This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Préparation des cultures Fly, Solutions et périphériques embryon de manutention <ol><li> Préparer une culture de la cage de la drosophile. Placez 500 vol + accouplement de la souche souhaitée dans une cage de la population équipée d&#39;une plaque de raisin-agar 10 cm et une tache de pâte de levure. Maintenir la culture dans un incubateur à 25 ° C contrôlée d&#39;humidité. Remarque: &#160; cultures Cage besoin un jour ou deux de conditionnement pour obtenir des motifs de l&#39;embryon pose cohérentes. plaques de raisin avec de la pâte de levure sont changés une fois le matin et une fois le soir au cours du conditionnement. </li><li> Préparer EPS. Solutions chaudes de tensioactifs (cocamide DEA et d&#39;alcool éthoxylé) à 37 ° C. Introduire à la pipette 18 ml de d-limonène à un flacon à scintillation en verre équipé d&#39;un petit barreau d&#39;agitation. Introduire à la pipette 1 ml de chacun des deux agents tensio-actifs (à 5% de concentration finale de chaque) à la d-limonène. Mélanger soigneusement et enlever une barre d&#39;agitation. NOTE: Cette solution mère de EPS est bon pour environ 2 mois à température ambiante. La solutiondoit être réchauffé à 37 ° C et tourbillonné pour solubiliser entièrement les tensioactifs avant l&#39;utilisation. EPS et le d-limonène doivent être stockés dans un récipient en verre où ils se dissoudront au cours du temps certains plastiques. </li><li> Préparer la solution embryon dechorionation, médiums d&#39;incubation, colorant et solutions médicamenteuses. Mélanger 25 ml d&#39;eau de Javel avec 25 ml H 2 O et le placer dans un plat peu profond. Préparer milieu modifié de base d&#39;incubation (MBIM) et MBIM-T selon la recette avant de 1,12. Préparer Shields et Sang M3 milieu de culture cellulaire et PBS selon le protocole du fabricant (voir liste matériaux). Préparer une solution stock de perméabilisation colorant à 10 mM dans le DMSO concentration. </li><li> Assembler les appareils et fournitures embryon de manutention: <ol><li> Préparer dechorionation et panier de traitement des EPS (voir la figure 1A). Coupez une section de 3 cm d&#39;un 50 ml polypropylène centrifugeuse / tube de culture jetable avec une scie à dents fines. Rendre la surface soudage chasse par le frottement de la section de tube sur du papier de verre colléà une surface de paillasse. Souder la section de tube à mailles de nylon Nitex par fusion de la jante de la section de tube à la flamme et en appuyant sur le maillage sur une plaque de verre. Laisser refroidir et couper en maille supplémentaire. REMARQUE: Les parois verticales et le fond permettent de rinçage rapide et complète de l&#39;eau de Javel et EPS résiduelle aux étapes respectives. Les étapes de soudage doivent être effectuées sous une hotte. </li><li> Préparer un panier de développement. Couper la partie supérieure d&#39;une centrifugeuse / tube de culture de 50 ml en affleurement avec le bord de la calotte. Retirer le bouchon et modifier par découpe d&#39;une ouverture centrale et des encoches le long de la jante comme sur la figure 1B. Visser le bouchon sur le maillage et sur les filets de la section de tube coupé et couper maille supplémentaire. NOTE: Le capuchon comporte des encoches dans le bord qui permet la diffusion dans le milieu en vrac lorsqu&#39;il est positionné dans le réservoir de lave de 60 mm (figure 1B). </li><li> Préparation des pièces d&#39;une chambre de lame. Coupez un carré de membrane DO qui est plus grand quela chambre ouverture de diapositives. Appliquer une fine couche de graisse à vide à l&#39;intérieur de la lèvre de l&#39;ouverture. Fixez la membrane DO dans l&#39;ouverture qu&#39;il étanchéité contre la graisse avec la bague de retenue. Coupez membrane DO excès en le coupant de retour près de l&#39;anneau de retenue. REMARQUE:. Spécifications pour la chambre de coulissement peuvent être trouvés dans Kiehart et al 13 Cette chambre n&#39;est pas disponible dans le commerce et nécessite la fabrication sur mesure par un atelier d&#39;usinage. </li></ol></li></ol> 2. Staging, dechorionation, et le traitement des embryons EPS <ol><li> Mise en scène embryons par collection chronométré. Définir une plaque raisin / levure fraîche à la volée culture cage dans l&#39;AM. Permettre embryons à poser pendant 1 heure à 25 ° C. Jeter cette plaque et la remplacer par une plaque raisin / levure fraîche pour un embryon pose ultérieure de 2 heures à 25 ° C. Recueillir cette plaque et le lieu dans 18 ° C incubateur pour de plus amples mise en scène du développement. REMARQUE: 1 heure de développement à 25 ° C est égale à 2 h du développementà 18 ° C. L&#39;effet du vieillissement à 18 ° C contre 25 ° C sur le maintien de perméabilisation EPS dans des embryons de stade tardif peut être vu sur la figure 2. </li><li> Dechorionation. Rincer délicatement les embryons hors de la plaque de raisin dans le panier de la maille à 25 ° C l&#39;eau du robinet et un pinceau. Rincer excès de levure à partir des embryons dans le panier sous un léger courant