This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. التحضير للثقافات يطير، حلول وأجهزة المناولة الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأقفاص من ذبابة الفاكهة. وضع 500 + الذباب التزاوج من سلالة المطلوب في قفص السكان مزودة 10 سم لوحة آغار العنب وبقعة من معجون الخميرة. الحفاظ على الثقافة في حاضنة تسيطر 25 درجة مئوية الرطوبة. ملاحظة: &#160; الثقافات القفص تتطلب يوم او يومين من تكييف للحصول على جنين زرع أنماط متناسقة. يتم تغيير لوحات العنب مع عجينة الخميرة مرة واحدة في الصباح ومرة ​​في المساء خلال تكييف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد EPS. حلول الدافئة السطحي (كوكاميد DEA والكحول سلس) في 37 درجة مئوية. ماصة 18 مل من د الليمونين إلى قارورة زجاجية التلألؤ مجهزة بقضيب الصغيرة. ماصة 1 مل كل من اثنين السطحي (5٪ تركيز النهائي من كل منهما) إلى د الليمونين. تخلط جيدا وإزالة بقضيب. ملاحظة: هذا الحل الأسهم EPS من هو جيد لحوالي 2 أشهر في درجة حرارة الغرفة. الحليجب أن تكون درجة حرارة عند 37 درجة مئوية وملتف إلى ذوبان كامل السطحي قبل استخدامها. يجب أن يتم تخزين EPS ود الليمونين في وعاء زجاجي لأنها سوف تذوب بعض المواد البلاستيكية على مر الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل الجنين dechorionation، وسائل الحضانة، وصبغ والحلول المخدرات. خلط 25 مل من التبييض مع 25 مل H 2 O ووضعه في طبق ضحل. إعداد تعديل المتوسطة الأساسية الحضانة (MBIM) وMBIM-T وفقا لصفة قبل 1،12. إعداد شيلدز وسانغ M3 خلية مستنبت وبرنامج تلفزيوني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر قائمة المواد). إعداد محلول المخزون من permeabilization الصبغة في 10 ملي التركيز في DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الأجهزة الجنين للمناولة واللوازم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد dechorionation وسلة العلاج EPS (انظر الشكل 1A). قطعت قسما 3 سم من المتاح البولي بروبلين 50 مل الطرد المركزي / الثقافة أنبوب مع منشار ذو أسنان غرامة. جعل دافق سطح اللحام عن طريق فرك قسم أنبوب على الالتزام الصنفرةعلى سطح الفوق. لحام المقطع أنبوب لNitex شبكة من النايلون من قبل ذوبان حافة الباب أنبوب فوق لهب والملحة إلى شبكة على لوحة زجاجية. السماح لتبرد وتقليم قبالة شبكة إضافية. ملاحظة: ان الجانبين الهائل وأسفل تسمح الشطف السريع والكامل الخروج من التبييض المتبقية وEPS في الخطوات منها. وينبغي القيام بالخطوات اللحام تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلة التنمية. قطع الجزء العلوي من أجهزة الطرد المركزي 50 مل / الثقافة أنبوب تدفق مع حافة الغطاء. إزالة وتعديل الحد الأقصى عن طريق الاستغناء عن افتتاح المركزية والشقوق على طول الحافة كما هو مبين في الشكل 1B. المسمار الغطاء على شبكة وعلى المواضيع من قطع أنبوب الباب وتقليم شبكة إضافية. ملاحظة: غطاء يحتوي على الشقوق في حافة تسمح نشرها إلى متوسطة الأكبر عند وضعه في خزان صحن 60 ملم (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مكونات غرفة الشريحة. قطع مربع من الغشاء DO أكبر منغرفة فتح الشريحة. تطبيق طبقة رقيقة جدا من الشحوم فراغ إلى الشفة داخل فتح. يلصق غشاء DO في افتتاح ختم ضد الشحوم مع عصابة التجنيب. تقليم الغشاء DO الزائدة عن طريق خفض إعادته بالقرب من الدائري التجنيب. ملاحظة: مواصفات غرفة الشريحة يمكن العثور عليها في Kiehart 13 آخرون هذه الغرفة ليست متاحة تجاريا ويتطلب تصنيع مخصصة من قبل ورشة ميكانيكا. </li></ol></li></ol> 2. السقالات وDechorionation، والعلاج EPS من الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التدريج الأجنة عن طريق جمع في الوقت المناسب. ضبط لوحة العنب / الخميرة الطازجة إلى الأقفاص ذبابة في AM. تسمح الأجنة لتكون وضعت لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. تجاهل هذه اللوحة واستبدالها مع لوحة العنب / الخميرة الطازجة لزرع الجنين اللاحقة من 2 ساعة على 25 درجة مئوية. جمع هذه اللوحة والمكان في 18 درجة مئوية حاضنة لمزيد من التدريج التنموية. ملاحظة: 1 ساعات التنمية في 25 ° C يساوي 2 ساعة للتنميةفي 18 درجة مئوية. ويمكن رؤية تأثير الشيخوخة عند 18 درجة مئوية مقابل 25 درجة مئوية على الحفاظ على permeabilization EPS في الأجنة مرحلة متأخرة في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionation. شطف بلطف الأجنة الخروج من لوحة العنب في سلة وشبكة باستخدام 25 ° C ماء الصنبور والفرشاة. شطف الخميرة الزائدة بعيدا عن الأجنة في سلة تحت تيار لطيف من ماء الصنبور. تزج في سلة 50٪ التبييض لمدة 2 دقيقة. غسل الأجنة بدقة تحت تيار من مياه الصنبور. ملاحظة: بخ بلطف محلول التبييض على أجنة بشكل متقطع باستخدام ماصة بلاستيكية. بينما 2 دقيقة وعادة ما يكفي لdechorionation كاملة، يجب فحص هذه المرة الحضانة عن طريق الفحص المباشر وتبعا لذلك. الحفاظ على الأجنة dechorionated في سلة مغمورة في مياه الحنفية والشروع فورا في خطوة EPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج EPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ستة أطباق 60 ملم مع حوالي 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل منهما. إعداد التخفيف عن طريق إذابة EPS 75 EPS ميكرولتر في 2.925 مل MBIM (1:40) في دورق 50 مل الزجاج مع دوامات. ملاحظة: A أشكال مستحلب الأبيض من هذا الخليط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار المياه الزائدة من أسفل السلة مع شبكة مختبر قضاء. تزج في سلة EPS المخفف في كوب ودوامة فورا لتفريق الأجنة في حل EPS في أسفل السلة. تواصل يحوم الحركة لمدة 30 ثانية. ملاحظة: التخفيفات EPS ومرات التعرض يمكن أن تختلف على السيطرة النفاذية. فمن المستحسن أن التخفيفات EPS الأمثل ومرات العلاج تنشأ تجريبيا مع سلالات الذباب المستخدمة. زيادة وقت التعرض إلى 60-90 ثانية مواتية لمرحلة 12 و الأجنة السن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة سلة، وصمة عار بعيدا EPS الزائدة مع مختبر قضاء. المضي قدما مع ست يغسل متتابعة في 10 مل من برنامج تلفزيوني في أطباق 60 ملم. استخدام ماصة بلاستيكية لبخ بلطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني في كل من ستة يغسل. المضي قدما لصبغ وخطوات العلاج من تعاطي المخدرات. ملاحظة: EPS يمكن التخلص من أسفل الحوض. </li></ol></li></ol>3. صبغ والدواء علاج Permeabilized الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صبغ العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملي CY5 الكربوكسيلية حمض صبغ * إلى 1 مل من MBIM-T (50 ميكرومتر تركيز النهائي) في أنبوب 1.5 مل microfuge ودوامة لخلط. ملاحظة: * اختيار الصبغة يعتمد على تحليل المصب. حمض الكربوكسيلية CY5 فعالة للتحليلات لاحقة باستخدام التثبيت والمناعية. رودامين B مفيد لتحليل الأجنة الحية. انبعاث الحمراء رودامين B، والانبعاثات الخضراء من عناصره 1، يمكن تقديم بعض التعقيدات مع تطبيقات المصب باستخدام مضان. المخدرات أو السم يمكن أن تضاف إلى محلول الصبغة لبدء العلاج في هذه المرحلة، أو للحد من العلاج من تعاطي المخدرات / السم لنبضة في هذه المرحلة. ينبغي توخي الحذر في التعامل معها والتخلص من المخدرات والسموم وفقا لمعايير السلامة MSDS والبيئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة من سلة شبكة لمحلول الصبغة باستخدام الفرشاة. غطاء الأنبوب وعكس بشكل متكرر لضمانالأجنة تطفو بحرية في تعليق في محلول الصبغة. وضع أنبوب على الكرسي الهزاز الإيماء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب من nutator والسماح الأجنة تسوية. إزالة محلول الصبغة مع ماصة غرامة واستبدالها مع 1 مل من MBIM-T لغسل. عكس أنبوب لاعادة تعليق أجنة تماما. دعونا الأجنة تسوية وكرر مع ثلاثة يغسل MBIM-T. إزالة كافة MBIM-T من شطف النهائي، والشروع في الخطوة