This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. Vorbereitung von Fly Kulturen, Lösungen und Embryo Handhabung Devices <ol><li> Bereiten Sie einen Käfig Kultur von Drosophila. Zeigen 500 + Paarung fliegt von den gewünschten Stamm in einer Population Käfig mit einem 10 cm Trauben-Agar-Platte und einen Ort der Hefe-Paste ausgestattet. Pflegen Kultur in einem 25 ° C Luftfeuchtigkeit gesteuert Inkubator. Hinweis: &#160; Cage Kulturen erfordern ein oder zwei Tage, um konsistente Anlage Embryo Verlegemuster zu erhalten. Grape Platten mit Hefe-Paste werden, einmal morgens und einmal abends während Anlage geändert. </li><li> Bereiten EPS. Warmen Lösungen von Tensiden (Cocamide DEA und ethoxylierter Alkohol) bei 37 ° C. Pipette 18 ml d-Limonen mit einem Szintillations-Glasampulle, die mit einem kleinen Rührstab ausgestattet. Pipette jeder der beiden Tenside (5% Endkonzentration jedes) 1 ml zu der d-Limonen. Gründlich mischen und entfernen Rührstab. HINWEIS: Diese Stammlösung von EPS ist gut für ca. 2 Monate bei Raumtemperatur. Die Lösungsollte bei 37 ° C erwärmt und geschüttelt, um vollständig zu solubilisieren Tenside vor Gebrauch. EPS-und d-Limonen ist in einem Glasbehälter aufbewahrt, da sie einige Kunststoffe mit der Zeit zu lösen. </li><li> Bereiten Embryo dechorionation Lösung, Inkubation Medien-, Farbstoff-und Arzneimittellösungen. Mischen Sie 25 ml Bleichmittel mit 25 ml H 2 O und in flache Schale. Bereiten modifizierten Grund Inkubationsmedium (MBIM) und MBIM-T nach dem Stand der Rezeptur 1,12. Bereiten Shields und Sang M3 Zellkulturmedium und PBS nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialliste). Bereiten Stammlösung von Permeabilisierung Farbstoff bei 10 mM Konzentration in DMSO. </li><li> Montieren Embryo-Handling-Geräte und Zubehör: <ol><li> Bereiten dechorionation und EPS Behandlung Korb (siehe Abbildung 1A). Schneiden Sie ein 3 cm Abschnitt einer Wegwerf 50 ml Polypropylen-Zentrifugen / Kulturröhrchen mit einer Feinsäge. Machen Sie den Schweißfläche bündig durch Reiben der Rohrabschnitt auf Sandpapier eingehaltenauf eine Tischfläche. Schweißnaht der Rohrabschnitt um Nitex Nylonnetz durch Schmelzen des Randes der Rohrabschnitt über einer Flamme und Drücken auf das Netz auf einer Glasplatte. Abkühlen lassen und schneiden Sie zusätzliche Mesh. HINWEIS: Die schiere Seiten und der Unterseite ermöglichen eine schnelle und vollständige Abspülen von Restbleichmittel und EPS in den jeweiligen Schritten. Die Schweißschritte sollten unter einem Abzug durchgeführt werden. </li><li> Bereiten Sie eine Entwicklung Korb. Abgeschnittenen oberen Teil einer 50-ml-Zentrifugen / Kulturrohr bündig mit dem Rand der Kappe. Entfernen und ändern Sie die Kappe durch Ausschneiden eines zentralen Öffnung und Kerben am Rand wie in 1B gezeigt. Schrauben Sie die Kappe über dem Netz und auf das Gewinde der abgeschnittenen Rohrabschnitt und trimmen zusätzliche Mesh. HINWEIS: Die Kappe enthält Aussparungen in der Felge, die Diffusion zu ermöglichen, der Groß Medium, wenn in der 60 mm Reservoir Gericht (Abbildung 1B) positioniert. </li><li> Bereiten Komponenten eines Schieberraum. Schneiden Sie ein Quadrat von DO-Membran, die größer ist alsder Schieber Kammeröffnung. Tragen Sie eine sehr dünne Schicht Vakuumfett an der Innenseite Lippe der Öffnung. Befestigen Sie die DO Membran in die Öffnung gegen die Dichtfett mit dem Haltering. Schneiden Sie überschüssige DO Membran, indem sie wieder in der Nähe der Haltering. HINWEIS:. Spezifikationen für die Folie Kammer kann in Kiehart et al 13 zu finden Diese Kammer ist nicht im Handel erhältlich und erfordert kundenspezifische Herstellung von einer Werkstatt. </li></ol></li></ol> 2. Staging, Dechorionation und EPS Behandlung von Embryonen <ol><li> Staging Embryonen durch zeitgesteuerte Sammlung. Stellen Sie eine frische Traube / Hefe Platte zur Fliege Kultur Käfig in der Uhr. Embryonen ermöglichen, für 1 h bei 25 ° C festgelegt werden Entsorgen Sie diesen Platte und ersetzen mit einer frischen Traube / Hefe Platte für eine spätere Embryo Verlegung von 2 h bei 25 ° C Sammeln Sie diese Platte und in 18 ° C-Inkubator für die weitere Entwicklungs Inszenierung. ANMERKUNG: 1 h Entwicklung bei 25 ° C gleich 2 h Entwicklungbei 18 ° C. Die Wirkung der Alterung bei 18 ° C gegenüber 25 ° C auf die Aufrechterhaltung EPS Permeabilisierung im späten Stadium Embryonen können in Fig. 2 gesehen werden. </li><li> Dechorionation. Embryonen vorsichtig abspülen Traubenplatte in Gitterkorb mit 25 ° C Leitungswasser