은 E. 등의 기준 균주에 대한 인센티브의 포괄 성 및 독점 시험 후 대장균 O157 : H7 qPCR에있는 비 O157과 시겔 라 긴장은 ORF Z3276은 E.의 식별을위한 구체적이고 강력한 유전 적 마커로 확인되었다 대장균 O157 : H7. 그 다음 우리는 E.의 식별이 독특한 바이오 마커를 사용하여 새의 qPCR 방법을 개발 대장균 O157 : H7. E. 검출의 또 다른 도전 대장균 O157 : H7에 오염 fo를ODS와 환경 시료로부터 생균의 정확한 결정이다. 죽은 세포 및 PCR 분석에서 생존 능력을 구별 할 수없는에서 DNA의 확장 된 존재가 검출 살아있는 세포 수를 과대 평가의 결과, 위양성 판독의 원인이 될 수 있습니다. 따라서이 식 인성 병원균 (12)의 정확한 검출 PCR의 사용을 제한합니다. 죽은 세포의 DNA를 차별화하는 새로운 방법은 지난 몇 년 동안 13-15에서 PCR 절차와 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 처리를 조합하여 촬영되었다. PMA는 죽은 세포 안으로 들어가, 및 빛에 노출 될 때 DNA에 층간 삽입 할 수 있지만, 생균의 DNA와 반응 생균의 내부에 맞지 않을 수있다. 따라서, 라이브 및 사균의 PMA 처리 된 혼합물에서, 죽은 세포의 DNA는 PCR (13)에서 증폭 할 수 없다. 우리는 선택적으로 라이브 E.을 감지하는 새로 개발의 qPCR 분석과 PMA 치료를 결합 대장균 O157 : H7 세포. 또한, 우리는 PMA-의 qPCR을 만들었습니다높은 처리량 감지 할 수 ssay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

독특한 오픈 리딩 프레임 (ORF) Z3276은 E.의 특정 유전자 마커로 확인되었다 대장균 O157 : H7. 의 qPCR 분석은 E.의 탐지를 위해 개발 된 대장균 O157 : ORF Z3276을 대상으로 H7. 이 분석을 통해, 우리는 E.의 DNA의 게놈의 몇 사본 최저를 감지 할 수 있습니다 대장균 O157 : H7. 분석의 민감도 및 특이도는 E. 다수 집중적 검증 시험에 의해 확인되었다 대장균 O157 : H7 균주 (N = 369) 및 비 O157 균주 (N = 112). 또한, 우리는 죽은 세포에서 살아있는 세포를 선택적으로 검출을위한 새로 개발 된 qPCR에 프로토콜 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 절차를 결합했다. PMA 처리 죽은 세포에서 DNA의 증폭은 거의 PMA 처리 살아있는 세포에서 DNA의 거의 영향을받지 증폭 대조적으로 억제되었다. 또한, 프로토콜은 샘플의 다수의 간단하고 일관성있는 처리를위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 수정되고 적용되어왔다. 티그 방법은 정확한 미생물 식품 안전 및 환경 소스의 역학 모니터링에 영향을 미칠 것으로 예상된다.