الحضانة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحضانة للتنمية الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى واحدة من مجلسين: سلة التطوير أو غرفة الشريحة. ملاحظة: يفضل سلة التنمية لفترات أطول التنموية، ومطلوب إذا تثبيت والمناعية الخطوات اللاحقة ليتم تنفيذها. غرفة الشريحة هو الأمثل لدقة أعلى الوقت الفاصل بين التصوير والأكثر فعالية لفترات قصيرة التنموية (على سبيل المثال، فإن الأحداث الجنينية المبكرة). المخدرات أو السم يمكن أن تضاف إلى متوسطة على مختلف تركيزات والجنين ديمكن رصد التطور، في الوقت الحقيقي مع أجنة حية أو في نقطة النهاية باستخدام التثبيت القياسية والمناعية البروتوكولات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنمية في سلال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف سلة التنمية من خلال التدفق مع الايثانول 70٪، وشطف جيدا مع غير المتأينة المياه وصمة عار الجافة مع مختبر قضاء. إعداد 6 مل من الحضانة المتوسطة مع التركيز المطلوب من المخدرات أو السم. وضع سلة التنمية في المتوسط ​​60 ملم في أخذ الطبق الحرص على عدم اعتراض فقاعات الهواء تحت قاعدة شبكة. ملاحظة: يتم استخدام اثنين من وسائل الإعلام شيوعا: MBIM وحده، أو MBIM/M3 في 50:50 الخليط، وهذا الأخير هو أكثر فعالية لفترات أطول التنمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة permeabilized لشبكة السطحية في قاعدة سلة مع الفرشاة. بخ بلطف الأجنة مع وسائل الاعلام من الخزان المحيطة بها. تفريق الأجنة مع الفرشاة بحيث تكون في أحادي الطبقة على شبكة. ملاحظة: الشروع في التصوير المجهري وتقييم الجدوى permeabilization وخصائص العلاقات العامةeparation (راجع الخطوة 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التنمية في غرفة الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس غرفة الشريحة وتطبيق حبة صغيرة من الشحوم فراغ على محيط الافتتاح. وضع 150 ميكرولتر من المتوسطة مع المبلغ المطلوب من المخدرات أو السامة على سطح غشاء DO داخل فتح. ملاحظة: يتم استخدام اثنين من وسائل الإعلام شيوعا: MBIM وحده، أو MBIM/M3 في 50:50 الخليط، وهذا الأخير هو أكثر فعالية لفترات أطول التنمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة permeabilized إلى تراجع وسائل الإعلام مع الفرشاة. تفريق الأجنة جعلها تستقر على الغشاء داخل قطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بعناية ساترة 25 مم دائريا فوق افتتاح بالتالي تسطيح المتوسط. اضغط برفق على طول محيط ساترة على شكل خاتم مع الشحوم. ملاحظة: الشروع في التصوير المجهري لتقييم الجدوى permeabilization وخصائص إعداد (راجع الخطوة 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identification من Permeabilized الأجنة قابلة للحياة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة permeabilized. مراقبة الأجنة تحت المجهر epifluorescence مع مجهزة بكاميرا رقمية. الحصول على صور (في الموجة الزرقاء لتحديد الملف الشخصى صفار تألق ذاتي) من عدة حقول باستخدام المجهر الثابتة وإعدادات الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد permeabilization الأجنة على أساس كثافة مضان النسبي. استخدام stereomicroscope مع مسافة عمل كبيرة لاستيعاب سلة والسماح التلاعب في الأجنة. يجب أن تكون مجهزة المجهر مع مرحلة XYZ برمجة، epifluorescence إضاءة وكاميرا رقمية. الصورة الأجنة مع الحرص على تسجيل التعرض والمعلمات موقف المرحلة من كل صورة الجنين لتمكين إعادة تقييم نفس الأجنة في نقطة وقت لاحق (انظر نتيجة ممثل في الشكل 3). ملاحظة: سوف أنماط امتصاص الصبغة تختلف تبعا الصبغة المستخدمة، وطول العمر والتعرض الجنين. هناك مجموعة واسعةامتصاص الصبغة عبر إعداد واحد هو نموذجي ويعكس الاختلاف في درجة permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة قابلة للحياة. بعد وسم موقف الأجنة permeabilized، متابعة تطور الجنين في درجة حرارة الغرفة أو 25 درجة