This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Preparação das Culturas Fly, soluções e dispositivos de manuseio de embriões <ol><li> Prepara-se uma cultura de Drosophila gaiola. Coloque 500 moscas + acasalamento da tensão desejada em uma gaiola população equipado com uma placa de uva-agar 10 centímetros e uma mancha de levedura colar. Manter a cultura numa incubadora controlada de 25 ° C humidade. Nota: &#160; Gaiola culturas requerem um ou dois dias de condicionamento para obter padrões de embriões, que consistentes. Placas de uvas com levedura pasta são mudadas uma vez pela manhã e outra à noite durante o condicionamento. </li><li> Prepare EPS. As soluções quentes de agentes tensioactivos (cocamida DEA e álcool etoxilado), a 37 ° C. Pipetar 18 ml de d-limoneno para um frasco de cintilação de vidro equipado com uma pequena barra de agitação. Pipete 1 mL de cada um dos dois agentes tensioactivos (5% de concentração final de cada um) para o d-limoneno. Misture bem e retire barra de agitação. NOTA: Esta solução estoque de EPS é bom para aproximadamente 2 meses à temperatura ambiente. A soluçãodeve ser aquecido a 37 ° C e agitada para solubilizar totalmente tensioactivos antes da utilização. EPS e d-limoneno deve ser armazenado num recipiente de vidro em que se dissolverá ao longo do tempo alguns plásticos. </li><li> Preparar a solução dechorionation embrião, médiuns de incubação, corante e soluções de drogas. Misture 25 ml de água sanitária com 25 ml de H2O e coloque no prato raso. Prepare meio modificado básica de incubação (MBIM) e MBIM-T de acordo com a receita anterior 1,12. Prepare Shields e Sang M3 célula meio de cultura e PBS acordo com o protocolo do fabricante (veja a lista de materiais). Preparar a solução estoque de corante permeabilização em 10 mM de concentração em DMSO. </li><li> Montar dispositivos de manipulação de embriões e de suprimentos: <ol><li> Prepare dechorionation e cesta tratamento EPS (ver Figura 1A). Corte uma seção 3 centímetros de 50 ml de polipropileno centrífuga / tubo de cultura descartável com uma serra de dentes finos. Faça a superfície nivelada soldagem por fricção da seção de tubo de lixa aderidoa uma superfície em bancada. Solda a secção do tubo de malha de nylon Nitex por fusão do rebordo da secção de tubo sobre uma chama e pressionando a malha de uma placa de vidro. Deixe esfriar e retire malha extra. NOTA: Os lados eo fundo pura permitir lavagem rápida e completa fora de lixívia residual e EPS nas respectivas etapas. Os passos de soldagem deve ser realizada sob uma coifa. </li><li> Prepare uma cesta de desenvolvimento. Cortar parte de cima de uma centrífuga de 50 ml / tubo de cultura nivelada com a borda da tampa. Remover e modificar a tampa cortando uma abertura central e entalhes ao longo da borda, como mostrado na Figura 1B. Aperte a tampa sobre a malha e nos tópicos da seção de tubo de cortar e aparar malha extra. NOTA: O tampão contém entalhes na borda que permita ao meio de difusão em massa, quando posicionada no reservatório 60 milímetros prato (Figura 1B). </li><li> Prepare componentes de uma câmara de slide. Corte um quadrado de membrana DO que é maior do quea abertura da câmara slide. Aplicar uma camada muito fina de graxa de vácuo para o bordo interior da abertura. Cole a membrana DO na abertura de vedação contra a graxa com o anel de retenção. Apare o excesso de membrana DO cortando-o de volta perto do anel de retenção. NOTA:. Especificações para a câmara de slides podem ser encontrados em Kiehart et al 13 Esta câmara não está disponível comercialmente e requer fabricação personalizada por uma oficina mecânica. </li></ol></li></ol> 2. Staging, Dechorionation e EPS Tratamento de embriões <ol><li> Encenação embriões por coleta cronometrado. Definir uma placa de uva fresca / fermento para a cultura gaiola mosca na AM. Permitir que os embriões para ser colocado durante 1 hora a 25 ° C. Descarte este prato e substituir por uma placa de uva fresca / fermento para uma colocação embrião posterior de 2 horas a 25 ° C. Recolha este prato e coloque em 18 ° C incubadora para posterior preparo de desenvolvimento. NOTA: 1 h de desenvolvimento a 25 ° C é igual a 2 horas de desenvolvimentoa 18 ° C. O efeito de envelhecimento a 18 ° C versus 25 ° C mantendo em EPS permeabilização em embriões de fase tardia pode ser visto na Figura 2. </li><li> Dechorionation. Delicadamente, lave embriões fora do prato uva na cesta de malha utilizando 25 ° C a água da torneira e um pincel. Lavar o excesso de levedura longe dos embriões na cesta sob um fluxo suave de água da torneira. Mergulhe a cesta em 50% de lixívia por 2 