We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission&#8217;s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the &#8220;Stem Cells Call for Proposals.&#8221; This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by &#8220;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&#8221;.

1. תיוג axonal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולים להיות מתויגים סיבים מטפסים על ידי הזרקה או צבעים אורגניים מצומדת לdextrans משקל המולקולרי הגבוה או פלסמיד / וירוסים שיגרמו לביטוי של חלבוני ניאון 26-29. בפרוטוקול זה, צבען האורגני אלקסה פלואוריד Dextran 488 מוזרק לתוך הזית הנחותה לתייג סיבי טיפוס ולדמיין אותם בקליפת המוח הקטן (איור 1). כל ההליכים שתוארו כאן כבר אושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צינור נימי זכוכית על ידי משיכתו על חולץ micropipette. חתוך את קצה צינור זכוכית הנימים במספריים עד הקוטר החיצוני הוא כ 30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנימים עם 1-2 μl של הצבע dextran מצומדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, לעקר את כל מכשירי הניתוח בחיטוי. במהלך ההליך, להפחית את הסיכונים של זיהום על ידי שימוש מעקר חרוז זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר (9-12שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (90 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (9 מ&quot;ג / קילוגרם). להבטיח את החיה מורדמת באופן מלא באמצעות זנב ו / או צובט הבוהן. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את השערות מעל לצוואר עם או סכין גילוח או קרם להסרת שיער. ספוגית האתר כירורגית פעמיים עם בטאדין, לסירוגין עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על בעל stereotaxic. שמור חם של בעלי החיים עם כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את earbars על העצם ליד האוזניים, כך שראשו בחוזקה. לסובב את הראש כדי ליצור זווית 140 ° עם הגוף. ניתן להשיג את הכיוון הרצוי בעדינות על ידי שינוי הגובה של מוט בעל האף על בעל stereotactic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיל כמה טיפות של לידוקאין על העור בין האוזניים. שימוש במלקחיים או סכין גילוח לבצע חתך אנכי של כ 1 סנטימטר על העור מתחת לעורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את הרקמות ושרירים תת עורית על ידי פינצטה הקההים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לדחוף למטה את צרור השריר האופקי ולהחזיק בנפרד את שני fascicles השרירים האנכי במטרה לחשוף את הדורה על מגנום foramen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזהירות רבה, לנתח את הדורה עם מחט מזרק או מלקחיים חדים מאוד כדי לחשוף את גזע המוח. כמות קטנה של נוזל מוחי שדרה עשויה לשפוך החוצה כאשר הדורה נחתכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על micromanipulator stereotactic, לסובב את בעל ° נימי 45 מהאנכיים. הנח את הנימים על קו האמצע, בנקודת האמצע בין קצה הזנב של קליפת המוח הקטן וחוליית הצוואר הראשונה. הכנס את פיפטה בעומק של 2 מ&quot;מ מעל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק 0.5-1.5 μl נפח של צבע על 10-15 דקות. מערכת מחלק microinjection מאפשרת משלוח לחץ מבוקר של הנוזל בנימים (לחץ דופק = 20 psi; משך דופק = 3-4 אלפיות שנייה; תדירות משלוח = הרץ 12 דופק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הנימים במקום במשך 15 דקות, ולאחר מכן slowly (ב2-3 דק &#39;) להסיר אותו. בעדינות מחדש ליישר את השרירים ולתפור את העור מעל. לשמור על השרירים hydrated היטב על ידי יישום חלק מלוח לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע התייבשות, להזריק תת עורי 0.5 מיליליטר של .0.9% NaCl. שמור את החיה בכלוב מחומם עד להחלמה מלאה מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי לנהל Carprofen (5 מ&quot;ג / קילוגרם) ביום למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח. </li></ol> 2. חלון אופטי בקליפת המוח הקטנה הערה: הצבע מועבר ב 2 שבועות מהגרעין olivary הנחותים עד קליפת המוח הקטן למסופי CFS (ראה איור 1). ניתן דמיינו CFS כותרת הדלילות מתחת לחלון גולגולתי הקבוע שניתן לבצע באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל מכשירי הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר כפי שתואר לעיל. השתמש צובט הבוהן כדי לבדוק את בעל החיים הוא מסומם באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את השיער מעל לראשו, נגב את skבמשייכות לסירוגין של אלכוהול 70% ובטאדין ולהחיל משחת עיניים. מניחים את העכבר במסגרת stereotaxic ולמקם את סורגי אוזן כדי להחזיק את הראש בחוזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי לנהל דקסאמתאזון (0.2 מ&quot;ג / קילוגרם) וCarprofen (5 מ&quot;ג / קילוגרם) כדי למנוע התנפחות של המוח ודלקות אפשריות בחלון האתר גולגולתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של לידוקאין