und einem Pinsel. Spülen Sie überschüssige Hefe weg von den Embryonen in den Korb unter einem leichten Strom von Leitungswasser. Tauchen Sie den Korb in 50% Bleichmittel für 2 min. Embryonen gründlich unter fließendem Leitungswasser waschen. HINWEIS: spritzen vorsichtig Bleichmittel-Lösung auf der Embryonen intermittierend mit einer Plastikpipette. Während 2 Minuten ist in der Regel für die komplette dechorionation ausreichend, sollte dieser Inkubationszeit durch direkte Untersuchung überprüft und entsprechend angepasst werden. Pflegen dechorionated Embryonen in den Korb in Leitungswasser getaucht und gehen sofort in die EPS Schritt. </li><li> EPS-Behandlung <ol><li> Bereiten Sie sechs 60 mm-Platten mit ca. 10 ml PBS in jedem. Bereiten EPS Verdünnung durch Auflösen von 75 ul EPS in 2.925 ml MBIM (1.40) in einem 50 ml Becherglas mit Verwirbelung. Hinweis: Eine weiße Emulsion bildet aus dieser Mischung. </li><li> Überschüssiges Wasser aus dem Boden der Siebtrommel mit einem Labor zu wischen. Tauchen Warenkorb in verdünnter EPS im Becher und sofort wirbeln Embryonen in der EPS-Lösung in der Boden des Korbes zu verteilen. Weiter Wirbelbewegung für 30 Sekunden. HINWEIS: EPS Verdünnungen und Belichtungszeiten können variiert werden, um Durchlässigkeit zu steuern. Es wird empfohlen, dass eine optimale EPS Verdünnungen und Behandlungszeiten empirisch mit den Stämmen von Fliegen verwendet festgelegt werden. Steigende Belichtungszeit auf 60-90 sec ist günstig für Stufe 12 und älter Embryonen. </li><li> Entfernen Korb, tupfen Sie das überschüssige EPS mit einem Labor zu wischen. Fahren Sie mit sechs aufeinanderfolgenden Waschungen in 10 ml PBS in den 60-mm-Schalen. Mit einem Kunststoff-Pipette vorsichtig spritzen Embryonen mit PBS in jede der sechs Wäschen. Gehen Sie zu färben und Drogenbehandlungsschritte. Hinweis: EPS kann in den Ausguss entsorgt werden. </li></ol></li></ol>3. Dye and Drug Behandlung von permeabilisierten Embryonen <ol><li> Dye-Behandlung <ol><li> Mit 5 &amp;mgr; l 10 mM CY5 Carbonsäurefarbstoff * 1 ml MBIM-T (50 &amp;mgr; M Endkonzentration) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel zu mischen. HINWEIS: * Wahl der Farbstoff abhängig von Folgeanalyse. CY5 Carbonsäure ist für spätere Analysen mit Fixierung und Immunfärbung. Rhodamin B ist hilfreich für die Analyse von lebenden Embryonen. Die rote Emission von Rhodamin B und der grüne Emission seiner Metaboliten 1 kann einige Komplikationen mit Downstream-Anwendungen unter Verwendung von Fluoreszenz zu präsentieren. Medikament oder Toxin kann zu der Farbstofflösung zugegeben werden, um die Behandlung zu diesem Zeitpunkt zu initiieren, oder Arzneimittel / Toxin-Behandlung auf einen Puls an dieser Stelle zu begrenzen. Es sollte nach MSDS-und Umweltsicherheitsstandards genommen zur Handhabung und Entsorgung von Medikamenten und Giftstoffe werden. </li><li> Übertragen Embryonen aus dem Gitterkorb auf die Farbstofflösung mit einem Pinsel. Das Röhrchen und invertieren wiederholt, um sicherzustellen, dass dieEmbryonen frei schweben in Suspension in der Farbstofflösung. Das Röhrchen auf einem Taumel Wippe für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Röhrchen aus Nutator und lassen Embryonen zu begleichen. Entfernen Farbstofflösung mit einer feinen Pipette und ersetzen mit 1 ml MBIM-T zu waschen. Kehren Rohr wieder auszusetzen Embryonen vollständig. Lassen Embryonen zu regeln, und wiederholen Sie mit drei weiteren MBIM-T Wäschen. Entfernen Sie alle MBIM-T von Schlussspülung und zur Inkubation Schritt. </li></ol></li><li> Inkubation für Embryo-Entwicklung <ol><li> Transfer-Embryonen mit einer von zwei Kammern: Die Entwicklung Korb oder die Schiebekammer. HINWEIS: Die Entwicklung Korb für längere Entwicklungszeiten bevorzugt, und ist erforderlich, wenn nachfolgende Fixierung und Immunfärbung Schritte auszuführen sind. Die Schieberraum ist optimal für die höhere Auflösung Zeitraffer-Bildgebung und ist am effektivsten für kurze Entwicklungszeiten (zB den frühen embryonalen Ereignisse). Medikament oder Toxin kann zu dem Medium bei verschiedenen Konzentrationen und Embryo d angefügtntwicklung können in Echtzeit mit Live-Embryonen oder an einem Endpunkt mit Standard-Fixierung und Immunfärbung Protokolle überwacht werden. </li><li> Entwicklung in Körbe <ol><li> Reinigen Sie eine Entwicklungs Korb durch Spritzen mit 70% Ethanol gründlich mit entionisiertem Wasser und trocken tupfen mit Labor zu wischen. Bereiten 6 ml Inkubationsmedium mit der gewünschten