E. 검출 대장균 O157 : ORF Z3276을 사용하여 qPCR에 의해 H7 이 분석의 중요한 요소 중 하나는 qPCR에 사용될 Z3276 프로브의 감도 및 특이성이다. 그것은 E.의 DNA의 게놈의 몇 사본 최저를 감지 할 수 있습니다 대장균 O157 : H7도 1a에 도시 된 바와 같이. 6 개 주요 비 O157 STEC 균주, O104 등의 조사 (120) 비 O157 균주의 표 1과 같이 H4 변종, 살모넬라, 시겔과 긴장, 더 교차 반응은 발견되지 않았다. qPCR에 함께 PMA 처리의 조합 보육 E. 대장균 O157은 : 5 어둠 속에서 최소 2 분 동안 빛에 노출 PMA (50 ㎜)과 H7 세포는 PMA 처리 조건으로 선택했다. 또한, 우리는 PMA 처리 절차를 수정했습니다. 가교 공정에서 사용되는 다양한 투명한 모세관과 비교하여, 96 - 웰 플레이트에 더 효율적인 것으로 밝혀졌다최적의 가교 효과 및 노광 공정 동안 샘플 튜브의 다수 취급하는 것보다 편리 이른다. qPCR에있는 PMA 처리 라이브와 죽은 세포에서 DNA의 증폭 이것의 qPCR 분석에 죽은 세포로부터의 DNA 증폭의 PMA-매개 억제의 효과는 두 개의 직렬 10 배량 라이브 또는 사균 희석 유래 DNA를 사용하여도 1에 나타내었다. 결과는 PMA (적색 곡선)와 및 PMA (파란색 곡선)없이 처리 살아있는 세포에서 생성 된 곡선이 선형과 서로 거의 동일한 것을 보았다. 약간의 CT 값의 차이는 PMA 처리가 qPCR에있는 살아있는 세포의 DNA의 증폭에 거의 영향을 미치지 것을 제안, PMA와 및 PMA (그림 1A)없이 처리 살아있는 세포 사이에 나타내었다. 그러나 15 - CT 값의 차이 (32,000 배)가 PMA를 처리 한 죽은 세포 사이 PMA, 데모없이 표시했다PMA 처리가 효율적으로 죽은 세포 (그림 1B)에서 DNA 증폭을 억제하는 것이 nstrating. qPCR에에 살고 죽은 세포의 혼합물에서 살아있는 세포의 검출 라이브 셀 희석 (8 × 10 0 - 8의 X 10 6 CFU)의 두 가지가 라이브 / 죽은 세포 혼합물로부터 살아있는 세포를 감지하는 PMA 또는 PMA없이 처리 하였다. qPCR의 결과 (그림 2A)는 처리되지 않은 샘플 (파란색 막대)로 처리 살아있는 세포 (보라색 막대)의 숫자에 관련된으로 CT 값의 병렬 역 진보적 인 경향을 보여 주었다. 처리 된 생균은 미처리 생균보다 다소 높은 CT 값을 수득 하였다. CT 값에서 유사 역 누진 경향은도 2b에뿐만 PMA (녹색 막대)로 처리 라이브 / 죽은 세포 혼합물에서 생균의 실수로 관찰되었다. 또한, CT 값이 하향 추세였다106 사균의 존재에도 불​​구하고 이들의 혼합물에서 생균 수가 관찰. 이러한 결과는 죽은 세포로부터 DNA 증폭을 효율적 PMA 처리에 의해 억제되었다 반면 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 CT 값이 단독 생균로부터 DNA를 나타내는 것으로 나타났다. 하지만, PMA로 처리 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 CT 값은 변동 그림 2B (노란색 막대)의 혼합물에서 라이브 세포 수를 반영하는 데 실패했다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> 그림 1. 살고 죽은 세포가 PMA 또는 qPCR의 분석에서 PMA없이 처리. (A)의 시리얼 라이브 E. 10 배 희석 대장균 O157 : H7 셀 희석 (8 × 10 0 - 8의 X 10 6 CFU)가 PMA 또는 PMA없이 처리 하였다.CT 값의 qPCR 분석에서 세벌의 평균 CT 값을 나타낸다. (B) Q 비교의 qPCR 분석에서 PMA와 함께 PMA없이 처리 된 생균과 사균의 DNA 증폭의 비교. ΔRn는 강도의 변화, 형광를 의미하는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 볼하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> 그림 2. . PMA-qPCR에 세포 배양의 10 배 희석 (8 × 10 0 - 8의 X 10 6 CFU)의 4 세트로 라이브 / 죽은 세포의 혼합물에서 살아있는 세포의 분화는 표시로 만들어졌다. 제 2 셀 희석 DNA 추출하기 전 또는 치료 동안 세포 희석액 (A) 첫 번째 세트는 PMA로 처리 하였다.(B) 8 × 106 사균 나타낸 바와 라이브 / 죽은 세포 혼합물의 두 세트를 만들기 위해 세포 희석액의 세 번째와 네 번째 세트로 혼합 하였다. 세포 혼합물의 한 세트는 PMA로 처리하고, 다른 세트는 DNA 추출 전에 PMA없이 처리 하였다. 각 막대는 SD ± 세중 실험의 평균 CT 값을 나타냅니다. <table><tbody><tr><td> 유기체 </td><td> 혈청 형 </td><td> 시험 균주 번호 </td></tr><tr><td rowspan="15"> 대장균 </td><td> 2006 시금치 O157 : H7 발생 분리 </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 타코 벨 O157 : H7의 분리 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 타코 존 O157 : H7의 분리 </td><td> 11 </td></tr><tr><td> 다른 O157에서 DMB 변형 컬렉션 : H7의 발생 </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104 : H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> (24) </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Ø45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> 다른 </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 살모넬라 균 </td><td> 균 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 뉴 포트 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 시겔 dysenteriae </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 시겔 라 sonnei </td><td> 알 수없는 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 시겔 flexneri </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 시겔 boydii </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> 합계 </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> 티수 1. E.의 식별을위한 실시간 PCR 분석에서 유효성 검사에 사용되는 균주 대장균 O157 : H7.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

H7는 고유 한 유전자 마커, Z3276을 대상으로 :의 qPCR 분석은 대장균 O157 검출을 위해 개발되었다. qPCR에는 라이브 셀 검출을위한 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 처리와 결합했다. 이 프로토콜은 다수의 샘플을 간단하고 일관성있는 처리를위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 수정하고 적용되었습니다

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

detection-of-live-escherichia-coli-o157h7-cells-by-pma-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.4K 조회수.  Food and Drug Administration.  H7는 고유 한 유전자 마커, Z3276을 대상으로 :의 qPCR 분석은 대장균 O157 검출을 위해 개발되었다. qPCR에는 라이브 셀 검출을위한 프로피 디움 모노 아자 이드 (PMA) 처리와 결합했다. 이 프로토콜은 다수의 샘플을 간단하고 일관성있는 처리를위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 수정하고 적용되었습니다 

비디오: Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

의 활동을 측정하는 어세이 대장균은 라이신 Decarboxyase을 Inducible

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

연구

생물학

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

구현을위한 프로토콜<em&gt; 대장균</em합성 생물학&gt;을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.