This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1。フライ文化、ソリューション、および胚取り扱い装置の調製<ol><li> ショウジョウバエのケージ文化を準備します。 10cmのぶどう寒天プレートと酵母ペーストのスポットを装備し、人口ケージに所望の歪みの500 +交配ハエを配置します。 25℃の湿度制御インキュベーターでの培養を維持する。注： &#160;ケージの文化は、一貫性の胚敷設パターンを得るためのコンディショニングの一日か二日を必要とする。酵母ペーストでブドウのプレートは、コンディショニングの間、午前中に一度、夜に一度変更されます。 </li><li> EPSを準備します。 37℃での界面活性剤（コカミドDEAおよびエトキシ化アルコール）の温かいソリューションピペット小さな攪拌棒を備えたガラス製シンチレーションバイアルにd-リモネン18mlの。ピペットd-リモネンに1ミリリットル2種の界面活性剤（各々5％の最終濃度）の各。完全に混合し、攪拌棒を取り外します。注：EPSのこのストック溶液を、室温で約2ヶ月に適しています。ソリューション37℃に加温し、完全に使用する前に界面活性剤を可溶化するために旋回されるべきである。彼らは時間をかけていくつかのプラスチックを溶解するようにEPS及びd-リモネンは、ガラス容器に保存されるべきである。 </li><li>胚dechorionation液、インキュベーション媒体、染料と薬剤溶液を調製する。浅い皿に25ミリリットルのH 2 O及び場所で漂白剤25ミリリットルを混ぜる。前のレシピ1,12に従って変更、基本的なインキュベーション培地（MBIM）とMBIM-Tを用意します。シールズを準備し、（材料のリストを参照）、製造業者のプロトコルに従って、M3細胞培養培地およびPBSを歌った。 DMSO中10 mMの濃度で透過性色素のストック溶液を準備します。 </li><li>胚ハンドリング機器および消耗品を組み立てる。 <ol><li> dechorionationとEPS治療バスケットを用意した（ 図1A参照 ）。細かい鋸歯を有する使い捨ての50mlのポリプロピレン遠心分離/培養チューブ3cmの部​​分を切り落とした。付着した紙やすりでの管部分を擦って溶接面フラッシュを作るベンチトップ面に接続します溶接炎の上筒部の縁を溶融し、ガラス板上にメッシュに押圧することによりナイテックスナイロンメッシュに管部。冷ますと余分なメッシュを切り落とす。注：全くの側面と底面は、各工程での残留漂白剤とEPSのオフを迅速かつ完全なすすぎを可能にします。 溶接工程は、ヒュームフードの下で行われるべきである。 </li><li>開発バスケットを準備します。キャップの縁と面一に50ミリリットルの遠心分離/培養管の上部を切断してください。 図1（b）に示すように、リムに沿って中央開口とノッチを切り出してキャップを外し、変更します。メッシュの上やカットオフ管部のねじ山のキャップをねじ込み、余分なメッシュをトリム。注：キャップは60ミリメートル溜めディッシュ（ 図1B &#39;）に配置されたときバルク媒体への拡散を許容リムのノッチが含まれています。 </li><li>スライドチャンバーの部品を準備します。よりも大きい、DO膜の正方形をカットスライドチャンバー開口部。開口部の内側リップに真空グリースの非常に薄い層を適用します。保持リングとグリースに対してそれをシールする開口部に、DO膜を貼り付けます。近い保持リングに戻ってそれを切断することにより、過剰なDO膜をトリミング。注：スライドチャンバーの仕様はKiehart ら 13に記載されていますこのチャンバーは、市販のものではなく、機械工場でカスタム製作を必要とします。 </li></ol></li></ol>胚の2。ステージング、Dechorionation、およびEPSの治療<ol><li>時限コレクションによって胚をステージング。午前中のハエ培養ケージに新鮮なブドウ/酵母プレートを設定します。胚は25℃で1時間置くことができるようにするこのプレートを破棄し、25℃で2時間、その後の胚の敷設のために新鮮なぶどう/酵母プレートと交換さらに発達ステージング18℃のインキュベーター内で、このプレートと場所を収集します。