Konzentration des Wirkstoffs oder Toxin. Legen Sie die Entwicklung Korb in Medium in 60-mm-Schale kümmert nicht Falle Luftblasen unter dem Mesh-Basis. HINWEIS: Zwei Medien werden üblicherweise verwendet: MBIM allein oder MBIM/M3 in einer 50:50-Mischung, wobei letztere für längere Entwicklungszeiten effektiver. </li><li> Übertragen permeabilisiert Embryonen Oberfläche in der Basis der Korb mit einem Pinsel Netz. Sanft spritzen die Embryonen mit Medien aus dem umgebenden Reservoir. Dispergieren der Embryonen mit dem Pinsel, so dass sie in einer Monoschicht auf dem Gitter sind. Hinweis: Fahren Sie mit Mikroskopie und Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Eigenschaften des pr bewerteneparation (siehe Schritt 4). </li></ol></li><li> Entwicklung in der Chamber Slide <ol><li> Invertieren Schieberkammer und eine kleine Wulst Vakuumfett auf dem Umfang der Öffnung. Platzieren 150 &amp;mgr; l Medium mit der gewünschten Menge des Arzneimittels oder Toxins an der Oberfläche der DO Membran innerhalb der Öffnung. HINWEIS: Zwei Medien werden üblicherweise verwendet: MBIM allein oder MBIM/M3 in einer 50:50-Mischung, wobei letztere für längere Entwicklungszeiten effektiver. </li><li> Übertragen permeabilisiert Embryonen in die Drop-Medien mit einem Pinsel. Dispersions die Embryonen so dass sie auf der Membran innerhalb des Tropfens zu begleichen. </li><li> Eine kreisförmige Deckglas 25 mm über der Öffnung, wodurch das Medium Abflachung vorsichtig anzuwenden. Andrücken entlang des Umfangs des Deckglases, um eine Dichtung mit dem Fett bilden. Hinweis: Fahren Sie mit Mikroskopie zu Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Eigenschaften der Zubereitung zu bewerten (siehe Schritt 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identifizierung von permeabilisierten Lebensfähige Embryonen <ol><li> Identifizieren permeabilisiert Embryonen. Embryonen beobachten unter Epifluoreszenz mit einem Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Erwerben Sie Bilder aus mehreren Feldern mit festen Mikroskop-und Kameraeinstellungen (im blauen Wellenlängen, um das Profil Eigelb Autofluoreszenz zu bestimmen). </li><li> Bestimmen Sie Permeabilisierung von Embryonen auf der relativen Fluoreszenzintensität. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem großen Arbeitsabstand, um den Korb unterzubringen und Manipulationen der Embryonen zu erlauben. Das Mikroskop ist mit einem programmierbaren XYZ-Bühne, Epifluoreszenz-Beleuchtung und einer Digitalkamera ausgestattet sein. Bild die Embryonen dabei darauf achten, Belichtung und Bühnenpositionsparameter jeder Embryo Bild aufzunehmen, um eine erneute Bewertung der gleichen Embryonen zu einem späteren Zeitpunkt zu ermöglichen (siehe repräsentatives Ergebnis in Abbildung 3). Hinweis: Muster der Farbstoffaufnahme in Abhängigkeit von dem verwendeten Farbstoff, der Expositionsdauer und Embryoalter variieren. Eine breite Paletteder Farbstoffaufnahme in einem einzigen Präparat ist typisch und spiegelt die Variation in dem Grad der Permeabilisierung. </li><li> Identifizieren lebensfähige Embryonen. Nach der Markierung permeabilisiert Position Embryonen weiter mit Embryoentwicklung bei Raumtemperatur oder 25 ° C. Zurück Korb oder Schieberraum zu Mikroskop. Beachten unter blauem Kanal-Fluoreszenz-und Bild Eigelb Autofluoreszenz in permeabilisierten zuvor identifizierten Embryonen zu erwerben. Bewerten Lebensfähigkeit nach den üblichen Fortschreiten der Dotterverteilung (siehe Rand et al. 1 und repräsentatives Ergebnis in Abbildung 3). Hinweis: Andere morphologische Merkmale der mit Hellfeldmikroskopie beobachtet Embryo kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit zu bewerten. Es wird empfohlen, dass die Festlegung der Durchlässigkeit, die mit Lebensfähigkeit kompatibel ist empirisch mit jedem Farbstoff und Belastung von Flug verwendet wird, bestimmt werden. </li><li> Bewerten Droge oder Gift Effekte in permeabilisierten lebensfähige Embryonen. </li><li> Embryonen Verfahmit dem obigen Protokoll sind für eine Reihe von herkömmlichen bereit ssed analysiert anschließend an Medikament oder Toxin-Exposition. Einige der verschiedenen Arten von Analysen werden in der Diskussion unten betrachtet und umfassen die direkte Beobachtung der Morphogenese in Live-Embryonen als auch nach der Fixierung Immunfärbung analysiert. Beide Ansätze werden durch die Verwendung von Vitalfarbstoffen (z. B. GFP), das Gen-Expressionsmuster und die Zelllinie und Morphologie Profile zeigen verbesserte. </li></ol>