min. Lave embriões completamente sob uma corrente de água da torneira. NOTA: Com cuidado, esguichar solução de água sanitária em embriões de forma intermitente, utilizando uma pipeta de plástico. Enquanto 2 min é geralmente suficiente para dechorionation completa, este tempo de incubação deve ser verificado pelo exame direto e ajustados em conformidade. Manter embriões dechorionated no cesto imerso em água corrente e proceder imediatamente ao passo EPS. </li><li> Tratamento EPS <ol><li> Prepare seis pratos com 60 milímetros aproximadamente 10 ml de PBS em cada. Prepare diluição EPS dissolvendo 75 EPS ul em 2.925 ml MBIM (01:40) num copo de vidro de 50 ml com agitação. Nota: Forma-se uma emulsão branca dessa mistura. </li><li> Drenar o excesso de água a partir do fundo do cesto de rede com um laboratório de limpar. Imergir carrinho em EPS diluídas em copo e imediatamente rodam para dispersar os embriões na solução EPS no fundo do cesto. Continue girando o movimento por 30 segundos. NOTA: diluições EPS e tempos de exposição pode variar para controlar a permeabilidade. Recomenda-se que as diluições de EPS óptimas e tempos de tratamento ser estabelecida empiricamente com as estirpes de moscas serem utilizados. O aumento do tempo de exposição a 60-90 seg é favorável para a fase 12 e os embriões mais velhos. </li><li> Remover cesta, apagar longe EPS excesso com um laboratório de limpar. Continuar com seis lavagens sequenciais em 10 ml de PBS nos pratos de 60 mm. Usar uma pipeta de plástico para esguichar suavemente embriões com PBS em cada um dos seis lavagens. Prossiga para tingir e etapas de tratamento de drogas. Nota: EPS pode ser descartado na pia. </li></ol></li></ol>3. Dye and Drug Treatment permeabilizadas de Embriões <ol><li> Tratamento Dye <ol><li> Adicionar 5 mL de 10 mM de CY5 corante ácido carboxílico * com 1 ml de MBIM-T (50 uM de concentração final) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex para misturar. NOTA: * Escolha de corante depende da análise a jusante. Ácido carboxílico CY5 é eficaz para análises posteriores utilizando fixação e imunomarcação. Rodamina B é útil para a análise de embriões vivos. A emissão vermelho de Rodamina B, ea emissão verde de seus metabólitos 1, pode apresentar algumas complicações com aplicações a jusante usando fluorescência. Drogas ou toxina pode ser adicionado à solução de corante para iniciar o tratamento, neste fase, ou para limitar o tratamento de droga / toxina a um impulso nesta fase. Cuidados devem ser tomados ao manusear e descartar de drogas e toxinas de acordo com a Ficha de Segurança e normas de segurança ambiental. </li><li> Transferir embriões a partir do cesto de rede para a solução de corante utilizando um pincel. Tapar o tubo e inverter várias vezes para assegurar aembriões flutuar livremente em suspensão na solução de corante. Colocar o tubo em um balancim de nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Retire o tubo do nutator e deixe embriões resolver. Remover solução de corante com uma pipeta fina e substituir com 1 ml de MBIM-T para lavar. Inverta tubo para re-suspender embriões completamente. Vamos resolver embriões e repita com mais três lavagens MBIM-T. Remova todo MBIM-T de enxaguamento final e proceder à etapa de incubação. </li></ol></li><li> A incubação para o desenvolvimento do embrião <ol><li> Transferência de embriões para uma das duas câmaras: A cesta de desenvolvimento ou a câmara de slide. NOTA: A cesta de desenvolvimento é o preferido para períodos de desenvolvimento mais longos, e é necessário se de fixação e de positividade passos seguintes devem ser executados. A câmara de slide é ideal para resolução maior lapso de tempo de imagem e é mais eficaz para períodos curtos de desenvolvimento (por exemplo, os eventos embrionárias precoces). Drogas ou toxina pode ser adicionado ao meio em várias concentrações e embrião desenvolvimento pode ser monitorado em tempo real com embriões vivos ou em um ponto de extremidade usando fixação padrão e imunomarcação protocolos. </li><li> Desenvolvimento em Cestas <ol><li> Limpe uma cesta de desenvolvimento por esguichando com etanol 70%, lavar abundantemente com água deionizada e secar com laboratório de limpar. Prepare a 6 ml de meio de incubação com a concentração desejada de droga ou toxina. Coloque o cesto desenvolvimento em meio a 60 milímetros tomada prato cuidado para não prender as bolhas de ar sob a base de malha. NOTA: Dois mídia são comumente usados: sozinho MBIM ou MBIM/M3 em uma mistura de 50:50, sendo este último mais eficaz para os períodos de desenvolvimento mais longos. </li><li> Transferência de embriões