This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Preparación de los cultivos de la mosca, soluciones y dispositivos para la manipulación de embriones <ol><li> Preparar un cultivo en jaulas de Drosophila. Coloque 500 + apareamiento moscas de la cepa deseada en una jaula de población provista de una placa de agar-uva 10 cm y un lugar de pasta de levadura. Mantener la cultura en una incubadora a 25 ° C Humedad. Nota: &#160; Culturas jaula requieren uno o dos días de condicionamiento para obtener patrones de embriones por el que se coherentes. Placas de uva con pasta de levadura se cambian una vez por la mañana y otra por la noche durante el acondicionamiento. </li><li> Preparar EPS. Soluciones calientes de tensioactivos (cocamida DEA y alcohol etoxilado) a 37 ° C. Pipetear 18 ml de d-limoneno a un vial de centelleo de vidrio equipado con una pequeña barra de agitación. Pipetear 1 ml de cada uno de los dos tensioactivos (concentración final de 5% de cada uno) a la d-limoneno. Mezclar bien y retirar una barra de agitación. NOTA: Esta solución madre de EPS es bueno para unos 2 meses a temperatura ambiente. La solucióndebe ser calentado a 37 ° C y agitó por rotación para solubilizar completamente los tensioactivos antes de su uso. EPS y d-limoneno se deben almacenar en un recipiente de vidrio, ya que se disolverán algunos plásticos con el tiempo. </li><li> Prepare la solución dechorionation embrión, medios de incubación, teñir y soluciones de drogas. Mezclar 25 ml de cloro con 25 ml de H2O y colocar en un plato poco profundo. Preparar medio modificado básico de incubación (MBIM) y MBIM-T de acuerdo a la receta antes 1,12. Preparar Shields y Sang M3 medio de cultivo celular y PBS de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Lista de Materiales). Preparar la solución madre de tinte permeabilización en 10 mM de concentración en DMSO. </li><li> Montar dispositivos y suministros embrión de manejo: <ol><li> Preparar dechorionation y cesta tratamiento EPS (ver Figura 1 A). Cortar una sección de 3 cm de polipropileno de 50 ml centrífuga tubo desechable / cultura con una sierra de dientes finos. Hacer el rubor superficie de soldadura por frotamiento la sección del tubo de papel de lija adheridoa una superficie de mesa. Soldar la sección de tubo de malla de nylon Nitex a fundiendo el borde de la sección de tubo sobre una llama y presionando a la malla en una placa de vidrio. Deje enfriar y corte de malla extra. NOTA: Los lados escarpados y el fondo permiten un enjuague rápido y completo fuera de cloro residual y EPS en los pasos respectivos. Los pasos de soldadura deben llevarse a cabo bajo una campana de humos. </li><li> Prepare una canasta de desarrollo. Cortar parte superior de una centrifugadora de tubo de 50 ml / cultura a ras con el borde de la tapa. Eliminar y modificar la tapa cortando una abertura central y muescas a lo largo de la llanta como se muestra en la Figura 1B. Atornille la tapa sobre la malla y en la rosca de la sección del tubo de corte y recorte de malla extra. NOTA: La tapa contiene muescas en el borde que permita la difusión al medio mayor cuando se encuentra en el 60 mm placa de depósito (Figura 1B &#39;). </li><li> Preparar los componentes de una cámara de diapositivas. Corte un cuadrado de membrana DO que es mayor quela abertura de la cámara de diapositivas. Aplique una capa muy fina de grasa de vacío en el labio interior de la abertura. Coloque la membrana de oxígeno en el sellado contra la grasa con el anillo de retención de apertura. Recorte el exceso de membrana DO cortando de nuevo cerca del anillo de retención. NOTA:. Especificaciones de la cámara de diapositivas se pueden encontrar en Kiehart et al 13 Esta cámara no está disponible comercialmente y no requiere fabricación a la medida por un taller mecánico. </li></ol></li></ol> 2. Staging, Dechorionation y EPS Tratamiento de Embriones <ol><li> Staging embriones mediante la recolección oportuna. Fije una placa de uva / levadura fresca a la jaula de la cultura mosca en la AM. Permitir que los embriones que se establezcan durante 1 hora a 25 ° C. Descartar esta placa y reemplazar con una placa de uva / levadura fresca para una colocación posterior de embriones de 2 horas a 25 ° C. Reunir esta placa y lugar en 18 ° C incubadora para su posterior puesta en escena del desarrollo. NOTA: 1 hr de desarrollo a 25 ° C es igual a 2 h de desarrolloa 18 ° C. El efecto de envejecimiento a 18 ° C frente a 25 ° C en el mantenimiento de EPS permeabilización en embriones de etapa tardía se puede ver en la Figura 2. </li><li> Dechorionation. Enjuague suavemente los embriones fuera de la placa de la uva en la cesta de malla utilizando 25 ° C el agua del grifo y un pincel. Enjuague el exceso de levadura lejos de los embriones en el cesto bajo un chorro suave de agua del grifo. Sumerja la canasta en el 50% de lejía durante 2 min. Lave los embriones a fondo bajo un chorro de agua del grifo. NOTA: rociar suavemente solución de cloro en los embriones de forma intermitente con una pipeta de plástico. Mientras que 2 minutos suele ser suficiente para dechorionation completa, este tiempo de incubación debe comprobarse por examen directo y se ajusta en consecuencia. Mantener embriones dechorionated en el cesto inmersos en el agua del grifo y proceder de inmediato a la etapa EPS. </li><li> Tratamiento EPS <ol><li> Preparar seis platos de 60 mm con aproximadamente 10 ml de PBS en cada uno. Preparar EPS dilución disolviendo 75 mu l EPS en 2.925 ml MBIM (1:40) en un vaso de precipitados de 50 ml de vidrio con agitación. Nota: Un blanco forma una emulsión de esta mezcla. </li><li> Secar el exceso de agua de la parte inferior de la cesta de malla con un laboratorio de limpiar. Sumerja cesta en EPS diluidas en vaso y de inmediato girar para dispersar los embriones en la solución de EPS en el fondo de la cesta. Continuar remolinos de movimiento durante 30 segundos. NOTA: EPS diluciones y tiempos de exposición pueden ser variadas para controlar la permeabilidad. Se recomienda que EPS óptimas diluciones y tiempos de tratamiento se establecerán empíricamente con las cepas de moscas que se utilizan. Aumentando el tiempo de exposición a 60-90 seg es favorable para la etapa 12 y embriones de más edad. </li><li> Quite la canasta, seque el exceso de EPS con un laboratorio de limpiar. Proceder con seis lavados secuenciales en 10 ml de PBS en los platos de 60 mm. Usar una pipeta de plástico para rociar suavemente con PBS embriones en cada uno de los seis lavados. Proceder a teñir y etapas de tratamiento de drogas. Nota: EPS pueden eliminarse por el desagüe. </li></ol></li></ol>3. Tinte de Drogas y Tratamiento de permeabilizada embriones <ol><li> Tinte Tratamiento <ol><li> Añadir 5 l de 10 mM de CY5 colorante ácido carboxílico * a 1 ml de MBIM-T (50 mM de concentración final) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agitar para mezclar. NOTA: * Elección de colorante depende de análisis de aguas abajo. Carboxílico CY5 es eficaz para su posterior análisis mediante la fijación y la inmunotinción. Rodamina B es útil para el análisis de embriones vivos. La emisión roja de Rodamina B, y la emisión verde de sus metabolitos 1, puede presentar