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S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li><li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos.">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li><li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos.">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das oben beschriebene Verfahren beschreibt ein Mittel, um den Erhalt lebensfähiger Drosophila-Embryonen, die zugänglich zu kleines Molekül Behandlungen in einem breiten Entwicklungsbereich sind. Diese Methode stellt die neue und einfache Feststellung, dass das Altern Embryonen bei 18 ° C ermöglicht Permeabilisierung der späten Phase Embryonen mit der gleichen Wirksamkeit wie zuvor nur in frühen Embryonen gesehen. Darüber hinaus hat die Verwendung von fernen Rot Cy5 Carbonsäure als Indikator wirksamen P...

Die Drosophila-Embryo weiterhin ein erstklassiges Modell für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entwicklung 2 sein. Dieses leistungsstarke Modell wird durch eine breite Palette von molekulargenetischen Werkzeugen, die Manipulationen der wesentlichen jedem Gen zu jedem Zeitpunkt und in jeder sich entwickelnden Organ erlauben unterstützt. Die geringe Größe, die schnelle Entwicklung und umfangreiche Charakterisierung der Morphogenese des Drosophila-Embryos machen es zu einem Modell der Wahl für genetische Bildschirme, von denen viele grundlegende Entwicklungswege aufgedeckt 3,4. Zahlreiche Phänotypen in Drosophila-Embryos wurden aus und sind leicht zu interpretieren, die oft ein Mittel, um die molekularen genetischen Mechanismen, die eine abnorme Merkmal verantwortlich zu identifizieren. Historisch gesehen, ein Mangel des Fliegenembryo Modell war die Schwierigkeit der Einführung kleine Moleküle zu embryonalen Geweben. 1) uns: Dieses Hindernis hat Beschränkungen gestelltten bekannten bioaktiven kleinen Molekülen als Sonden zur Entwicklungsmechanismen zu verhören und 2) mit diesem etablierten Modell teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized beurteilen. Als Folge hat das Screening Potential des Fliegenembryo in Charakterisierung von Kleinmolekül-Aktivität nicht ausgelastet ist. 1) Permeabilisierung der Eierschale und 2) Mikroinjektion: Abgabe kleiner Moleküle Fliegenembryo kann mit zwei Methoden erreicht werden. Dieser Artikel stellt Fortschritte der Methode der Permeabilisierung, die einfach in der Einstellung eines herkömmlichen Drosophila Labor auszuführen sind. Es sei darauf hingewiesen, dass die jüngsten Fortschritte in der Mikroinjektionsverfahren mit Mikrofluidik-Technologie trägt auch auf Verfahren zum Einführen von Verbindungen in den Embryo 5,6 ist. Einführen von Molekülen in den Embryo durch eine Wachsschicht von der Eierschale 7 verhindert. Die Drosophila Eierschale besteht aus fünf Schichten. Ausdie von innen nach außen sind sie: die Dotterhaut, die wachsartige Schicht, die innere Chorion-Schicht, der endochorion und die exochorion 8. Die drei Außen Chorion-Schichten können durch kurze Auftauchen des Embryos in verdünnter Bleichmittel entfernt werden, so wird ein Schritt, um so dechorionation. Die freiliegende Wachsschicht kann dann durch Exposition gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Heptan und Octan 7,9, wodurch die dechorionated Embryo lässigen beeinträchtigt werden, während es noch in der zugrunde liegenden Dottermembran umhüllt. , Verwendung dieser Lösungsmittel führt jedoch Komplikationen aufgrund ihrer Toxizität und der Schwierigkeit bei der Regulierung ihrer starken permeabilisierend Aktion, die beide stark negativen Effekte auf den Embryo Lebensfähigkeit 9,10. Ein Verfahren zur Permeabilisierung unter Verwendung einer Zusammensetzung bezeichnet Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS) wurde bereits beschrieben 1 gewesen. Diese Lösungsmittel aus d-Limonen und von Pflanzen abgeleitete Tenside, die Lösungsmittel ermöglichen miscibl seine mit wässrigen Puffern. Die niedrige Toxizität von d-Limonen und die Fähigkeit des Lösungsmittels auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen ist eine wirksame Methode zur lässigen Embryonen mit hoher Lebensfähigkeit 1 erzeugen ergab. Jedoch sind zwei endogene Faktoren weiterhin Beschränkungen hinsichtlich der Anwendung zu bringen. Zunächst Embryonen zeigen Heterogenität der Durchlässigkeit nach EPS-Behandlung, auch wenn darauf geachtet wird, schließen Entwicklungs Inszenierung halten. Zweitens Embryonen älter als etwa acht Stunden haben schwer zu permeabilisieren, im Einklang mit einer Verhärtung der Eierschale, die nach der Eiablage 11 tritt bewährt. Hier beschrieben werden, sind Fortschritte in der EPS-Verfahren, dass: 1) bei der Identifizierung und Analyse von nahezu identisch permeabilisiert Embryonen, auch nach Fixierung und Immunfärbung Schritte ausgeführt worden sind und 2) zu ermöglichen Permeabilisierung der Embryonen im späten Entwicklungszeitpunkten (&gt; 8 h, Bühne 12 und älter). Insbesondere Anwendung eines dunkelroten Farbstoff,CY5 Carbonsäure, beschrieben, die als Durchlässigkeit Anzeige, die während der Entwicklung und nach Formaldehydfixierung im Embryo weiterhin dient. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Aufzucht Embryonen bei 18 ° C hält die Eierschale in eine EPS-sensitiven Zustand, so dass Permeabilisierung der späten Phase Embryonen (Stufen 12-16). Diese Fortschritte zu überwinden, die zuvor erwähnten Einschränkungen für die EPS-Methodik. Diese Anwendung wird daher stellen die Ermittler mit einem Mittel, um kleine Moleküle von Interesse für den Embryo in unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten einführen und gleichzeitig Rentabilität.