注：25°Cでの開発の1時間は、開発の2時間に等しく、18℃での後期胚においてEPS透過性の維持に25℃対18℃でのエージングの効果は、図2に見ることができる。 </li><li> Dechorionation。そっと25℃の水道水と絵筆を使用してメッシュバスケットにブドウのプレートから離れた胚をすすぐ。水道水の穏やかな流れの下で、バスケット内の胚から過剰酵母を洗い流す。 2分間、50％の漂白剤でバスケットを浸す。徹底的に水道水の流れの下で胚を洗浄します。注：静かに断続的にプラスチック製のピペットを用いて、胚に漂白液を噴出。 2分が完了dechorionationのため、通常は十分であるが、このインキュベーション時間は、直接検査によって確認され、それに応じて調整する必要があります。水道水に浸漬したバスケットに絨毛膜を除去した胚を維持したEPSすぐにステップに進みます。 </li><li> EPSトリートメント<ol><li>それぞれのPBS約10mlで6 60ミリメートルの料理を準備します。 2.925ミリリットルMBIに75μlのEPSを溶解させることにより、EPSの希薄化を準備する旋回した50ミリリットルのガラス製ビーカー中のM（1時40）。注意：この混合物から白色のエマルジョンフォームを。 </li><li>拭いラボでメッシュバスケットの底から余分な水分を吸い取る。ビーカー内の希薄後EPSにバスケットを浸し、すぐバスケットの底に、EPS溶液中で胚を分散させるために旋回。 30秒間の動きを旋回し続ける。 NOTE：EPS希釈し、露光時間は、透過性を制御するために変化させることができる。これは、最適のEPS希釈液と処理時間が使用されてハエの株を用いて実験的に確立されることをお勧めします。 60〜90秒の露光時間を増加させると、ステージ12歳以上の胚に有利である。 </li><li>バスケットを外し、拭いラボ過剰のE​​PSを離れてブロット。 60ミリメートル皿中10mlのPBS中の6連続洗浄を進める。静かに6回の洗浄のそれぞれにPBSで胚を噴出するようにプラスチック製のピペットを使用してください。処理工程を染色し、薬物に進みます。注： EPSは、シンク下に処分することができる。 </li></ol></li></ol>透過処理胚の3。色素と薬物治療<ol><li>染料トリートメント<ol><li> 10 mMのCY5カルボン酸色素* 1.5mlマイクロチューブと混合する渦内MBIM-T（50μM最終濃度）の1ミリリットルの5μlを加える。注：*染料の選択は、下流の分析に依存します。 CY5カルボン酸は、固定および免疫染色を用いて、その後の分析に有効である。ローダミンBは、生きている胚の解析に有用である。ローダミンBの赤色発光、およびその代謝物1の緑色発光、蛍光を使用して、ダウンストリームのアプリケーションでいくつかの合併症を提示することができます。薬物または毒素は、この段階で治療を開始するか、またはこの段階でパルスに薬物/毒素処理を制限するために、色素溶液に添加することができる。ケアは、MSDSと環境安全基準に従って処理し、薬物および毒素を処分するために注意する必要があります。 </li><li>ペイントブラシを使用した染料溶液にメッシュバスケットから胚を転送します。チューブに蓋をして確保するために何度反転胚は、色素溶液中に懸濁自由に浮遊。室温で15分間章動ロッカーにチューブを置きます。 </li><li>旋回装置からチューブを外し、胚が落ち着くしましょう​​。細かいピペットで染料溶液を除去し、洗浄するMBIM-Tの1ミリリットルと交換してください。完全に胚を再懸濁するためにチューブを反転させる。胚が落ち着くしましょう​​と、さらに3つのMBIM-T洗浄を繰り返します。最終すすぎからすべてMBIM-Tを外し、インキュベーションステップに進みます。 </li></ol></li><li>胚発生のインキュベーション<ol><li>開発バスケットやスライド室：2室の一方に胚を移す。 NOTE：現像バスケットは、より長い期間の発生に好適である、及びその後の固定および免疫染色の手順が実行される場合に必要とされる。スライドチャンバーは、高解像度タイムラプスイメージングに最適で、短い発達期間（ 例えば 、初期胚のイベント）のために最も効果的である。薬物または毒素は、種々の濃度および胚dで培地に添加することができるevelopmentライブ胚、または標準的な固定および免疫染色のプロトコルを使用してエンドポイントをリアルタイムでモニターすることができる。 </li><li>バスケットに開発<ol><li> 70％エタノールで潮吹き、開発バスケットを清掃し、脱イオン水で十分に洗い流し、ふき取りラボで乾燥したブロット。薬物または毒素の所望の濃度で培養培地の6ミリリットルを用意します。メッシュベースの下にいないトラップの気泡をように注意しながら60ミリメートル皿に培地で開発バスケットを置きます。注：二つのメディアが一般的に使用されています。50:50混合物中の一人でMBIM、またはMBIM/M3、後者は長い開発期間のためのより効果的である。 </li><li>絵筆でバスケットのベースに表面をメッシュする透過化胚を転送します。静かに周囲のリザーバーからメディアとの胚を噴出。彼らは、メッシュ上の単層になるように絵筆を持つ胚を分散させる。注： 顕微鏡画像に進み、PRの透過性と実行可能性の特性を評価eparation（ステップ4を参照）。 </li></ol></li><li>スライドチャンバー内の開発<ol><li>スライドチャンバーを反転し、開口部の周囲に真空グリースの小さなビーズを適用します。開口部内のDO膜表面に薬物または毒素所望の量の培地を150μLを配置します。注：二つのメディアが一般的に使用されています。50:50混合物中の一人でMBIM、またはMBIM/M3、後者は長い開発期間のためのより効果的である。 </li><li>絵筆とメディアの低下に透過化胚を転送します。彼らはドロップ内膜に落ち着くこと胚を分散させる。 </li><li>それによって、メディアを平らに開口部に25ミリメートルの円形のカバースリップを慎重に適用します。グリースでシールを形成するカバーガラスの周囲に沿ってゆっくりと下に押します。注： （ステップ4を参照）を準備の透過及び生存率の特性を評価するために、イメージングを顕微鏡検査に進みます。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4。Identi透過処理生存胚のfication <ol><li>透過化胚を特定します。デジタルカメラを備えた顕微鏡を用いて、エピ蛍光下で胚を観察します。固定顕微鏡とカメラの設定を使用して、いくつかのフィールドの（プロファイル卵黄自家蛍光を決定するために、青色の波長の）画像を取得する。 </li><li>相対蛍光強度に基づいて、胚の透過性を決定する。バスケットを収容し、胚の操作を可能にするために大きな作業距離を有する実体顕微鏡を使用する。顕微鏡は、プログラム可能なXYZステージ、落射蛍光照明とデジタルカメラを搭載する必要があります。画像は後の時点で同じ胚の再評価を可能にするために露出し、各胚の画像のステージの位置パラメータを記録するように注意しながら胚（ 図3に代表的な結果を参照されたい）。注： 色素取り込みのパターンが使用される染料は、露光および胚齢の長さに応じて変化するであろう。幅広い単一の製剤全体の色素取り込みの典型的​​なものであると透過性の度合いの変化を反映している。 </li><li>実行可​​能な胚を特定します。透過化胚の位置をマーキングした後、室温または25℃で、胚発生を続行顕微鏡にバスケットやスライドチャンバーを返します。青のチャンネル蛍光の下で観察し、以前に同定された透過化胚における卵黄自家蛍光の画像を取得する。卵黄分布の正常な進行に応じて生存率を評価（ランドら 1及び図3の代表的結果を参照してください）。注： 明視野顕微鏡で観察し、胚の形態学的特徴は、他の生存率を評価するために使用することができる。これは、実行可能性と互換性のある透過性のレベルを確立する各色素や使用ハエの株に実験的に決定することをお勧めします。 </li><li>透過処理の実行可能な胚における薬物または毒素の効果を評価します。 </li><li>胚proce上記のプロトコルでssed従来の数が薬物または毒素の曝露後の分析のため準備を整えている。分析の様々なタイプのいくつかは、以下の議論で考慮し、ライブ胚における形態形成の直接観察だけでなく、後固定免疫染色分析が含まれています。これらのアプローチの両方は、遺伝子発現パターンと細胞系譜および形態プロフィールを明らかにする生体色素（ 例えば 、GFP）の使用によって強化される。 </li></ol>