permeabilizadas a malha de superfície na base da cesta com um pincel. Gentilmente esguichar os embriões com a mídia do reservatório circundante. Dispersar os embriões com o pincel de modo a que eles estão dentro de uma monocamada na malha. Nota: Vá para a imagem de microscopia e avaliar as características permeabilização ea viabilidade do preparation (veja o passo 4). </li></ol></li><li> Desenvolvimento na Câmara de slides <ol><li> Inverta câmara de corrediça e aplicar uma pequena gota de graxa vácuo sobre o perímetro da abertura. Colocar 150 mL de meio com a quantidade desejada de fármaco ou toxina sobre a superfície da membrana DO dentro da abertura. NOTA: Dois mídia são comumente usados: sozinho MBIM ou MBIM/M3 em uma mistura de 50:50, sendo este último mais eficaz para os períodos de desenvolvimento mais longos. </li><li> Transferência de embriões permeabilizadas à queda dos meios de comunicação com um pincel. Dispersar os embriões tornando-se estabelecer na membrana dentro da gota. </li><li> Cuidadosamente aplicar um 25 milímetros lamela circular sobre a abertura achatamento assim o meio. Pressionar suavemente ao longo do perímetro da lamela de modo a formar uma vedação com a gordura. Nota: Vá para a microscopia de imagem para avaliar as características permeabilização ea viabilidade da preparação (veja o passo 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identificação de permeabilizadas embriões viáveis <ol><li> Identificar embriões permeabilizadas. Observe embriões sob epifluorescência, com um microscópio equipado com uma câmera digital. Adquirir imagens (no comprimento de onda azul para determinar o perfil de gema autofluorescência) de vários campos usando microscópio fixa e configurações da câmera. </li><li> Determinar a permeabilização de embriões com base na intensidade de fluorescência relativa. Usar-se um estereomicroscópio com uma grande distância de trabalho para acomodar o cesto e para permitir as manipulações dos embriões. O microscópio deve ser equipado com um palco XYZ programável, iluminação epifluorescência e uma câmera digital. Imagem os embriões tendo o cuidado de gravar a exposição e parâmetros de posição palco cada imagem embrião de habilitar reavaliação dos mesmos embriões em um ponto mais tarde (ver resultado representativo na Figura 3). Nota: Os padrões de absorção de corante vai variar dependendo do corante utilizado, o tempo de exposição e da idade do embrião. Uma ampla gamade absorção de corante através de uma única preparação é típica e reflecte a variação no grau de permeabilização. </li><li> Identificar embriões viáveis. Após posição de embriões permeabilizadas marcação, continuar com o desenvolvimento do embrião à temperatura ambiente ou a 25 ° C. Retornar cesta ou câmara de slides para microscópio. Observe em azul canal de fluorescência e adquirir imagem de autofluorescência gema em embriões permeabilizadas previamente identificados. Avaliar a viabilidade de acordo com a progressão normal da distribuição da gema (ver Rand et ai. 1 e resultado representativo na Figura 3). Nota: Outras características morfológicas do embrião observada por microscopia de campo claro podem ser utilizadas para avaliar a viabilidade. Recomenda-se que o estabelecimento do nível de permeabilidade que é compatível com a viabilidade ser determinada empiricamente com cada corante e tensão de fly usado. </li><li> Avaliar efeitos de drogas ou toxinas na embriões viáveis ​​permeabilizadas. </li><li> Embriões processed com o protocolo acima estão prontas para uma série de análises convencionais subseqüente ao de drogas ou exposição a uma toxina. Vários dos vários tipos de análises são consideradas na discussão abaixo e incluir a observação direta de morfogênese em embriões vivos, bem como análises de pós-fixação imunocoloração. Ambas as abordagens são reforçadas pelo uso de corantes vitais (por exemplo, GFP), que revelam os padrões de expressão de genes e linhagem de células e perfis de morfologia. </li></ol>

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. 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P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O método acima descreve um meio para a obtenção de embriões viáveis ​​de Drosophila, que são acessíveis para pequenos tratamentos da molécula através de uma gama ampla de desenvolvimento. Este método apresenta a nova e simples constatação de que o envelhecimento embriões a 18 ° C permite a permeabilização de embriões em estágio final com a mesma eficácia, como anteriormente visto apenas em embriões em estágio inicial. Além disso, a utilização do corante CY5 ácido carboxílico vermel...