d&#39;eau du robinet. Plongez le panier dans l&#39;eau de Javel à 50% pendant 2 min. Laver soigneusement les embryons sous un courant d&#39;eau du robinet. REMARQUE: gicler doucement solution d&#39;eau de Javel sur les embryons par intermittence en utilisant une pipette en plastique. Alors que 2 minutes est généralement suffisant pour dechorionation complète, ce temps d&#39;incubation doit être vérifiée par examen direct et ajusté en conséquence. Maintenir embryons dechorionated dans le panier immergé dans l&#39;eau du robinet et de procéder immédiatement à l&#39;étape EPS. </li><li> Traitement EPS <ol><li> Préparer six plats de 60 mm avec environ 10 ml de PBS dans chaque. Préparer la dilution EPS en dissolvant 75 EPS ul dans 2,925 ml MBIM (01h40) dans un bécher de 50 ml en verre avec tourbillonnant. Note: blanc forme une émulsion du mélange. </li><li> Éponger l&#39;eau en excès à partir du fond du panier à mailles avec une lingette laboratoire. Plongez panier en EPS diluées dans le bécher et agiter de se disperser immédiatement embryons dans la solution EPS dans le fond du panier. Continuer mouvement tourbillonnant pendant 30 sec. REMARQUE: dilutions EPS et des temps d&#39;exposition peuvent être modifiées pour contrôler la perméabilité. Il est recommandé que les dilutions optimales de SPE et les temps de traitement sont établies de façon empirique avec des souches de mouches utilisés. L&#39;augmentation du temps d&#39;exposition à 60-90 sec est favorable pour l&#39;étape 12 et embryons âgés. </li><li> Retirer le panier, efface loin EPS excès avec un laboratoire essuyer. Procéder à six lavages successifs dans 10 ml de PBS dans les boîtes de 60 mm. Utiliser une pipette en matière plastique à injecter embryons doucement avec du PBS dans chacun des six lavages. Passez à teindre et les étapes de traitement de la toxicomanie. Remarque: EPS peuvent être jetés dans l&#39;évier. </li></ol></li></ol>3. Dye et traitement de la toxicomanie de perméabilisées embryons <ol><li> Traitement colorant <ol><li> Ajouter 5 ul de 10 mM CY5 colorant acide carboxylique * à 1 ml de MBIM-T (50 uM de concentration finale) dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et vortex pour mélanger. NOTE: * Choix du colorant dépend de l&#39;analyse en aval. Acide carboxylique CY5 est efficace pour des analyses ultérieures utilisant fixation et immunologique. Rhodamine B est utile pour l&#39;analyse des embryons vivants. L&#39;émission rouge de la rhodamine B, et l&#39;émission dans le vert de ses métabolites 1, peuvent présenter des complications avec des applications en aval par fluorescence. Médicament ou une toxine peuvent être ajoutés à la solution de colorant pour initier un traitement à ce stade, ou pour limiter le traitement de médicament / de la toxine à une impulsion à ce stade. Des précautions doivent être prises pour gérer et disposer de médicaments et de toxines selon la fiche signalétique et des normes de sécurité environnementale. </li><li> Transférer les embryons dans le panier grillagé de la solution de colorant à l&#39;aide d&#39;un pinceau. Boucher le tube et inverser plusieurs fois pour assurer laembryons flottent librement en suspension dans la solution de colorant. Placer le tube sur une bascule de nutation pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Retirer le tube du nutator et permettent de régler les embryons. Retirer la solution de colorant avec une pipette fine et la remplacer par 1 ml de MBIM-T à laver. Inverser le tube pour remettre en suspension les embryons complètement. Laissez embryons à s&#39;établir et à répéter avec trois lavages MBIM-T. Retirez tous les MBIM-T de rinçage final et passer à l&#39;étape d&#39;incubation. </li></ol></li><li> Incubation de l&#39;embryon développement <ol><li> Transfert d&#39;embryons à l&#39;une des deux chambres: Le panier de développement ou la chambre de coulissement. REMARQUE: Le panier de développement est préféré pour des périodes de développement plus longs, et est nécessaire si fixation et immunomarquage étapes suivantes sont à exécuter. La chambre de coulissement est optimal pour une résolution plus élevée imagerie time-lapse et est plus efficace pour de courtes périodes de développement (par exemple, les événements embryonnaires). Médicament ou une toxine peuvent être ajoutées au milieu à différentes concentrations et d embryonéveloppement peut être contrôlé en temps réel avec des embryons vivants ou à un point de terminaison à l&#39;aide de fixation standard et immunohistochimique protocoles. </li><li> Développement dans Paniers <ol><li> Nettoyer un panier de développement en injectant 70% d&#39;éthanol, rincer abondamment avec de l&#39;eau déminéralisée et sécher avec laboratoire essuyer. Préparer 6 ml de milieu d&#39;incubation à une concentration souhaitée du médicament ou une toxine. Placez le panier de développement en moyenne 60 mm prise de plat soin de ne pas de bulles d&#39;air piège sous le sommier. REMARQUE: Deux médias sont couramment utilisés: MBIM seul, ou MBIM/M3 dans un mélange 50:50, ce dernier