<table><tbody><tr><td>Fly Cage</td><td>Flystuff.com</td><td>59-101</td><td>http://flystuff.com/general.php</td></tr><tr><td>Cocamide DEA [Ninol 11-CM]&amp;nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>call for special order</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr><tr><td>Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]&amp;nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>call for special order</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr><tr><td>d-limonene (Ultra high purity grade)</td><td>Florida Chemical Co.&amp;nbsp;</td><td>call for special order</td><td>http://www.floridachemical.com/</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SS290-4</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr><tr><td>PBS powder</td><td>Sigma</td><td>56064C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma</td><td>R6626</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>CY5 carboxylic acid</td><td>Lumiprobe</td><td>#23090</td><td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472310-100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Nitex Nylon mesh&amp;nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>57-102</td><td>http://flystuff.com/misc.php</td></tr><tr><td>Dissolved oxygen (DO) membrane&amp;nbsp;</td><td>YSI</td><td>#5793</td><td>http://www.ysireagents.com/search.php</td></tr><tr><td>25 mm circular no.1 cover slip&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48380-080</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr><tr><td>Grape-agar plate mix&amp;nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>47-102</td><td>http://flystuff.com/media.php</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr></tbody></table>

a method of permeabilization of drosophila embryos for assays of small molecule activity