O embrião Drosophila continua a ser um modelo privilegiado para investigação dos mecanismos fundamentais do desenvolvimento 2. Este modelo poderoso é suportada por uma grande variedade de técnicas de genética molecular que permitem a manipulação de essencialmente qualquer gene em qualquer ponto de tempo e dentro de qualquer órgão em desenvolvimento. O tamanho pequeno, rápido desenvolvimento, e uma extensa caracterização da morfogênese do embrião Drosophila torná-lo um modelo de escolha para as telas genéticos, muitos dos quais descobertos vias de desenvolvimento fundamentais 3,4. Numerosos fenótipos no embrião de Drosophila têm sido caracterizados e são facilmente interpretável, frequentemente proporcionar um meio para identificar os mecanismos genéticos moleculares subjacentes responsáveis ​​por um traço anormal. Historicamente, uma desvantagem do modelo de embrião da mosca tem sido a dificuldade de introdução de moléculas pequenas para tecidos embrionários. Esse obstáculo tem colocado limitações: 1) nosção conhecidos pequenas moléculas bioativas como sondas para interrogar os mecanismos de desenvolvimento e 2) usando este modelo estabelecido para avaliar a atividade teratogênica ou farmacológica de moléculas pequenas descaracterizados. Como conseqüência, o potencial de triagem do embrião da mosca tem sido subutilizada em caracterização de pequena atividade molécula. Entrega de moléculas pequenas para o embrião da mosca pode ser alcançado com dois métodos: 1) permeabilização da casca do ovo e 2) de micro-injecção. Este artigo apresenta avanços ao método de permeabilização que são fáceis de executar no ambiente de um laboratório de Drosophila convencional. Deve notar-se que os avanços recentes nos métodos de microinjecção com tecnologia de microfluidos contribui também a métodos para a introdução de compostos para o 5,6 embrião. A introdução de moléculas para o embrião é impedida por uma camada de cera de casca do ovo 7. A casca de ovo Drosophila é composto por cinco camadas. A partir dedentro para fora que são: a membrana vitelina, a camada de cera, a camada interior coriónica, o endochorion eo Exocório 8. As três camadas coriônicos exteriores podem ser removidos através de uma breve emersão do embrião em diluída de lixívia, um passo designado por dechorionation. A camada de cera exposta pode ser comprometida por exposição a solventes orgânicos, tais como heptano, octano e 7,9, o que tornou o embrião dechorionated permeável, enquanto continua a ser envolto na membrana vitelina subjacente. No entanto, o uso desses solventes apresenta complicações devido a sua toxicidade ea dificuldade em regular a sua forte ação permeabilizante, sendo que ambos têm efeitos negativos sobre a viabilidade do embrião stark 9,10. Um método de permeabilização usando uma composição denominada permeabilização embrião solvente (EPS) foi previamente descrito 1. Este solvente consiste de d-limoneno e derivados de plantas surfactantes que permitem que o solvente seja misciblenviar um e com tampões aquosos. A baixa toxicidade de d-limoneno e a capacidade para diluir o solvente para as concentrações desejadas produziu um método eficaz para gerar embriões permeáveis ​​com uma alta viabilidade. No entanto, dois factores endógenos têm continuado a trazer limitações à aplicação. Primeiro, os embriões demonstram a heterogeneidade da permeabilidade após o tratamento EPS, mesmo quando o cuidado de manter uma estreita encenação de desenvolvimento. Em segundo lugar, os embriões mais velhos do que aproximadamente oito horas provaram difíceis de permeabilizar, de acordo com um endurecimento da casca do ovo que ocorre após a postura dos ovos, 11. Descrito aqui estão os avanços no método EPS que: 1) auxiliar na identificação e análise de embriões quase idêntica permeabilizadas, mesmo após a fixação e positividade passos foram executados e 2) permitir a permeabilização de embriões no final momentos