על העור מעל הגולגולת וחתך כנף, מבין האוזניים למעל העיניים. החל פתרון לידוקאין שוב על גבי קרום העצם לפני מגרד אותו עם סכין מנתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במקדח השיניים לדק אזור חצי עגול של גולגולת מעל למוח הקטן. החלון ממוקם בדרך כלל מרכזי וכיוון גב התפר, כך עומק הגולגולת הוא כמעט קבוע לאורך כל ההיקף של חץ העיגול. מיצוב החלון קרוב מדי לתפר למבדה וקידוח חוזר ונשנה מעל האזור עבה מאוד זה עלול לגרום להתחממות יתר של המוח והיווצרות של בצקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל עוצר דמוםספוג בגולגולת במקרה של דימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים coverglass בשני חצאים בעזרת סכין גילוח ופינצטה. בדוק שcoverglass הוא מעט יותר גדול מהאי של עצם ויש לו צורה דומה לפני הסרת הכנף של עצם עם פינצטה; אם לא, לעצב מחדש את coverglass או בחר אחד אחר. אל תיגע בדורה מאטר עם פינצטה תוך כדי ציור את העצם. להניח בזהירות במורד coverglass על הדורה. הערה: הדבקות של פני השטח של הזכוכית על הדורה השלם הגדה של חלונות גולגולתי לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות אוויר מתחת לזכוכית על ידי שטיפה שוב ושוב עם תמיסת מלח וייבוש עם מקלות צמר גפן. זה גם יעזור לי הסרת חלק דם שיורית שעלולות להישפך החוצה מנימי דם קטנות לאחר מיצוב הזכוכית. לאטום את החלון בתערובת של דבק אקרילי ומלט שיניים 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החיה על כרית חימום בחדר התאוששות עד שהתאושש לגמרי מהרדמה. אל מחדשלהפוך את העכברים בכלוב בבית עד שהתאושש באופן מלא; לא להשאיר אותם ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי לנהל Carprofen (5 מ&quot;ג / קילוגרם) ביום למשך 2-3 ימים לאחר הניתוח. </li></ol> 3. בVivo Multi-פוטון הלייזר Axotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2-7 ימים מהניתוח לפני ביצוע פגישת ההדמיה הראשונה. המותאם אישית שנבנה מיקרוסקופ שני פוטונים משמש כאן מסופק עם טי: מקור לייזר ספיר (פולסים רוחב 120 FS, שיעור החזרה 90 MHz) שנסרק לראשונה על ידי זוג מראות galvanometric ולאחר מכן התמקד על הדגימה על ידי טבילה במים 20X אובייקטיבי (NA 0.95, WD 2 מ&quot;מ). שלב פיזואלקטריים לולאה סגורה מבצע התקות צירי עד 400 מיקרומטר של המטרה. צינורות מכפיל לאסוף את אות הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה, ולאחר מכן למקם את הראש בבעל stereotactic כך שהחלון גולגולתי מניח במקביל לobjectiיש מישור מוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חקור עם TPF ההדמיה קליפת המוח מתחת לחלון גולגולתי. בחר את האקסון להיפגע בקרב המבריקים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש Z-מחסנית (בדרך כלל שדה הראייה הוא 100 x 100 מיקרומטר 2, ב512 x 512 פיקסלים, 2 מיקרומטר צעד ציר z) כדי לקבל 3D-שחזורים של האקסון הממוקד. בתוך הנפח צילם, לבחור את אתר הנגע בסניף אקסון שנמצאת בעיקר במקביל למישור המוקד. נטייה זו מאפשרת להבקיע במהירות שינויים מורפולוגיים, אשר חזוי של נתיחה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין עם אנרגיה במינון גבוהה הנקודה שנבחרה בחלק הדיסטלי של CF. הדבר נעשה באמצעות תוכנת Labview: להגדיל את כוח הלייזר 5-10x יותר הכוח המשמש להדמיה (≈ 300 mW, נמדד לאחר העדשה האובייקטיבית), לקבוע את המיקום של מראות galvanometric לעשות סריקת קו (~ 4 - 10 מיקרומטר) באתר הנגע ולפתוח את תריס הלייזר ל400-600 אלפית שניים. להתמצא קו הסריקהניצב למישור CF ויחצה לחלוטין את האקסון. הקרנת כתמים בהירים (לדוגמא., ורידים) בדרך כלל מסייעת לנתח את האקסון. אורך הגל לaxotomy לייזר הוא זהה המשמש להדמיה (920 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל הקרינה של האקסון באזור המוקרן transiently יורדת עקב photobleaching. לרכוש ערימה של אותו אזור מספר דקות לאחר ההקרנה כדי להבטיח אבלציה שבוצעה היטב. אם האזור התחיל נפיחות והאקסון יצר מבנים דמוי חרוזים, נוירון כבר גזור בהצלחה. במקרה זה, בכמה שעות (מכמה עשרות דקות ל24hr) החלק הדיסטלי של האקסון יהיה מנוון וייעלם לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרבה הצער מנת האנרגיה הדרושה כדי לייצר axotomy מלא היא לא תמיד צפויה. אם התוצאה היחידה של ההקרנה היא photobleaching, הקרינה צריכה להיות התאוששה במהירות בשל לצבוע דיפוזיה, וההקרנה יש לחזור שוב ליעילהly לנתח את האקסון. כמו כן, במקרה של סימנים של נפיחות אינו מופיעים בתוך 5-20 דקות, או הנפיחות ואחריו התאוששות (. באנלוגיה למה שכבר תאר לdendrotomy לייזר, ראו אלגרה Mascaro אח&#39; 23), נסה שוב עם סריקות חדשות להגדיל את להתעכב זמן ו / או כוח הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על שיפוץ הסופי של האקסון בימים שאחרי axotomy הלייזר עם שני פוטונים בתחום ההדמיה vivo (איורים 2 ו -3). דפוס כלי הדם משמש כדפוס התייחסות כדי לאחזר את האקסון גזור בימים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת עורי לנהל Carprofen (5 מ&quot;ג / קילוגרם) בכל פגישת הדמיה במשך כל תקופת הניסוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Strata, P., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+olivocerebellar+pathway.">Plasticity of the olivocerebellar pathway.