algunas complicaciones con aplicaciones posteriores utilizando fluorescencia. Fármaco o toxina se pueden añadir a la solución de tinte para iniciar el tratamiento en esta etapa, o para limitar el tratamiento de fármaco / toxina a un pulso en esta etapa. Se debe tener cuidado al manejar y disponer de fármacos y toxinas según MSDS y normas de seguridad ambiental. </li><li> Transferencia de embriones de la canasta de malla para la solución de colorante utilizando un pincel. Tapar el tubo e invierta varias veces para asegurar laembriones flotan libremente en suspensión en la solución de colorante. Coloque el tubo en un agitador oscilante durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire el tubo de nutator y dejar los embriones se depositan. Retire la solución de tinte con una pipeta fina y reemplazar con 1 ml de MBIM-T para lavar. Invertir el tubo para resuspender completamente embriones. Deje que los embriones se depositan y repetir con tres más lavados MBIM-T. Retire todo MBIM-T de enjuague final y proceder al paso de incubación. </li></ol></li><li> Incubación para el Desarrollo de Embriones <ol><li> Transferencia de embriones a una de dos cámaras: La cesta desarrollo o la cámara de diapositivas. NOTA: La cesta de desarrollo se prefiere para períodos de desarrollo más largos, y es necesario si de fijación y de inmunotinción pasos subsiguientes son para ser ejecutado. La cámara de diapositivas es óptimo para time-lapse de una resolución más alta y es más eficaz durante períodos cortos de desarrollo (por ejemplo, los primeros eventos embrionarias). Fármaco o toxina se pueden añadir al medio a varias concentraciones y embrión desarrollo se puede controlar en tiempo real con embriones vivos o en un punto final usando la fijación estándar y protocolos de inmunotinción. </li><li> Desarrollo en Cestas <ol><li> Limpie una canasta desarrollo por chorros con etanol al 70%, enjuague bien con agua desionizada y séquela con laboratorio de limpiar. Preparar 6 ml de medio de incubación con la concentración deseada de fármaco o toxina. Coloque la cesta del desarrollo en el medio en 60 mm plato toma cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo de la base de malla. NOTA: Dos medios de comunicación se utilizan comúnmente: solo MBIM, o MBIM/M3 en una mezcla 50:50, siendo este último más eficaz para períodos más largos de desarrollo. </li><li> Transferencia de embriones permeabilizadas para engranar la superficie en la base de la cesta con un pincel. Rociar suavemente los embriones con los medios de comunicación desde el depósito de los alrededores. Dispersar los embriones con el pincel de manera que están en una monocapa sobre la malla. Nota: Continúe con imágenes de microscopía y evaluar permeabilización y viabilidad características de la preparation (ver paso 4). </li></ol></li><li> Desarrollo de la Cámara de diapositivas <ol><li> Invertir cámara de portaobjetos y aplique una pequeña gota de grasa de vacío en el perímetro de la abertura. Coloque 150 l de medio con la cantidad deseada de fármaco o toxina en la superficie de la membrana de la DO dentro de la abertura. NOTA: Dos medios de comunicación se utilizan comúnmente: solo MBIM, o MBIM/M3 en una mezcla 50:50, siendo este último más eficaz para períodos más largos de desarrollo. </li><li> Transferencia de embriones permeabilizadas a la caída de los medios de comunicación con un pincel. Dispersar los embriones que hacen a establecerse en la membrana dentro de la gota. </li><li> Aplique cuidadosamente un cubreobjetos circular de 25 mm sobre la abertura de aplanamiento de este modo el medio. Presione hacia abajo suavemente a lo largo del perímetro del cubreobjetos para formar un sello con la grasa. Nota: Proceder a la microscopía de imagen para evaluar la permeabilización y viabilidad características de la preparación (ver paso 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identificación de permeabilizada embriones viables <ol><li> Identificar embriones permeabilizadas. Observe embriones bajo epifluorescencia con un microscopio equipado con una cámara digital. Adquirir imágenes (en la longitud de onda azul para determinar el perfil de la yema de autofluorescencia) de varios campos mediante microscopio fijo y ajustes de la cámara. </li><li> Determinar la permeabilización de embriones basados ​​en la intensidad de fluorescencia relativa. Utilice un estereomicroscopio con una distancia de trabajo grande para acomodar la cesta y para permitir las manipulaciones de los embriones. El microscopio debe estar equipado con una etapa XYZ programable, iluminación de epifluorescencia y una cámara digital. Imagen de los embriones que se ocupan de registrar la exposición y parámetros de posición etapa de cada imagen de embriones para que la reevaluación de los mismos embriones en un momento posterior (véase el resultado representativo en la Figura 3). Nota: Los patrones de absorción de colorante variarán dependiendo del colorante utilizado, duración de la exposición y la edad del embrión. Una amplia gamade absorción de colorante a través de una sola preparación es típica y refleja la variación en el grado de permeabilización. </li><li> Identificar los embriones viables. Después de posición de embriones permeabilizadas marcado, continuar con el desarrollo del embrión a temperatura ambiente o 25 ° C. Canasta o cámara de diapositivas Volver al microscopio. Observe debajo de fluorescencia azul canal y adquirir una imagen de autofluorescencia yema en embriones permeabilizadas previamente identificados. Evaluar la viabilidad de acuerdo con la progresión normal de la distribución de la yema (véase Rand et al. 1 y resultado representativo en la Figura 3). Nota: Otras características morfológicas del embrión observado con microscopia de campo claro se pueden utilizar para evaluar la viabilidad. Se recomienda que se establece el nivel de permeabilidad que es compatible con la viabilidad puede determinarse empíricamente con cada colorante y la cepa de mosca utilizado. </li><li> Evaluar los efectos de drogas o toxinas en los embriones viables permeabilizadas. </li><li> Embriones processed con el protocolo anterior están a punto para un número de convencional análisis posteriores a la droga o exposición a toxinas. Varios de los diversos tipos de análisis son considerados en la discusión que sigue, e incluyen la observación directa de la morfogénesis en embriones vivos, así como los análisis de inmunotinción posterior a la fijación. Ambos enfoques se han mejorado por el uso de colorantes vitales (por ejemplo, GFP) que revelan los patrones de expresión de genes y linaje celular y la morfología de los perfiles. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El método anterior describe un medio para la obtención de embriones de Drosophila viables que sean accesibles a los pequeños tratamientos de moléculas a través de una amplia gama de desarrollo. Este método introduce el nuevo hallazgo y simple que el envejecimiento de los embriones a 18 º C permite la permeabilización de embriones de etapa tardía con la misma eficacia que visto previamente sólo en embriones en etapa temprana. Además, el uso de la Cy5 tinte ácido carboxílico rojo lejano como un indic...