مئوية. العودة سلة أو غرفة الشريحة إلى المجهر. مراقبة تحت الأزرق قناة مضان والحصول على صورة من تألق ذاتي صفار في الأجنة التي تم تحديدها سابقا permeabilized. تقييم الجدوى وفقا لتطور الطبيعي للتوزيع صفار (انظر راند وآخرون (1) ونتيجة ممثل في الشكل 3). ملاحظة: معالم شكلية أخرى من الجنين لاحظ مع brightfield المجهري يمكن استخدامها لتقييم الجدوى. فمن المستحسن أن تحديد مستوى النفاذية والتي تتوافق مع قابلية أن تحدد تجريبيا مع كل صبغة وسلالة من ذبابة المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم آثار المخدرات أو السموم في أجنة قابلة للحياة permeabilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة اإلجراءاتssed مع تستعد البروتوكول أعلاه لعدد من التحليلات التقليدية لاحقة إلى المخدرات أو التعرض للسموم. وتعتبر العديد من أنواع مختلفة من التحليلات في مناقشة أدناه وتشمل الملاحظة المباشرة من التشكل في الأجنة الحية وكذلك يحلل آخر تثبيت-المناعية. يتم تحسين كلا من هذين النهجين باستخدام الأصباغ الحيوية (مثل GFP) التي تكشف عن أنماط التعبير الجيني والنسب الخلية وملامح التشكل. </li></ol>

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يحدد الأسلوب أعلاه وسيلة الحصول على أجنة قابلة للحياة ذبابة الفاكهة التي هي في متناول العلاجات جزيء صغير عبر مجموعة واسعة التنموية. هذا الأسلوب يقدم الرواية والاستنتاج بسيط هو أن الشيخوخة الأجنة عند 18 درجة مئوية تمكن permeabilization الأجنة مرحلة متأخرة مع نفس فعالية ?...

يستمر الجنين ذبابة الفاكهة ليكون نموذجا رئيس الوزراء للتحقيق في الآليات الأساسية للتنمية 2. يتم اعتماد هذا النموذج قوية من قبل مجموعة واسعة من الأدوات الجينية الجزيئية التي تسمح التلاعب من الأساس أي الجينات في أي نقطة زمنية وضمن أي جهاز النامية. حجم صغير، والتطور السريع، وتوصيف واسعة من التشكل الجنين ذبابة الفاكهة جعله نموذجا للاختيار للشاشات الوراثية، وكثير منها قد كشفت مسارات التنموية الأساسية 3،4. وقد اتسمت العديد من الظواهر في الجنين ذبابة الفاكهة والتأويل هي بسهولة، وغالبا ما توفر وسيلة لتحديد الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء مسؤولة عن سمة غير طبيعية. تاريخيا، كان أحد أوجه القصور في نموذج جنين ذبابة صعوبة إدخال جزيئات صغيرة إلى الأنسجة الجنينية. لقد طرحت هذه العقبة القيود على: 1) لناجي النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة المعروفة باسم تحقيقات لاستجواب الآليات التنموية و2) باستخدام هذا النموذج الذي أنشئ لتقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized. نتيجة لذلك، لم تستغل استغلالا كافيا إمكانية فحص الجنين ذبابة في توصيف النشاط جزيء صغير. تسليم الجزيئات الصغيرة إلى الجنين ذبابة يمكن أن يتحقق مع طريقتين: 1) permeabilization من قشر البيض و2) حقن مكروي. تقدم هذه المقالة التقدم لطريقة permeabilization التي هي سهلة لتنفيذ في إعداد مختبر ذبابة الفاكهة التقليدية. تجدر الإشارة إلى أن التطورات الحديثة في طرق حقن مكروي مع التكنولوجيا على microfluidics تساهم أيضا إلى أساليب إدخال المركبات إلى 5،6 الجنين. إدخال جزيئات إلى الجنين والوقاية منها عن طريق طبقة شمعية من قشر البيض 7. يتكون قشر البيض ذبابة الفاكهة من خمس طبقات. منالداخل الى الخارج وهم: الغشاء المحي، وطبقة شمعية، وطبقة المشيمية الداخلية، وباطنة المشيماء ومشيماء أديمية ظاهرة 8. يمكن إزالة طبقات المشيمي الخارجي الثلاثة الطلوع وجيزة من الجنين في تمييع التبييض، ويشار إليها باسم خطوة dechorionation. ويمكن بعد ذلك للخطر طبقة شمعية كشفها بواسطة التعرض للمذيبات العضوية، مثل هيبتان واوكتان 7،9، مما يجعل الجنين dechorionated قابلة للاختراق، في حين لا يزال المغطى في الغشاء المحي الأساسية. ومع ذلك، واستخدام هذه المذيبات يدخل المضاعفات الناجمة عن سميتها وصعوبة في تنظيم عملها permeabilizing قوية، وكلاهما له آثار سلبية على سلامة الجنين