de desenvolvimento (&gt; 8 horas, o estágio 12 e mais velhos). Especificamente, a aplicação de um corante vermelho distante,Ácido carboxílico CY5, está descrito que serve como um indicador da permeabilidade, que persiste no embrião em desenvolvimento, durante e após a sua fixação formaldeído. Além disso, mostra-se que a criação de embriões a 18 ° C mantém a casca de ovo num estado sensível EPS, permitindo a permeabilização de embriões de fase tardia (etapas 12-16). Esses avanços superar as limitações mencionadas anteriormente à metodologia EPS. Esta aplicação irá, portanto, fornecer aos investigadores um meio para introduzir pequenas moléculas de interesse para o embrião em distintos momentos de desenvolvimento, mantendo a viabilidade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

O embrião Drosophila tem sido um modelo de laboratório poderosa para elucidar os mecanismos moleculares e genéticos que controlam o desenvolvimento. A facilidade de manipulação genética com este modelo suplantou abordagens farmacológicas que são comuns em outros modelos animais e ensaios baseados em células. Aqui, descrevemos os recentes avanços em um protocolo que permite a aplicação de moléculas pequenas para o desenvolvimento do embrião da mosca de fruta. O método detalha medidas para superar a impermeabilidade da casca do ovo, mantendo a viabilidade do embrião. Casca de ovo de permeabilização através de uma ampla gama de fases de desenvolvimento é conseguido através da aplicação de uma permeabilização anteriormente descrito embrião d-limoneno solvente (EPS 1) e pelo envelhecimento embriões, a temperatura reduzida (18 ° C) antes de tratamentos. Além disso, o uso de um corante vermelho-distante (CY5) como um indicador de permeabilização é descrito, o qual é compatível com aplicações a jusante, envolvendo gripe vermelho e verde padrãocorantes orescent em preparações ao vivo e fixos. Este protocolo é aplicável a estudos utilizando compostos bioativos para investigar os mecanismos de desenvolvimento, bem como para estudos destinados à avaliação da atividade teratogênica ou farmacológica de moléculas pequenas descaracterizados.

Dispositivos de manipulação de embriões são apresentados na Figura 1 para auxiliar na visualização dos dispositivos de &quot;home-made&quot; para manipulação de protocolos acima. Os resultados observados na figura 2 ilustram o efeito robusto de criação de embriões a 18 ° C na sua capacidade de ser permeabilizada por EPS nas fases finais de desenvolvimento. Esta condição é aplicada no passo protocolo 2.1. A eficácia do corante ácido carboxílico CY5 para revelar os vári...

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introdução de moléculas pequenas para o embrião de Drosophila em desenvolvimento oferece um grande potencial para a caracterização de actividade biológica de novos compostos, medicamentos e toxinas, bem como para sondar as vias de desenvolvimento fundamentais. Métodos descritos aqui delinear medidas que superem as barreiras naturais para essa abordagem, ampliando a utilidade do modelo embrião Drosophila.

Um método de permeabilização de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões para Ensaios de pequena molécula Atividade

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.3K visualizações.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Introdução de moléculas pequenas para o embrião de Drosophila em desenvolvimento oferece um grande potencial para a caracterização de actividade biológica de novos compostos, medicamentos e toxinas, bem como para sondar as vias de desenvolvimento fundamentais. Métodos descritos aqui delinear medidas que superem as barreiras naturais para essa abordagem, ampliando a utilidade do modelo embrião Drosophila. 

Vídeo: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Ensaios Neurocircuit para Apreensões em mutantes de Epilepsia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...