<ol>
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S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

上記の方法は、広い範囲に渡って発達する小分子治療にアクセス可能な実行可能なショウジョウバエの胚を得るための手段の概要を説明します。この方法は、18℃で胚を高齢化、新規で簡単な調査結果を紹介し、以前は初期胚で見られるのと同じ効力を有する後期胚の透過を可能にします。また、透過性の指標として遠赤色色素CY5カルボン酸の使用は、接尾用途において有効であるこ?...

ショウジョウバエの胚は、開発2の基本的なメカニズムの調査のための最高のモデルであり続けている。この強力なモデルは、任意の時点で、任意の開発器官内、基本的に任意の遺伝子の操作を可能にする分子遺伝学的ツールの幅広いサポートされています。 ショウジョウバエの胚の形態形成の小型化、急速な発展、および大規模な特性評価が基本的な発生経路を3,4発見されているその多くは遺伝子スクリーニングのための選択のモデルにする。 ショウジョウバエ胚の多数の表現型が特徴づけられ、容易に解釈され、多くの場合、異常な形質の責任を根本的な分子遺伝的メカニズムを識別するための手段を提供してきました。 歴史的には、フライ胚モデルの欠点は、胚組織に小分子を導入することの難しさとなっている。 1）私たち：この障害は、上の制限を提起している発達メカニズムおよび2を尋問するプローブとして、既知の生物活性小分子をING）特徴付けられていない小分子の催奇形性または薬理学的活性を評価するために、この確立されたモデルを使用して。その結果、ハエの胚のスクリーニング電位は、小分子活性の特徴付けに十分に活用されている。 1）卵殻の透過処理および2）マイクロインジェクション：ハエ胚への小分子の送達は、2の方法で達成することができる。この記事では、従来のショウジョウバエの実験室の設定で実行しやすい透過処理する方法にも進歩を提示します。これは、マイクロフルイディクス技術とマイクロインジェクション法の最近の進歩にも胚5,6に化合物を導入する方法に貢献していることに留意すべきである。胚への分子の導入は卵殻7のワックス状の層によって防止される。 ショウジョウバエ卵殻は5層からなる。からインサイドアウト、彼らは以下のとおりです。卵黄膜、ろう状層、内側の絨毛層、endochorionとexochorion 8。 3個の外絨毛膜層を希漂白剤、dechorionationと呼ぶ工程における胚の簡単な出現によって除去することができる。それは、基礎となる卵黄膜に包まれたままで露出蝋質層は、透過性の絨毛膜を除去し、胚をレンダリングする、例えばヘプタン、オクタン7,9などの有機溶媒への暴露によって損なわれ得る。しかしながら、これらの溶媒の使用は、胚の生存率9,10に厳しい負の効果を有し、どちらもそれらの毒性、それらの強力な浸透化作用を調節する上での困難に起因する合併症を導入する。 溶媒組成物と呼ばれる胚の透過化（EPS）を用いて透過化する方法は、以前に1に記載されている。この溶剤はmisciblする溶媒を有効にd-リモネンおよび植物由来の界面活性剤で構成されています水性緩衝液を使用して電子。 d-リモネンおよび所望の濃度に溶剤を希釈する能力の低毒性は高い生存1と透過性の胚を生成するための効果的な方法が得られている。しかし、2内因性の要因が、アプリケーションに制限を持って続けてきました。まず、胚は注意が近い発達ステージングを維持するために取られた場合でも、EPS処理後の透過性の不均一性を実証する。第二に、約8時間以上経過した胚は、卵が11を敷設した後に発生する卵殻の硬化と一致して、透過性にすることは困難であることが判明している。 ここで説明したEPS法の進歩は、1）固定と免疫染色の手順が実行され、2）&gt;（遅発育の時点で8時間、ステージの胚の透過を可能にされた後でも、ほぼ同じように透過化胚を特定し、分析するのに役立つ12歳以上）。具体的には、遠赤色色素の適用、CY5カルボン酸は、開発中およびホルムアルデヒド固定後胚における持続透過性インジケータとして機能することが記載されている。加えて、18℃で胚を飼育すると、後期段階の胚（ステージ12〜16）の透過を可能にする、EPS敏感な状態で卵殻を維持することが示されている。 これらの進歩は、EPS方法論に前述の制限を克服する。このアプリケーションは、従って、生存率を維持しながら、異なる発達時点で胚にとって関心のある小分子を導入するための手段を研究者に提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly Cage</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td style="width:119px;">59-101</td>
			<td style="width:204px;">http://flystuff.com/general.php</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Stepan Chemical</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.stepan.com/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">d-limonene (Ultra high purity grade)</td>
			<td style="width:201px;">Florida Chemical Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">call for special order</td>
			<td>http://www.floridachemical.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>SS290-4</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td>http://www.fishersci.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS powder</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>56064C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>R6626</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CY5 carboxylic acid</td>
			<td style="width:201px;">Lumiprobe</td>
			<td>#23090</td>
			<td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>472310-100</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shields and Sang M3 medium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitex Nylon mesh&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>57-102</td>
			<td>http://flystuff.com/misc.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissolved oxygen (DO) membrane&#160;</td>
			<td style="width:201px;">YSI</td>
			<td>#5793</td>
			<td>http://www.ysireagents.com/search.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25mm circular no.1 cover slip&#160;</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48380-080</td>
			<td style="width:204px;">https://us.vwr.com/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grape-agar plate mix&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Flystuff.com</td>
			<td>47-102</td>
			<td>http://flystuff.com/media.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nutator</td>
			<td style="width:201px;">VWR</td>
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		</tr>
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a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