étant plus efficace pour des périodes de développement plus longs. </li><li> Transfert d&#39;embryons perméabilisées à maille surface dans la base de panier avec un pinceau. Gicler doucement les embryons avec les médias du réservoir environnante. Disperser les embryons avec le pinceau de sorte qu&#39;ils se trouvent dans une monocouche sur le maillage. Remarque: Passez à l&#39;imagerie microscopique et évaluer les caractéristiques de perméabilisation et la viabilité de la pra séparation (voir l&#39;étape 4). </li></ol></li><li> Développement à la Chambre de diapositives <ol><li> Inverser chambre de coulissement et appliquer un petit cordon de graisse à vide sur le pourtour de l&#39;ouverture. Placez 150 pi de milieu avec la quantité désirée de médicament ou une toxine sur la surface de la membrane DO dans l&#39;ouverture. REMARQUE: Deux médias sont couramment utilisés: MBIM seul, ou MBIM/M3 dans un mélange 50:50, ce dernier étant plus efficace pour des périodes de développement plus longs. </li><li> Transfert d&#39;embryons perméabilisées à la baisse de médias avec un pinceau. Disperser les embryons rendant déposent sur la membrane dans la chute. </li><li> Appliquer soigneusement une lamelle circulaire de 25 mm sur l&#39;ouverture aplatissement ainsi le milieu. Presser doucement le long du périmètre de la lamelle couvre-objet pour former un joint avec la graisse. Remarque: Procéder à la microscopie imagerie pour évaluer les caractéristiques de perméabilisation et la viabilité de la préparation (voir l&#39;étape 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identition de perméabilisées embryons viables <ol><li> Identifier les embryons perméabilisées. Observer les embryons sous épifluorescence avec un microscope équipé d&#39;une caméra numérique. Acquérir les images (dans la longueur d&#39;onde bleue de déterminer le profil jaune autofluorescence) de plusieurs domaines à l&#39;aide de microscope fixe et réglages de l&#39;appareil. </li><li> Déterminer la perméabilisation des embryons sur la base de l&#39;intensité de fluorescence relative. Utiliser un microscope stéréoscopique avec une grande distance de travail pour accueillir le panier et pour permettre les manipulations des embryons. Le microscope doit être équipé d&#39;une platine XYZ programmable, un éclairage à épifluorescence et d&#39;une caméra numérique. L&#39;image des embryons en prenant soin d&#39;enregistrer l&#39;exposition et les paramètres de position de scène de chaque image de l&#39;embryon pour permettre la réévaluation des mêmes embryons à un moment ultérieur (voir résultat représentatif de la figure 3). Remarque: Les schémas de la montée du colorant peut varier en fonction du colorant utilisé, la durée de l&#39;exposition et de l&#39;âge de l&#39;embryon. Une large gammede l&#39;absorption de colorant à travers une seule préparation est typique et reflète la variation du degré de perméabilisation. </li><li> Identifier les embryons viables. Après la position d&#39;embryons perméabilisées marquage, continuer avec le développement de l&#39;embryon à la température ambiante ou 25 ° C. Panier ou chambre de coulissement Retour à microscope. Observer en fluorescence du canal de bleu et d&#39;acquérir l&#39;image de jaune autofluorescence dans les embryons perméabilisées précédemment identifiés. Évaluer la viabilité selon la progression normale de la distribution de jaune (voir Rand et al. 1 et résultat représentatif de la figure 3). Remarque: D&#39;autres caractéristiques morphologiques de l&#39;embryon observé en microscopie en fond clair peuvent être utilisées pour évaluer la viabilité. Il est recommandé d&#39;établir le niveau de perméabilité qui est compatible avec la viabilité être déterminée de manière empirique avec chaque colorant et de la souche de mouche utilisée. </li><li> Évaluer les effets de la drogue ou à toxines dans les embryons viables perméabilisées. </li><li> Embryons procéduressed avec le protocole ci-dessus sont prêts pour un certain nombre de classiques analyses découlant à la drogue ou l&#39;exposition aux toxines. Plusieurs des différents types d&#39;analyses sont pris en compte dans la discussion ci-dessous et comprennent l&#39;observation directe de la morphogenèse des embryons vivants ainsi que des analyses post-fixation immunologique. Ces deux approches sont renforcées par l&#39;utilisation de colorants vitaux (par exemple, GFP) qui révèlent des profils d&#39;expression de gènes et la lignée cellulaire et les profils de morphologie. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Le procédé ci-dessus décrit un moyen d&#39;obtenir des embryons de drosophile viables qui sont accessibles aux petits soins de molécules dans un large éventail de développement. Cette méthode présente le roman et simple constatation que le vieillissement des embryons à 18 ° C permet la perméabilisation des embryons à un stade avancé avec la même efficacité que vu précédemment que dans les embryons à un stade précoce. En outre, l&#39;utilisation de la CY5 colorant rouge lointain acide carboxyl...