El embrión de Drosophila sigue siendo un modelo principal de investigación de los mecanismos fundamentales del desarrollo 2. Este poderoso modelo se apoya en una amplia gama de herramientas de genética molecular que permiten la manipulación de prácticamente cualquier gen en cualquier punto del tiempo y dentro de cualquier órgano en desarrollo. El pequeño tamaño, el rápido desarrollo, y una amplia caracterización de la morfogénesis del embrión de Drosophila lo convierten en un modelo de elección para las pantallas de genética, muchos de los cuales han descubierto vías fundamentales de desarrollo 3,4. Numerosos fenotipos en el embrión de Drosophila han sido caracterizados y son fáciles de interpretar, a menudo proporcionando un medio para identificar los mecanismos genéticos moleculares subyacentes responsables de un rasgo anormal. Históricamente, una deficiencia del modelo de embrión de la mosca ha sido la dificultad de la introducción de pequeñas moléculas a tejidos embrionarios. Este obstáculo ha planteado limitaciones sobre: ​​1) nosción conocidas pequeñas moléculas bioactivas como sondas para interrogar a los mecanismos de desarrollo y 2) el uso de este modelo establecido para evaluar la actividad teratogénica o farmacológica de moléculas pequeñas no caracterizados. Como consecuencia, el potencial de detección de la embrión de la mosca se ha infrautilizado en la caracterización de pequeña molécula de la actividad. Entrega de pequeñas moléculas para el embrión de la mosca se puede lograr con dos métodos: 1) permeabilización de la cáscara de huevo y 2) de microinyección. Este artículo presenta los avances en el método de permeabilización que son fáciles de ejecutar en el entorno de un laboratorio de Drosophila convencional. Cabe señalar que los recientes avances en los métodos de microinyección con tecnología de microfluidos también está contribuyendo a los métodos de introducción de compuestos en el 5,6 embrión. La introducción de moléculas para el embrión es impedido por una capa cerosa de la cáscara del huevo 7. La cáscara de los huevos de Drosophila se compone de cinco capas. Desdeadentro hacia afuera son: la membrana vitelina, la capa cerosa, la capa coriónica interior, el endochorion y la exocorion 8. Las tres capas coriónicas exteriores se pueden eliminar mediante una breve inmersión del embrión en lejía diluida, un paso conoce como dechorionation. La capa cerosa expuesta puede entonces verse comprometida por la exposición a disolventes orgánicos, tales como heptano y octano 7,9, haciendo que el embrión dechorionated permeable, mientras que permanece encerrado en la membrana vitelina subyacente. Sin embargo, el uso de estos disolventes introduce complicaciones debido a su toxicidad y la dificultad en la regulación de su fuerte acción permeabilizante, ambos de los cuales tienen efectos negativos sobre Stark 9,10 viabilidad de los embriones. Un método de permeabilización utilizando una composición denomina embrión permeabilización de disolvente (EPS) ha sido previamente descrito 1. Este disolvente consiste en tensioactivos d-limoneno y derivados de las plantas que permiten que el disolvente sea misciblE con tampones acuosos. La baja toxicidad de d-limoneno y la capacidad para diluir el disolvente a concentraciones deseadas ha producido un método eficaz para generar embriones permeables con alta viabilidad 1. Sin embargo, dos factores endógenos han continuado para llevar limitaciones a la aplicación. En primer lugar, los embriones demuestran la heterogeneidad de la permeabilidad después del tratamiento de EPS, incluso cuando se tiene cuidado de mantener la estadificación del desarrollo de cerca. En segundo lugar, los embriones mayores de aproximadamente ocho horas han demostrado ser difícil para permeabilizar, consistente con un endurecimiento de la cáscara del huevo que se produce después de la puesta de huevos 11. Descrito aquí están los avances en el método de EPS que: 1) ayudar en la identificación y el análisis de los embriones casi idénticamente permeabilizadas, incluso después de las etapas de fijación y inmunoticción se han ejecutado y 2) permiten la permeabilización de los embriones en los puntos de tiempo de desarrollo tardías (&gt; 8 horas, el escenario 12 años o más). Específicamente, la aplicación de un colorante rojo lejano,Ácido carboxílico Cy5, se describe que sirve como un indicador de la permeabilidad, que persiste en el embrión durante el desarrollo y después de la fijación de formaldehído. Además, se muestra que la cría de los embriones a los 18 ° C mantiene la cáscara del huevo en un estado sensible EPS, lo que permite la permeabilización de los embriones de etapa tardía (etapas 12-16). Estos avances superan las limitaciones mencionadas anteriormente en la metodología EPS. Por tanto, esta aplicación proporcionará a los investigadores una manera de introducir pequeñas moléculas de interés para el embrión en puntos de tiempo de desarrollo distintas, manteniendo la viabilidad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

