This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. הכנת תרבויות טוס, פתרונות, ומכשירי טיפול בעובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות כלוב של דרוזופילה. הנח 500 זבובים + הזדווגות של הזן הרצוי במצוידים בצלחת ענבים אגר 10 סנטימטר ומקום של שמרים להדביק כלוב אוכלוסייה. לשמור על התרבות בחממה מבוקרת C לחות 25 °. הערה: &#160; תרבויות כלוב דורשות יום או ימים של אוויר, כדי לרכוש דפוסי עובר הנחת עקביים. צלחות ענבים עם שמרים להדביק משתנות פעם בבוקר ופעם בערב באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן EPS. פתרונות חמים של חומרים פעילי שטח (DEA cocamide ואלכוהול Ethoxylated) ב 37 ° C. פיפטה 18 מיליליטר של d-limonene לבקבוקון נצנץ זכוכית מצויד בבר ומערבב קטן. פיפטה 1 מיליליטר כל אחד משני החומרים פעילי השטח (5% הריכוז סופי של כל אחד) לd-limonene. מערבבים היטב ולהסיר בר ומערבב. הערה: פתרון מניות זה של רווח למניה הוא טוב לכ 2 חודשים בטמפרטורת חדר. הפתרוןיש לחמם על 37 מעלות צלזיוס והסתחרר לsolubilize מלוא שטח לפני השימוש. EPS ו-D-limonene צריך להיות מאוחסן במכל זכוכית כפי שהם יהיו לפזר כמה פלסטיקים לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון dechorionation העובר, מדיומים דגירה, צבע ופתרונות בסמים. מערבבים 25 מיליליטר של אקונומיקה עם 25 מיליליטר H 2 O ומקום בצלחת רדודה. להכין מדיום שונה בסיסי דגירה (MBIM) וMBIM-T על פי מתכון שלפני 1,12. הכן ילדס וסאנג בינוני M3 תא התרבות וPBS על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה חומרי רשימה). הכן פתרון מניות של צבע permeabilization ב10 מ&quot;מ ריכוז בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מכשירי עובר טיפול ובאספקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן dechorionation וסל טיפולי EPS (ראה איור 1 א). חותכים את סעיף 3 סנטימטר של צנטריפוגות תרבות צינור חד פעמי 50 מיליליטר פוליפרופילן / עם מסור עדין שיניים. הפוך את סומק ריתוך משטח על ידי שפשוף קטע הצינור על נייר זכוכית דבקלמשטח המעבדתיים. ולד קטע הצינור לרשת ניילון Nitex ידי התכת שולי סעיף הצינור על אש ולחיצה על לרשת על צלחת זכוכית. בואו מגניב ולקצץ את רשת נוספת. הערה: הצדדים ותחתונים העצום לאפשר לשטיפה מהירה ומלאה משל אקונומיקה והרווח למניה שיורית בצעדים המתאימים. צריכה להתבצע פעולות הריתוך מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סל פיתוח. חותכים את החלק העליון של צנטריפוגות / תרבות צינור 50 מיליליטר מיושר עם שולי הכובע. להסיר ולשנות את הכובע על ידי חיתוך פתיחה מרכזית וחריצים לאורך השפה כפי שמוצג באיור 1. הברג את הכובע על הרשת ועל האשכולות של סעיף הצינור מנותק ולקצץ רשת נוספת. הערה: הכובע מכיל חריצים בשפה המאפשרות דיפוזיה למדיום בתפזורת כשהוא מוצב בצלחת המאגר 60 מ&quot;מ (איור 1 ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מרכיבי תא שקופיות. לחתוך רבוע של קרום לעשות את זה הוא גדול יותר מאשרקאמרי פתיחת השקופית. למרוח שכבה דקה מאוד של שומן ואקום לשפה הפנימית של הפתח. להדביק את קרום DO לתוך הפתח איטומו נגד הגריז עם הטבעת המייצבת. לקצץ קרום DO עודף על ידי קיצוץ אותו קרוב לטבעת המייצבת. הערה:. ניתן למצוא מפרט לקאמרי השקופית בKiehart et 13 אל חדר זה ​​אינו זמין באופן מסחרי ודורש ייצור מותאם אישית על ידי חנות מכונה. </li></ol></li></ol> 2. Staging, dechorionation, והרוויחו למניה טיפול בעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Staging עוברים על