صارخ 9،10. وثمة طريقة permeabilization باستخدام تكوين الجنين يطلق permeabilization المذيبات (EPS) التي سبق وصفها 1. يتكون هذا المذيب من د الليمونين والمشتقة من النباتات، التي تمكن السطحي المذيب لتكون misciblالبريد مع مخازن مائي. سمية منخفضة من د الليمونين والقدرة على تمييع المذيبات لتركيزات المطلوب قد حقق وسيلة فعالة لتوليد أجنة قابلة للاختراق مع قابلية عالية 1. ومع ذلك، فقد استمرت اثنين من العوامل الذاتية لتحقيق القيود على التطبيق. الأولى، إثبات عدم التجانس الأجنة في نفاذية بعد العلاج EPS، حتى عندما يتم الحرص على الحفاظ على التدريج التنموية وثيق. الثانية والأجنة أثبتت مضى عليها أكثر من ثماني ساعات تقريبا الصعب permeabilize، بما يتفق مع تصلب قشر البيض الذي يحدث بعد وضع البيض 11. الموصوفة هنا هي التقدم في طريقة EPS ما يلي: 1) المساعدة في تحديد وتحليل الأجنة permeabilized شبه مماثل، حتى بعد تنفيذ الخطوات التثبيت والمناعية و2) تمكين permeabilization الأجنة في وقت متأخر من النقاط الزمنية التنموية (&gt; 8 ساعة، المرحلة 12 وما فوق). على وجه التحديد، وتطبيق صبغة الحمراء بعيدة،حمض الكربوكسيلية CY5، يوصف يخدم كمؤشر النفاذية، والتي استمرت في الجنين خلال تطوير والفورمالديهايد بعد التثبيت. بالإضافة إلى ذلك، وتبين أن تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية يحافظ على قشر البيض في حالة حساسة EPS، وتمكين permeabilization الأجنة في المراحل المتأخرة (12-16 المراحل). هذه التطورات التغلب على القيود التي سبق ذكرها للمنهجية EPS. وبالتالي فإن هذا التطبيق توفير المحققين مع وسيلة لإدخال جزيئات صغيرة من الفائدة إلى الجنين في نقاط متميزة الوقت التنموية مع الحفاظ على قدرتها على البقاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

كان الجنين ذبابة الفاكهة طويلة نموذجا مختبر قوية لتوضيح الآليات الجزيئية والجينية التي تتحكم في التنمية. سهولة التلاعب الجيني مع هذا النموذج قد حل محل النهج الدوائية التي هي شائعة في النماذج الحيوانية الأخرى والمقايسات خلية مقرها. نحن هنا تصف التطورات الحديثة في البروتوكول الذي يتيح تطبيق الجزيئات الصغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين. تفاصيل طريقة الخطوات للتغلب على الكتامة من قشر البيض مع الحفاظ على سلامة الجنين. ويتحقق قشر البيض permeabilization عبر مجموعة واسعة من مراحل النمو عن طريق تطبيق الموصوفة سابقا د الليمونين الجنين permeabilization المذيبات (EPS 1) والشيخوخة الأجنة في انخفاض درجة الحرارة (18 درجة مئوية) قبل العلاج. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استخدام صبغة حمراء بعيدة (CY5) كمؤشر permeabilization، وهو متوافق مع تطبيقات المصب التي تشمل انفلونزا الحمراء والخضراء القياسيةالأصباغ orescent في الأعمال التحضيرية الحية والثابتة. هذا البروتوكول تنطبق على الدراسات التي تستخدم المركبات النشطة بيولوجيا لبحث آليات التنموية فضلا عن الدراسات التي تهدف إلى تقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized.

<html> يتم التعامل مع الأجهزة في الصورة الجنين في الشكل رقم 1 للمساعدة في تصور الأجهزة &quot;محلية الصنع&quot; للتلاعب في البروتوكولين أعلاه. النتائج رأينا في الشكل 2 يوضح تأثير قوي من تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية على قدرتها على أن permeabilized بواسطة EPS في مراحل ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على الحواجز الطبيعية لهذا النهج، وتوسيع المنفعة من طراز الجنين ذبابة الفاكهة.

A طريقة Permeabilization من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.3K Views.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على...

Video: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

فحوصات Neurocircuit عن المضبوطات في المسوخ من الصرع ذبابة الفاكهة</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...