L&#39;embryon de drosophile continue d&#39;être un modèle de choix pour l&#39;étude des mécanismes fondamentaux du développement 2. Ce modèle puissant est supporté par un large éventail d&#39;outils génétiques moléculaires qui permettent des manipulations de quasiment n&#39;importe quel gène à n&#39;importe quel point dans le temps et dans le développement de n&#39;importe quel organe. La petite taille, le développement rapide et une caractérisation de la morphogenèse de l&#39;embryon de drosophile en font un modèle de choix pour les écrans génétiques, dont beaucoup ont découvert voies fondamentales de développement 3,4. De nombreux phénotypes dans l&#39;embryon de drosophile ont été caractérisés et sont facilement interprétables, offrant souvent un moyen d&#39;identifier les mécanismes génétiques moléculaires sous-jacents responsables d&#39;un trait anormal. Par le passé, un inconvénient du modèle d&#39;embryon de mouche a été la difficulté d&#39;introduire de petites molécules à des tissus embryonnaires. Cet obstacle a posé des limites à: 1) nousment connus petites molécules bioactives comme sondes d&#39;interroger les mécanismes de développement et 2) l&#39;utilisation de ce modèle mis en place pour évaluer l&#39;activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés. En conséquence, le potentiel de dépistage de l&#39;embryon de mouche a été sous-utilisé dans la caractérisation de l&#39;activité de petites molécules. Livraison de petites molécules à l&#39;embryon à la mouche peut être réalisé selon deux méthodes: 1) perméabilisation de la coquille d&#39;oeuf et 2) la micro-injection. Cet article présente les progrès de la méthode de perméabilisation qui sont faciles à exécuter dans le cadre d&#39;un laboratoire de Drosophila classique. Il convient de noter que les progrès récents dans les méthodes de micro-injection avec la technologie microfluidique contribue également à des méthodes d&#39;introduction de composés de 5,6 sur l&#39;embryon. Introduire des molécules de l&#39;embryon est empêché par une couche de cire de la coquille 7. La coquille drosophile se compose de cinq couches. À partir del&#39;intérieur vers l&#39;extérieur, ils sont: la membrane vitelline, la couche de cire, la couche intérieure chorionique, la endochorion et la exochorion 8. Les trois couches choriales extérieures peuvent être éliminées par une brève émersion de l&#39;embryon dans la javel, une étape appelée dechorionation. La couche cireuse exposé peut ensuite être compromise par l&#39;exposition à des solvants organiques, tels que l&#39;heptane et l&#39;octane 7,9, ce qui rend l&#39;embryon dechorionated perméable, alors qu&#39;il reste enfermé dans la membrane vitelline sous-jacent. Cependant, l&#39;utilisation de ces solvants introduit des complications en raison de leur toxicité et de la difficulté à réglementer leur action de perméabilisation forte, qui ont tous deux des effets négatifs sur la viabilité des embryons Stark 9,10. Une méthode de perméabilisation utilisant une composition appelé embryon perméabilisation solvant (EPS) a été décrit précédemment 1. Ce solvant est constitué de d-limonène et les tensioactifs d&#39;origine végétale qui permettent au solvant d&#39;être miscible avec des tampons aqueux. La faible toxicité du d-limonène et de la capacité de diluer le solvant à des concentrations désirées a donné une méthode efficace pour générer des embryons perméables avec une viabilité élevée. Cependant, deux facteurs endogènes ont continué à apporter des limitations à l&#39;application. Tout d&#39;abord, les embryons montrent l&#39;hétérogénéité de la perméabilité après le traitement EPS, même lorsque l&#39;on prend soin de maintenir la mise en scène de développement à proximité. Deuxièmement, des embryons âgés de plus de huit heures environ se sont avérés difficiles à perméabiliser, conformément à un durcissement de la coquille qui se produit après la ponte 11. Décrit ici sont les progrès de la méthode EPS que: 1) aider à identifier et analyser les embryons quasi-identique perméabilisées, même après fixation et immunomarquage étapes ont été exécutées et 2) permettre la perméabilisation des embryons à la fin des points de temps de développement (&gt; 8 h, stade 12 ans et plus). Plus précisément, l&#39;application d&#39;un colorant rouge lointain,CY5 acide carboxylique, est décrite qui sert d&#39;indicateur de la perméabilité, qui persiste dans l&#39;embryon au cours du développement et de formaldéhyde, après fixation. En outre, il est démontré que l&#39;élevage des embryons à 18 ° C maintient la coquille dans un état sensible EPS, permettant perméabilisation des embryons à un stade avancé (stades 12-16). Ces progrès surmonter les limitations mentionnées ci-dessus à la méthodologie des EPS. Cette application va donc fournir aux enquêteurs un moyen d&#39;introduire de petites molécules d&#39;intérêt à l&#39;embryon à des moments distincts de développement tout en maintenant la viabilité.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