El embrión de Drosophila ha sido durante mucho tiempo un modelo de laboratorio de gran alcance para dilucidar los mecanismos moleculares y genéticos que controlan el desarrollo. La facilidad de manipulaciones genéticas con este modelo ha suplantado enfoques farmacológicos que son comunes en otros modelos animales y ensayos basados ​​en células. A continuación se describe los recientes avances en un protocolo que permite la aplicación de pequeñas moléculas a la fruta en desarrollo embrión de la mosca. El método de detalles de medidas para superar la impermeabilidad de la cáscara del huevo, mientras que el mantenimiento de la viabilidad del embrión. Cáscara de huevo de permeabilización a través de una amplia gama de etapas de desarrollo se logra por aplicación de un d-limoneno embrión permeabilización descrito anteriormente disolvente (EPS 1) y por el envejecimiento de los embriones a temperatura reducida (18 ° C) antes de los tratamientos. Además, se describe el uso de un colorante rojo lejano (Cy5) como un indicador de la permeabilización, que es compatible con aplicaciones posteriores que implican estándar gripe rojo y verdecolorantes orescent en preparados en vivo y fijos. Este protocolo es aplicable a los estudios que utilizan compuestos bioactivos para investigar los mecanismos de desarrollo, así como para los estudios dirigidos a evaluar la actividad teratogénica o farmacológica de moléculas pequeñas no caracterizadas.