ידי אוסף מתוזמן. הגדר ענבים / שמרים טרי צלחת לכלוב התרבות לטוס בבוקר. אפשר לעוברים להיות מונחים לשעה 1 ב25 ° C. בטל צלחת זו ולהחליף עם ענבים / שמרים טרי לצלחת הנחת עובר הבאה של שעה 2 ב 25 ° C. לאסוף צלחת זו ומקום ב18 חממת מעלות צלזיוס למשך בימוי התפתחותיים נוסף. הערה: 1 שעות של פיתוח ב ° C25 שווה לשעה 2 בפיתוחב18 ° C. ההשפעה של הזדקנות על 18 מעלות צלזיוס לעומת 25 ° C ב שמירת permeabilization EPS בעוברים בשלב מאוחר ניתן לראות באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionation. לשטוף בעדינות עוברים מצלחת ענבים לתוך סל רשת באמצעות 25 מים מעלות צלזיוס ברז ומכחול. יש לשטוף את השמרים עודפים מהעוברים בסל מתחת לזרם עדין של מים ברז. לטבול את הסל באקונומיקת 50% למשך 2 דקות. שטוף ביסודיות עובר תחת זרם של מים ברז. הערה: בעדינות להשפריץ פתרון אקונומיקה על העוברים לסירוגין באמצעות פיפטה פלסטיק. בעוד 2 דקות בדרך כלל מספיק עבור dechorionation מלא, זמן דגירה זה צריך להיבדק על ידי בדיקה ישירה ובהתאם. לשמור עובר Dechorionated בסל השקוע במים ברז ולפנות מייד לצעד EPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EPS טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שש מנות 60 מ&quot;מ עם כ 10 מיליליטר של PBS בכל אחד. הכן את הדילול הרווח למניה על ידי המסת 75 EPS μl ב2.925 מיליליטר MBIM (1:40) בכוס זכוכית מיליליטר 50 עם מתערבל. הערה: צורות תחליב לבנים מתערובת זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מים עודפים מתחתית סל הרשת עם מעבדה לנגב. לטבול את הסל ברווח למניה מדוללת בכוס ומייד מערבולת כדי לפזר עוברים בפתרון EPS בחלק התחתון של הסל. המשך מתערבל בקשה ל30 שניות. הערה: יכולים להיות מגוונים דילולים EPS וזמני חשיפה לשלוט חדירות. מומלץ כי דילולים EPS האופטימלי וזמני טיפול שיוקמו באופן אמפירי עם הזנים של זבובים בשימוש. הגדלת זמן חשיפה ל60-90 שניות היא חיובית לבמה 12 ועוברים מבוגרים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סל, למחוק משם EPS העודף עם מעבדה לנגב. להמשיך עם שש שטיפות רציפים ב10 מיליליטר של PBS במנות 60 מ&quot;מ. השתמש פיפטה פלסטיק להשפריץ בעדינות עוברים עם PBS בכל אחד מששת שוטף. המשך לצבוע וצעדים לטיפול בסמים. הערה: יכולה להיות מסולקת למניה של את הכיור. </li></ol></li></ol>3. דיי והתרופות טיפול בעוברי permeabilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיי טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10 מ&quot;מ Cy5 * צבע חומצה קרבוקסילית ל1 מיליליטר של MBIM-T (50 מיקרומטר ריכוז סופי) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. הערה: * בחירה של צבע תלוי בניתוח במורד הזרם. חומצה קרבוקסילית Cy5 היא יעילה לניתוחים שלאחר מכן באמצעות קיבוע וimmunostaining. Rhodamine B הוא שימושי עבור ניתוח של עוברי חיים. הפליטה האדומה של Rhodamine B, והפליטה הירוקה של מטבוליטים שלה 1, יכולים להציג כמה סיבוכים עם יישומים במורד הזרם באמצעות הקרינה. תרופה או רעלן ניתן להוסיף לפתרון הצבע להתחיל בטיפול בשלב זה, או להגביל את הטיפול תרופתי / רעל לדופק בשלב זה. יש להקפיד לטפל ולהיפטר מתרופות ורעלים על פי MSDS ותקני בטיחות סביבתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים מסל הרשת לפתרון לצבוע באמצעות מכחול. שווי הצינור ולהפוך שוב ושוב על מנת להבטיח אתעוברים לצוף בחופשיות בתרחיף בתמיסת הצבע. הנח צינור על כיסא נדנדה nutating 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מnutator ולתת