ショウジョウバエの胚は長い開発を制御する分子および遺伝的メカニズムを解明するための強力な実験室モデルとなっている。このモデルを使って遺伝子操作のしやすさは、他の動物モデルおよび細胞ベースのアッセイでは一般的である薬理学的アプローチを取っています。ここでは、開発ショウジョウバエ胚への小分子の適用を可能にするプロトコルの最近の進歩について説明します。この方法は、胚の生存率を維持しながら、卵殻の不透過性を克服するための手順を詳しく説明します。発達段階の幅広い卵殻の透過性は、溶媒、前述のd-リモネン胚透過化（1 EPS）を適用することによって、（18℃）の前治療に低温で加齢の胚によって達成される。また、透過性指標として遠赤色色素（CY5）の使用は、標準的な赤と緑のインフルエンザを含む下流のアプリケーションとの互換性がある、記載されているライブや固定製剤におけるorescent染料。このプロトコルは、特徴づけられていない小分子の催奇形性や薬理活性を評価することを目的とした研究のための発達のメカニズムを探るだけでなく、生物活性化合物を用いた研究にも適用可能である。

胚の取扱い装置は、上記のプロトコルでの操作のための「自家製」デバイスを視覚化を支援するために、図1に描かれている。 図2に見られる結果は、開発の後期段階でEPSによって透過する能力に18℃で胚を飼育の強い効果を示す。この条件は、プロトコールステップ2.1で適用される。典型的には、EPS処理した胚において見られる浸透性の様々なレベルを明らかにする?...

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

ショウジョウバエ胚への小分子の導入は、新規化合物、薬物、および毒素の生物学的活性を特徴づけるだけでなく、根本的な発生経路を探査するための大きな可能性を提供しています。本明細書に記載される方法は、 ショウジョウバエ胚モデルの有用性を拡大し、このアプローチには自然な障壁を克服する手順の概要を説明します。

の透過方法<em&gt;ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための&gt;胚

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K ビュー.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  ショウジョウバエ胚への小分子の導入は、新規化合物、薬物、および毒素の生物学的活性を特徴づけるだけでなく、根本的な発生経路を探査するための大きな可能性を提供しています。本明細書に記載される方法は、 ショウジョウバエ胚モデルの有用性を拡大し、このアプローチには自然な障壁を克服する手順の概要を説明します。 

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

のてんかんの変異体における発作のためのアッセイをNeurocircuitショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders such as diabetes and cardiovascular disease 1-3. An important topic of research into these associated health problems involves the role of endurance exercise as a beneficial intervention.
Exercise training is an inexpensive, non-invasive intervention with several beneficial results, including reduction in excess body fat 4, increased insulin sensitivity in skeletal muscle 5, increased anti-inflammatory and antioxidative responses 6, and improved contractile capacity in cardiomyocytes 7. Low intensity exercise is known to increase mitochondrial activity and biogenesis in humans 8 and mice, with the transcriptional coactivator PGC1-&alpha; as an important intermediate 9,10. 
Despite the importance of exercise as a tool for combating several important age-related diseases, extensive longitudinal genetic studies have been impeded by the lack of an endurance training protocol for a short-lived genetic model species. The variety of genetic tools available for use with Drosophila, together with its short lifespan and inexpensive maintenance, make it an appealing model for further study of these genetic mechanisms. With this in mind we have developed a novel apparatus, known as the Power Tower, for large scale exercise-training in Drosophila melanogaster 11. The Power Tower utilizes the flies' instinctive negative geotaxis behavior to repetitively induce rapid climbing. Each time the machine lifts, then drops, the platform of flies, the flies are induced to climb. Flies continue to respond as long as the machine is in operation or until they become too fatigued to respond. Thus, the researcher can use this machine to provide simultaneous training to large numbers of age-matched and genetically identical flies. Additionally, we describe associated assays useful to track longitudinal progress of fly cohorts during training.

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

We describe the first endurance training protocol for an important genetic model species, Drosophila melanogaster, and outline several assays to chart improvements in mobility following training.

キイロショウジョウバエのための持久力トレーニングのプロトコルと縦パフォーマンスアッセイ

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...