</a> Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).</li><li>Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Sacconi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).</li><li>Allegra Mascaro, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single+branch+axotomy+induces+GAP-43-dependent+sprouting+and+synaptic+remodeling+in+cerebellar+cortex.">In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).</li><li>Ylera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-injured+adult+sensory+neurons+gain+regenerative+competence+upon+a+lesion+of+their+peripheral+axon.">Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon.</a> Curr Biol. 19, 930-936 (2009).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+elimination+and+protection+after+minimal+injury+depend+on+cell+type+and+their+prelesion+structural+dynamics+in+the+adult+cerebral+cortex.">Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex.</a> J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+and+regeneration+a+mechanistic+tug+of+war.">Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war.</a> J Neurochem. 108, 23-32 (2009).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Luo, L., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+retraction+and+degeneration+in+development+and+disease.">Axon retraction and degeneration in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).</li><li>Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanycytes+present+in+the+adult+rat+mediobasal+hypothalamus+support+the+regeneration+of+monoaminergic+axons.">Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons.</a> Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).</li><li>Morrison, E. E., Costanzo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+olfactory+sensory+neurons+and+reconnection+in+the+aging+hamster+central+nervous+system.">Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system.</a> Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).</li><li>Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+therapeutics+regeneration+or+sprouting+or+plasticity.">Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity.</a> Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Two-Photon+Excitation+Microscopy+and+Its+Applications+to+Neuroscience.">Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+regulate+dynamic+equilibrium+of+presynaptic+terminals+in+mature+hippocampal+networks.">AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks.</a> Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49, 861-875 (2006).</li><li>Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+nanosurgery+in+live+brain.">Multi-photon nanosurgery in live brain.</a> Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).</li><li>Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+climbing+fibres+surviving+a+subtotal+lesion+of+the+inferior+olive+in+the+adult+rat.+II.+Synaptic+organization+on+reinnervated+Purkinje+cells.">Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells.</a> The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).</li><li>Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sprouting+and+axonal+atrophy+in+cerebellar+climbing+fibres+following+in+vivo+silencing+of+the+growth-associated+protein+GAP-43.">Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43.</a> PLoS One. 6, e20791 (2011).</li><li>Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+motility+and+its+modulation+by+activity+are+branch-type+specific+in+the+intact+adult+cerebellum.">Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum.</a> Neuron. 56, 472-487 (2007).</li><li>Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entire+trajectory+of+single+climbing+and+mossy+fibers+in+the+cerebellar+nuclei+and+cortex.">The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex.</a> Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).</li><li>Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+trophic+interactions+between+climbing+fibres+and+Purkinje+cells+in+the+rat+cerebellum.">Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum.</a> Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. (12), (2008).</li></ol>