עובר להתיישב. הסר את פתרון צבע עם טפטפת קנס ולהחליף עם 1 מיליליטר של MBIM-T כדי לשטוף. הפוך לצינור מחדש להשעות עוברים לחלוטין. בואו עוברים להתיישב וחזור עם עוד שלוש שטיפות MBIM-T. הסר את כל MBIM-T משטיפה סופית ולהמשיך לשלב דגירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של התפתחות עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עובר לאחד משני תאים: סל הפיתוח או קאמרי שקופיות. הערה: סל הפיתוח עדיף לתקופות ארוכות יותר התפתחותית, והיא נדרשת לצעדי קיבעון וimmunostaining הבאים הם להיות מוצא להורג. קאמרי השקופיות הוא אופטימלי עבור הזמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, והוא יעיל ביותר לתקופות קצרות התפתחותית (למשל, האירועים העובריים המוקדמים). תרופה או רעלן ניתן להוסיף לבינונית בריכוזים שונים וד העוברevelopment ניתן לנטר בזמן אמת עם עוברים בשידור חי או בנקודתי קצה באמצעות קיבוע סטנדרטי וimmunostaining פרוטוקולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח בסלסלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את סל פיתוח על ידי התזה עם 70% אתנול, לשטוף היטב במים דה מיונן וכתם יבש עם מעבדה לנגב. הכן 6 מיליליטר של מדיום דגירה עם ריכוז רצוי של תרופה או רעלן. הנח את סל הפיתוח במדיום בטיפול נטילת מנה 60 מ&quot;מ לא לבועות אוויר מלכודת מתחת לבסיס הרשת. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי permeabilized לרשת פני השטח בבסיס של סל עם מכחול. בעדינות להשפריץ את העוברים עם תקשורת מהמאגר שמסביב. לפזר את העוברים עם המכחול, כך שהם בשכבה על הרשת. הערה: המשך להדמיה מיקרוסקופית ולהעריך את מאפייני permeabilization ויכולת קיום של יחסי הציבורeparation (ראה שלב 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח בלשכת השקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא שקופיות ולהחיל חרוז קטן של שומן ואקום על המערכת של הפתיחה. הנח 150 μl של מדיום עם כמות רצויה של תרופה או רעלן על פני השטח של קרום לעשות בתוך הפתח. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי permeabilized לירידה של תקשורת עם מכחול. לפזר את העוברים שהופך אותם להתיישב על הקרום בירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחיל coverslip מעגלי 25 מ&quot;מ מעל הפתח ובכך משטח את המדיום. לחץ כלפי מטה בעדינות לאורך ההיקף של coverslip כדי ליצור חותם עם הגריז. הערה: המשך כדי מיקרוסקופיה הדמיה כדי להעריך את מאפייני permeabilization וכדאיות של ההכנה (ראה שלב 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identification של עוברי קיימא permeabilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברי permeabilized. שים לב עוברים תחת epifluorescence עם מיקרוסקופ מצויד במצלמה דיגיטלית. לרכוש תמונות (באורך הגל הכחול כדי לקבוע את autofluorescence חלמון הפרופיל) של מספר שדות באמצעות מיקרוסקופ קבוע והגדרות מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע permeabilization של עוברים המבוססים על עוצמת הקרינה היחסית. השתמש בסטראו עם מרחק עבודה גדול כדי להכיל את הסל ולאפשר למניפולציות של העוברים. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בשלב תכנות XYZ, תאורת epifluorescence ומצלמה דיגיטלית. תמונת העוברים דואגים להקליט חשיפה ופרמטרי עמדת במה של כל תמונת עובר כדי לאפשר הערכה מחדש של אותו עובר בנקודת זמן מאוחרת יותר (ראו תוצאת נציג באיור 3). הערה: דפוסי ספיגת צבע ישתנו בהתאם לצבען המשמש, משך חשיפה וגיל עובר. מגוון רחבשל ספיגת צבע על פני הכנה אחת אופיינית ומשקפת את השונות במידת permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברים ובת קיימא. לאחר סימון מיקום של עוברי permeabilized, להמשיך בפיתוח עובר בטמפרטורת חדר או 25 ° C. חזור סל או תא שקופיות למיקרוסקופ. שים לב תחת הקרינה ערוץ כחולה ולרכוש תמונה של autofluorescence חלמון בזוהו בעבר עוברי permeabilized. להעריך את הכדאיות לפי התקדמות רגילה של הפצת חלמון (ראה ראנד et al. 1 ותוצאת נציג באיור 3). הערה: תכונות מורפולוגיות אחרות של העובר נצפה עם מיקרוסקופ brightfield ניתן להשתמש כדי להעריך את הכדאיות. מומלץ כי קביעת הרמה של חדירות התואמת את הכדאיות להיקבע באופן אמפירי עם כל צבע ומתח של זבוב בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את השפעות תרופה או רעלן בעוברי קיימא permeabilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי processed עם הפרוטוקול הנ&quot;ל עומדים על מספר הניתוחים הקונבנציונלי לאחר סמים או חשיפת רעלן. כמה סוגים השונים של ניתוחים נחשבים בדיון שלהלן וכוללים תצפית ישירה של המורפוגנזה בעוברת לחיות כמו גם immunostaining הודעה הקיבעון-מנתח. שתי גישות אלה משופרים על ידי שימוש בצבעים חיוניים (למשל, ה-GFP) החושפים דפוסי ביטוי גנים ושושלת תא ופרופילי מורפולוגיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li><li>Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+blastoderm+patterning.">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li><li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis.">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li><li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation.">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li><li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens.">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li><li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection.">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li><li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos.">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li><li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes.">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li><li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique.">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li><li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microscopic+methods+for+the+analysis+of+cellular+movements+in+Drosophila+embryos.">High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos.</a> Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).</li><li>Patel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology.">Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster.">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li><li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+eggs.">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li><li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה הנ&quot;ל מתארת ​​אמצעי להשגת עוברי דרוזופילה קיימא, כי הם נגישים לטיפולי מולקולה קטנים על פני מגוון רחב התפתחותית. שיטה זו מציגה את הרומן וממצא פשוט שהזדקנות עוברים על 18 מעלות צלזיוס מאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר באותה היעילות כפי שניתן לראות בעבר רק...