L&#39;embryon de drosophile a longtemps été un modèle de laboratoire puissant pour élucider les mécanismes moléculaires et génétiques qui contrôlent le développement. La facilité de manipulations génétiques avec ce modèle a supplanté les approches pharmacologiques qui sont monnaie courante dans d&#39;autres modèles animaux et les tests cellulaires. Nous décrivons ici des progrès récents dans un protocole qui permet l&#39;application de petites molécules à la mouche des fruits en développement embryonnaire. La méthode détails des mesures pour surmonter l&#39;imperméabilité de la coquille tout en maintenant la viabilité des embryons. Coquille d&#39;oeuf perméabilisation dans un large éventail de stades de développement est réalisée par application d&#39;un embryon précédemment décrit d-limonène solvant perméabilisation (EPS 1) et par le vieillissement des embryons à température réduite (18 ° C) avant les traitements. En outre, on utilise un colorant rouge lointain (CY5) en tant qu&#39;indicateur de perméabilisation est décrite, ce qui est compatible avec des applications en aval impliquant grippe rouge et vert standardcolorants orescent dans des préparations en direct et fixes. Ce protocole est applicable à des études utilisant des composés bioactifs pour sonder les mécanismes de développement ainsi que pour des études visant à évaluer l&#39;activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés.