Die Drosophila-Embryo ist seit langem ein leistungsfähiges Labormodell für die Aufklärung der molekularen und genetischen Mechanismen, welche die Entwicklung steuern. Die Einfachheit der genetischen Manipulationen mit diesem Modell pharmakologische Ansätze, die in anderen Tiermodellen und Tests auf Zellbasis alltäglich sind verdrängt. Hier beschreiben wir die jüngsten Fortschritte in einem Protokoll, Anwendung von kleinen Molekülen ermöglicht, den Entwicklungsfruchtfliegenembryo. Das Verfahren vor, um die Details Dichtigkeit der Eierschale zu überwinden und gleichzeitig Embryo Lebensfähigkeit. Eierschale Permeabilisierung in einem breiten Spektrum von Entwicklungsstufen wird durch Anwendung eines zuvor beschriebenen d-Limonen Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS 1) und durch Alterung Embryonen bei reduzierter Temperatur (18 ° C) vor der Behandlung erreicht. Darüber hinaus ist die Verwendung eines fernen Rot-Farbstoff (CY5) als Permeabilisierung Indikator beschrieben, die mit stromabwärts Verwendung von handelsüblichen roten und grünen Grippe kompatibel istorescent Farbstoffe in lebenden und fixierten Präparaten. Dieses Protokoll ist auf Studien mit bioaktiven Verbindungen zu Entwicklungsmechanismen für ein Studium an der Bewertung teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized richtet Sonde als auch.

Embryo Handhabungsvorrichtungen sind in Fig. 1 dargestellt, um bei der Visualisierung der &quot;home-made&quot;-Geräte für die Manipulation in den obigen Protokollen unterstützen. Ergebnisse in Abbildung 2 zu sehen veranschaulichen die Wirkung der robuste Aufzucht Embryonen bei 18 ° C auf ihrer Fähigkeit, durch EPS in späten Stadien der Entwicklung durchlässig gemacht werden. Dieser Zustand wird im Schritt 2.1 Protokoll angewendet. Wirksamkeit des CY5 Carbonsäurefarbstoff, um di...