עובר דרוזופילה ממשיך להיות מודל המוביל לחקירה של מנגנונים בסיסיים של פיתוח 2. מודל רב עוצמה זו נתמך על ידי מערך רחב של כלים גנטיים מולקולריים המאפשרים מניפולציות של מהות כל גן בכל נקודת זמן ובמסגרת כל איבר מתפתח. הגודל הקטן, התפתחות מהירה, ואפיון המקיף של המורפוגנזה של עובר דרוזופילה להפוך אותו למודל של בחירה עבור מסכי גנטיים, שרבים מהם נחשפו מסלולים התפתחותיים בסיסיים 3,4. פנוטיפים רבים בעובר דרוזופילה אופיינו ולפרש בקלות, לעתים קרובות מתן אמצעים לזיהוי מנגנונים גנטיים מולקולריים שבבסיס אחראי לתכונה חריגה. מבחינה היסטורית, חסרון של מודל עובר הזבוב היה הקושי בהחדרת מולקולות קטנות לרקמות עובריים. מכשול זה מציב מגבלות על: 1)ing מולקולות קטנות ביו ידועות כמו בדיקות לחקור את מנגנוני התפתחות ו2) שימוש במודל שהוקם זה כדי להעריך פעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized. כתוצאה מכך, פוטנציאל ההקרנה של עובר הזבוב כבר לא מנוצל באפיון של פעילות מולקולה קטנה. משלוח של מולקולות קטנות לעובר הזבוב יכול להיות מושגת בשתי שיטות: 1) permeabilization של קליפת הביצה ו2) microinjection. מאמר זה מציג התקדמות לשיטה של permeabilization, כי הם קלים לביצוע בהגדרה של מעבדה דרוזופילה קונבנציונלית. יצוין, כי ההתקדמות בשיטות microinjection עם טכנולוגית מיקרופלואידיקה תורמת גם היא לשיטות של החדרת תרכובות ל5,6 העובר. היכרות עם מולקולות לעובר הוא למנוע על ידי שכבת שעווה של קליפת הביצה 7. קליפת הביצה דרוזופילה מורכבת מחמש שכבות. מןמבפנים החוצה הם: קרום vitelline, שכבת השעווה, שכבת כוריוני הפנימית, endochorion וexochorion 8. שלוש שכבות כוריוני חיצוניות ניתן להסיר על ידי emersion הקצר של העובר באקונומיקה מהולה, צעד המכונה dechorionation. שכבת השעווה נחשפה אז יכולה להיות בסכנה כתוצאה מחשיפה לממסים אורגניים, כגון heptane ויוקטן 7,9, טיוח את עובר dechorionated חדיר, בזמן שהוא נשאר עטוף בקרום vitelline הבסיסי. עם זאת, שימוש בממסים אלה מציג סיבוכים בשל רעילותם ואת הקושי בויסות פעולתם החזקה permeabilizing, אשר שניהם יש השפעות שליליות מוחלטת על 9,10 כדאיות עובר. שיטה של permeabilization באמצעות permeabilization עובר הרכב כינה ממס (EPS) כבר תיארתי בעבר 1. ממס זה מורכב מחומרים פעילי שטח D-limonene וצמחי המאפשרים הממס להיות misciblE עם מאגרים מימיים. הרעילות הנמוכה של d-limonene והיכולת לדלל את הממס לריכוזים רצויים הניבה שיטה יעילה ליצירת עוברים חדירים עם כדאיות גבוהה 1. עם זאת, שני גורמים אנדוגני המשיכו להביא מגבלות ליישום. ראשית, עוברים להפגין את ההטרוגניות בחדירות לאחר טיפול EPS, גם כאשר הטיפול נלקח כדי לשמור על היערכות התפתחותיים קרובה. שנית, עוברים מבוגרים יותר משמונה שעות כ הוכיחו קשה permeabilize, עולה בקנה אחד עם התקשות של קליפת הביצה שמתרחשת לאחר הטלת הביצים 11. שתואר כאן הן התקדמות בשיטת EPS כי: 1) לסייע בזיהוי וניתוח עוברי permeabilized כמעט זהה, גם לאחר צעדי הקיבעון וimmunostaining הוצאו להורג ו2) לאפשר permeabilization של עוברים בנקודות זמן התפתחותיים מאוחרות (&gt; 8 שעות, שלב 12 ומעלה). באופן ספציפי, יישום של צבע מרחיק אדום,חומצה קרבוקסילית Cy5, מתוארת המשמשת כמחוון חדירות, שנמשך בעובר במהלך התפתחות ולאחר קיבוע פורמלדהיד. בנוסף, הוא הראה כי גידול עובר ב18 ° C שומר על קליפת הביצה במצב רגיש EPS, המאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר (שלבי 12-16). מקדמות אלה להתגבר על המגבלות שהוזכרו קודם לכן למתודולוגיה EPS. יישום זה ולכן יספק לחוקרי אמצעי להציג את המולקולות קטנות של עניין לעובר בנקודות זמן התפתחותיים שונים, תוך שמירה על כדאיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82007-202</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