Dispositivos para la manipulación de embriones se representan en la Figura 1 para ayudar en la visualización de los dispositivos &quot;caseros&quot; para la manipulación de los protocolos anteriores. Resultados visto en la Figura 2 ilustran el efecto robusto de la cría de embriones a 18 ° C en su capacidad de ser permeabilizadas por EPS en las etapas tardías de desarrollo. Esta condición se aplica en la etapa de protocolo 2.1. Eficacia del colorante ácido carboxílico CY5 para r...

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introducción de pequeñas moléculas para el desarrollo de embrión de Drosophila ofrece un gran potencial para la caracterización de la actividad biológica de nuevos compuestos, fármacos y toxinas, así como para sondear las vías fundamentales de desarrollo. Los métodos descritos en este documento describen los pasos que superan las barreras naturales de este enfoque, la ampliación de la utilidad del modelo de embrión de Drosophila.

Un método de permeabilización de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones para ensayos de moléculas pequeñas Actividad

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K vistas.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Introducción de pequeñas moléculas para el desarrollo de embrión de Drosophila ofrece un gran potencial para la caracterización de la actividad biológica de nuevos compuestos, fármacos y toxinas, así como para sondear las vías fundamentales de desarrollo. Los métodos descritos en este documento describen los pasos que superan las barreras naturales de este enfoque, la ampliación de la utilidad del modelo de embrión de Drosophila. 

Video: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Investigación

Biología

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Dos tipos de ensayos para la detección de espermatozoides quimioatracción rana

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

De alto rendimiento para los moduladores de molécula pequeña de tráfico de perfeccionamiento activo Canales rectificador de potasio

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Un método de permeabilización de

Resumen

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