dispositifs de manipulation de l&#39;embryon sont illustrés à la figure 1 pour aider à visualiser les dispositifs de &quot;home-made&quot; pour la manipulation dans les protocoles ci-dessus. Résultats observés dans la figure 2 illustrent l&#39;effet robuste de l&#39;élevage des embryons à 18 ° C sur leur capacité à être perméabilisées par EPS à des stades tardifs de développement. Cette condition est appliquée dans l&#39;étape de protocole 2.1. L&#39;efficacité de la t...

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Introduction de petites molécules à l&#39;embryon de drosophile en développement offre un grand potentiel pour la caractérisation de l&#39;activité biologique des nouveaux composés, des médicaments et des toxines ainsi que pour sonder les voies fondamentales de développement. Procédés décrits ici donnent un aperçu des mesures qui surmontent les barrières naturelles de cette approche, l&#39;expansion de l&#39;utilité du modèle de l&#39;embryon de drosophile.

Une méthode de perméabilisation de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons pour dosages de petites molécules activité

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K vues.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Introduction de petites molécules à l'embryon de drosophile en développement offre un grand potentiel pour la caractérisation de l'activité biologique des nouveaux composés, des médicaments et des toxines ainsi que pour sonder les voies fondamentales de développement. Procédés décrits ici donnent un aperçu des mesures qui surmontent les barrières naturelles de cette approche, l'expansion de l'utilité du modèle de l'embryon ...

Vidéo: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Recherche

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Les dosages des Saisies en Neurocircuit Mutants épilepsie du Drosophile</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagerie verticale de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Les petits extraits nucléaires pour les dosages fonctionnels de l&#39;expression génétique Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Une méthode de perméabilisation de

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Préparation des cultures de neurones d'embryons de drosophile Midgastrula scène

Méthode pour la culture d'embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

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