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A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell.

Ein Verfahren zur Permeabilisierung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für Tests von Small Molecule Aktivität

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

12.4K Aufrufe.  University of Rochester School of Dentistry and Medicine.  Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell. 

Serie: A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Forschung

Biotechnik

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Entwicklungsbiologie

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Biologie

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or complete loss of viability at different stages of development. Our lab has developed a method to assess viability in Drosophila from embryo to fully mature adult. The method relies on quantifying the number of progeny present at different stages during development, starting with hatched embryos. After embryos have been quantified, additional stages are counted, including L1/L2, pupae, and mature adults. After all stages have been examined, a statistical analysis such as the chi-square test is used to determine if there is a significant difference between the starting number of progeny (hatched embryos) and later stages culminating in the observed number of adults, thus rejecting or accepting the null hypothesis (that the number of hatched embryos will be equal to the number of larvae, pupae, and adults recorded throughout the stages of development). The primary advantage of this assay is its simplicity and accuracy, as it does not require an embryo rinse to transfer them to the food vial, avoiding losses from technical errors. Although the protocol described here does not directly examine L2/L3 larvae, additional steps can be added to account for these. Comparing the number of hatched embryos, L1, pupae, and adults can help determine if viability was compromised during the L2/L3 stages for further studies (the use of colored food helps with visual identification of larvae). Overall, this method can help Drosophila researchers and educators determine when viability is compromised during the fly life cycle. Routine assessment of stocks using this assay can prevent accumulation of secondary mutations that may affect the phenotype of the originally isolated mutant, especially if the original mutations affect fitness. For this reason, our lab maintains multiple copies of each of our Dm ime4 alleles and routinely checks the purity of each stock with this method in addition to other molecular analyses.&#160;

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

This protocol is designed to assess the viability of Drosophila at every developmental stage, from embryo to adult. The method can be used to determine and compare the viability of different genotypes or growth conditions.

Eine direkte und einfache Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Drosophila melanogastervom Embryo zum Erwachsenen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged molecules within complex biological samples. While traditional confocal microscopes allow one to resolve two adjacent fluorescent point sources located a few hundred nanometers apart, observing the finer details of subcellular biology requires the ability to resolve signals in the order of tens of nanometers. Numerous hardware-based methods for super-resolution microscopy have been developed to allow researchers to sidestep such resolution limits, although these methods require specialized microscopes that are not available to all researchers. An alternative method for increasing resolving power is to isotropically enlarge the sample itself through a process known as expansion microscopy (ExM), which was first described by the Boyden group in 2015. ExM is not a type of microscopy per se but is rather a method for swelling a sample while preserving the relative spatial organization of its constituent molecules. The expanded sample can then be observed at an effectively increased resolution using a traditional confocal microscope. Here, we describe a protocol for implementing ExM in whole-mount Drosophila embryos, which is used to examine the localization of Par-3, myosin II, and mitochondria within the surface epithelial cells. This protocol yields an approximately four-fold increase in sample size, allowing for the detection of subcellular details that are not visible with conventional confocal microscopy. As proof of principle, an anti-GFP antibody is used to distinguish distinct pools of myosin-GFP between adjacent cell cortices, and fluorescently labeled streptavidin is used to detect endogenous biotinylated molecules to reveal the fine details of the mitochondrial network architecture. This protocol utilizes common antibodies and reagents for fluorescence labeling, and it should be compatible with many existing immunofluorescence protocols.

Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging

Here, a protocol for the implementation of expansion microscopy in early Drosophila embryos to achieve super-resolution imaging using a conventional laser-scanning confocal microscope is presented.

Verwendung von Expansionsmikroskopie zur physikalischen Vergrößerung ganzer Drosophila-Embryonen für hochauflösende Bildgebung

The workhorse of developmental biology is the confocal microscope, which allows researchers to determine the three-dimensional localization of tagged ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Ein Verfahren zur Permeabilisierung der

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Mittelmaßnahme Vorbereitung von