עובר דרוזופילה כבר זמן רב מודל מעבדה רב עוצמה להבהרת מנגנונים מולקולריים וגנטיים המפקחים על פיתוח. הקלות של מניפולציות גנטיות עם המודל הזה החליפו גישות תרופתי כי הם דבר שבשגרה במודלים של בעלי חיים אחרים ומבחנים מבוססי תאים. כאן אנו מתארים ההתקדמות בפרוטוקול המאפשר יישום של מולקולות קטנות לעובר זבוב הפירות הפיתוח. השיטה מפרטת צעדים כדי להתגבר על האטימות של קליפת הביצה, תוך שמירה על כדאיות עובר. permeabilization קליפת הביצה על פני מגוון רחב של שלבי התפתחות מושגת על ידי יישום של permeabilization שתואר קודם לכן d-limonene עובר ממס (EPS 1) ועל ידי עוברי הזדקנות בטמפרטורה נמוכה (18 ° C) לפני טיפולים. בנוסף, שימוש בצבע מרחיק אדום (Cy5) כאינדיקטור permeabilization מתואר, אשר תואם עם יישומים במורד הזרם מעורבים שפעת אדומה וירוקה סטנדרטיתצבעי orescent בהכנות בשידור חי וקבועות. פרוטוקול זה הוא ישים למחקרים באמצעות תרכובות ביו לחקור מנגנוני התפתחות, כמו גם למחקרים שמטרתם להעריך את הפעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized.

<html> מכשירי טיפול בעובר הם בתמונה באיור 1 על מנת לסייע בלדמיין את המכשירים &quot;תוצרת הבית&quot; למניפולציה בפרוטוקולים לעיל. תוצאות ניתן לראות באיור 2 ממחישות את ההשפעה החזקה של גידול עובר ב18 מעלות צלזיוס ביכולת שלהם להיות permeabilized ידי EPS בשלבים מאוחרים ש?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity at JoVE.com

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K Views.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, ...

Video: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders such as diabetes and cardiovascular disease 1-3. An important topic of research into these associated health problems involves the role of endurance exercise as a beneficial intervention.
Exercise training is an inexpensive, non-invasive intervention with several beneficial results, including reduction in excess body fat 4, increased insulin sensitivity in skeletal muscle 5, increased anti-inflammatory and antioxidative responses 6, and improved contractile capacity in cardiomyocytes 7. Low intensity exercise is known to increase mitochondrial activity and biogenesis in humans 8 and mice, with the transcriptional coactivator PGC1-&alpha; as an important intermediate 9,10. 
Despite the importance of exercise as a tool for combating several important age-related diseases, extensive longitudinal genetic studies have been impeded by the lack of an endurance training protocol for a short-lived genetic model species. The variety of genetic tools available for use with Drosophila, together with its short lifespan and inexpensive maintenance, make it an appealing model for further study of these genetic mechanisms. With this in mind we have developed a novel apparatus, known as the Power Tower, for large scale exercise-training in Drosophila melanogaster 11. The Power Tower utilizes the flies' instinctive negative geotaxis behavior to repetitively induce rapid climbing. Each time the machine lifts, then drops, the platform of flies, the flies are induced to climb. Flies continue to respond as long as the machine is in operation or until they become too fatigued to respond. Thus, the researcher can use this machine to provide simultaneous training to large numbers of age-matched and genetically identical flies. Additionally, we describe associated assays useful to track longitudinal progress of fly cohorts during training.

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

We describe the first endurance training protocol for an important genetic model species, Drosophila melanogaster, and outline several assays to chart improvements in mobility following training.

אימון סיבולת פרוטוקול מבחני ביצועים ארוכי טווח עבור תסיסנית melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

שיטה של ​​permeabilization של

שיטה של permeabilization של