We have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג את הנוירונים של הזית הנחותה עם פלורסנט לצבוע. כתוצאה מכך, השיטה לביצוע חלון גולגולתי בקליפת המוח הקטן מתוארת. טכניקה זו מספקת גישה אופטית לחלק המסוף של נוירונים olivocerebellar, סיבי הטיפוס. למרבה הצער, התוצאה של שני תיוג וניתוח פתיחת גולגולת היא ?...

חיתוך רוחב אקסון כתוצאה מפגיעה מכאנית, עלבון רעיל או מחלות ניווניות בדרך כלל על ידי ניוון של החלק הדיסטלי של האקסון שמנותק מהגוף התא 10-13. עם כמה יוצאים מן הכלל 2,7,14,15, אקסונים ניתקו במערכת העצבים המרכזית של בעלי חיים המבוגרים הם בדרך כלל מסוגלים להפעיל תכנית לצמיחה מחודשת 16. מעט מאוד ידוע על הדינמיקה של אירועים ניוונית ברמה התאית וsubcellular בזמן אמת. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות להגבלת נזק עצבי וקידום צמיחה מחודשת עצבית דורש, כצעד ראשון, מבהיר את המנגנון שבאמצעותו תאים עצביים להפליא פצועים להידרדר ולהתחדש. מחקר זה התייחס באופן ישיר ביותר על ידי ניטור הדינמיקה של נוירון בודד in vivo. בעוד טכניקות דימות פלואורסצנטי אחד פוטון מוגבלות על ידי פיזור אינטנסיבי של אור הנראה, שני פוטונים עירור מגיע לשכבות בקליפת המוח עמוקות בliיש עכברים עם רזולוציה 3,4,17 subcellular. ניצול של עכברים הטרנסגניים שבו חלבוני ניאון באים לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתת אוכלוסיות של נוירונים 18-20, מיקרוסקופיה TPF יושמה לחקר פלסטיות הסינפטית והתארכות אקסון במהלך פיתוח in vivo 21,22. T הוא היכולת של הנוירונים שנפגעו באופן מיוחד כדי לגדל מחדש לאחר פציעה יכולה להיחקר על ידי צימוד בניטור vivo על ידי הדמיה שני פוטונים עם מודל של פגיעה הממוקד במיוחד להאקסון של עניין. קליטה רב פוטון של פולסים femtosecond נעשתה שימוש כדי לשבש דנדריטים בודדים או אפילו קוצים בודדים 5,23. יתר על כן, הפרדיגמה פגיעה זו מאפשרת חיתוך ענפי אקסון בודדים מבלי להפריע לדנדריט הפנייה 6. בהקשר של לנתח את התכונות המאפשרות אוכלוסייה עצבית ספציפית להתחדש האקסונים שלהם מרגע שנפגעו, סיבי המוח הקטן טיפוס (CFS) הם si מודל שימושיNCE הם שומרים על תכונות פלסטיק מדהימים לאחר פציעה אפילו בבעלי חיים מבוגרים 24,25. לאחרונה, הדמיה לטווח ארוך של CFS הראתה כי אקסונים אלה מסוגלים Regrowing בימים שאחרי axotomy לייזר 6. פרוטוקול זה מתאר כיצד לתייג נוירונים olivocerebellar והתארכות אקסון באמצעות התחקות אנטרוגרדית. ברגע שתאי העצב של עניין שכותרתו fluorescently, הם יכולים להיות במעקב שוב ושוב בנקודות זמן שרירותיות במשך שבועות או חודשים מתחת לחלון גולגולתי. ההליך לנתח סניפי אקסון בודדים על ידי axotomy לייזר in vivo לאחר מכן ניתן יהיה מאויר. הטכניקות המוצגות כאן מספקות תובנות חדשות על המנגנון של שיפוץ אקסון in vivo ועשויות לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות להגביל ניוון עצבי ולקדם לצמיחה מחודשת עצב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting&#160;</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 (Glass bead sterilizer)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection dispense system</td>
			<td>Picospritzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>64-0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses,&#160; 90 MHz repetition rate</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spongostan, haemostatic sponge&#160;</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirrors&#160;</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier modules&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H7710-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW System Design Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate)</td>
			<td>Boheringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rymadil (carprofen)&#160;</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine clorohydrate 2%</td>
			<td>ATI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 dextran</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser nanosurgery of cerebellar axons in vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג אקסון, in vivo הדמיה וaxotomy לייזר על נוירונים בודדים. ציר הזמן של הניסוי מוצג באיור 1. דוגמא של CFS שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 488 Dextran ודמיין תחת החלון גולגולתי ידי in vivo שני הפוטונים במיקר?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo at JoVE.com

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

laser-nanosurgery-of-cerebellar-axons-in-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

8.1K Views.  University of Florence.  שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo. 

Video: Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...