Авторы выражают благодарность профессору Томас Райнер, д-р Яков Houghton, и д-р Серж Лященко за полезные беседы.

Все в естественных условиях экспериментов на животных, описанных проводились в соответствии с утвержденным протоколом и под этических принципов в Memorial Sloan Kettering онкологический центр Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC). 1. Сопряжение ДФО-NCS для J591 <ol><li> В 1,7 мл микроцентрифужных трубки, подготовить 2-5 мг / мл раствора J591 в 1 мл либо 1x фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) или 0,5 М HEPES-буфера (рН 7,4). </li><li> Растворить ДФО-NCS в сухом ДМСО в концентрации от 5-10 мм (3.8-7.6 мг / мл). Ультразвук или вихрь тщательно решение для того, чтобы облегчить полное растворение. </li><li> Отрегулируйте рН J591 раствора 8,8-9,0 путем добавления небольших аликвот (&lt;10 мкл) 0,1 М Na 2 CO 3. </li><li> После того, как раствор антитела при правильном рН, добавить объем раствора ДФО-NCS, соответствующей 3-4-кратного молярного избытка бифункционального хелатообразующего агента. <ol><li> Для экзаменаPLE, добавить 4-5 мкл 10 мМ (7,6 мг / мл) раствора ДФО NCS (40,4 нмоль ДФО NCS) до 1 мл мл раствора 2 мг / J591 антител (13,3 нмоль J591). Количество ДМСО в конечной водной реакционной смеси не должна превышать 2% объем / объем. </li></ol></li><li> Инкубируют реакционную смесь в течение 30 мин при 37 ° С на мешалкой в ​​нагревательном блоке 350 оборотов в минуту. </li><li> После 1 ч при 37 ° С, в результате очистки с помощью иммуноконъюгат предварительно упакованы одноразовые размер колонки исключение обессоливания с 50000 молекулярно-весовое отсечение с использованием 0,5 М HEPES-буфера (рН 7,4) в качестве элюента. Этот шаг будет давать 2 мл раствора заполненной J591-ДФО конструкции. </li><li> Измерение концентрации J591-ДФО построить на UV-VIS спектрофотометра. </li><li> Если более высокая концентрация конструкции желательно, концентрат раствор J591-ДФО с использованием центробежного блок фильтра с молекулярной массой 50000 отсечки. </li><li> Хранить раствор заполненной J591-ДФО иммуноконъюгата при -20 ° С в темноте. </ol> 2. радиоактивной J591-ДФО с 89 Zr ВНИМАНИЕ: Этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих действий или при выполнении любых других работ с радиоактивностью исследователей следует проконсультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Все возможные меры должны быть приняты для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения. ПРИМЕЧАНИЕ: В интересах надлежащего радиохимического ноте учета, количество радиоактивности в образце должна быть измерена с помощью дозы калибратор и зарегистрированы до и после этапов 2.2-2.13 в следующей протокола. Это поможет с точного определения радиохимических урожайности и конкретных мероприятий. <ol><li> Приготовьте раствор 0,5-2,0 мг J591-ДФО в 200 мкл 0,5 М HEPES буфере, рН 7,5. </li><li> Внесите объем &lt;SUP&gt; 89 Zr 4+ раствор (обычно поставляется в 1,0 М щавелевой кислоты), соответствующий 1,0-6,0 мКи (37-222 МБк) в 2 мл пластиковый с завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных. Регулировка громкости этого раствора в общем объеме 300 мкл с использованием 1,0 M щавелевую кислоту. </li><li> Отрегулируйте рН 89 Zr 4+ решение для 6,8-7,5, используя 1,0 М Na 2 CO 3. Начало добавлением 250 мкл 1,0 М Na 2 CO 3 в растворе 4+ 89 Zr и затем добавить меньший (&lt;10 мкл) аликвоты основания для достижения желаемого рН. </li><li> Добавить требуемое количество 89 Zr 4+ рН раствора доводили до-раствора J591-ДФО, полученного на стадии 2.1. </li><li> Проверьте рН реакционной смеси радиоактивной метки для того, чтобы она попадает в желаемом диапазоне 6,8-7,5. </li><li> Инкубируйте реакции радиоактивной метки в течение 60 мин при комнатной температуре на перемешивающего нагревательного блока в 350 оборотов в минуту. </li><li> После 60-минутной инкубации, измерить радiolabeling выход реакции с использованием радио-ТСХ. <ol><li> С этой целью определить 1 мкКи реакционной смеси радиоактивной метки на силикагеле ТСХ с пропиткой полосы. Разрешить аликвоту, чтобы высохнуть, запустить ТСХ, используя в качестве элюента 50 мМ DTPA (рН 5,5) и проанализировать TLC полосу с помощью радио-ТСХ сканера. 89 Zr 4+ связан с конструкцией J591-ДФО появится в начале координат (R F &lt;0,1), в то время как свободные 89 Zr 4+ катионы будут в хелатной форме DTPA и элюируют фронта растворителя (R F&gt; 0,9). </li><li> Рассчитать радиоактивной метки выход реакции путем интегрирования radiochromatogram, разделив площадь под кривой от R F 0.0-0.1 от общей площади под кривой, и умножением на 100. </li></ol></li><li> Если выход радиоактивной достаточно (как правило, теоретическая удельная активность&gt; 2 мКи / мг), погасить реакцию с 5 мкл 50 мМ DTPA, рН 5,5. </li><li> Очищают полученный иммуноконъюгат USIнг предварительно упакованы одноразовые гель обессоливания колонки с 50000 молекулярно-весовое отсечение с использованием в качестве элюента либо 0,9% стерильного солевого раствора с 5 мг / мл гентизиновой кислоты или 0,25 М ацетата натрия (рН 5,5) с 5 мг / мл гентизиновой кислоты , Этот шаг будет давать 2 мл раствора заполненной 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate. </li><li> После очистки, убедитесь, радиохимической чистоты 89 Zr-ДФО-J591 с помощью радио-ТСХ, как описано в шаге 2.7. </li><li> Рассчитать общий выход радиоактивной метки реакции путем деления количества активности изначально добавляют к раствору антител на величину радиоактивности, изолированные с очищенной 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate. </li><li> Рассчитать удельную активность окончательный путем деления количества активности изолированных с очищенной 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate от начальной массы ДФО-J591 в реакции радиоактивной метки. </li><li> Если концентрация выше, желательно, концентрат йе 89 Zr-ДФО J591 решение с использованием центробежного фильтра с 50000 молекулярная масса отсечки. Примечание: гентизиновая кислота, используемая в конечной стадии очистки является радиотелефонной защитное использованы, чтобы свести к минимуму деградацию антитела вследствие радиолиза 46 В то время как хранение 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate на срок до 48 часов при 4 ° С. можно, это не рекомендуется. Если radioimmunoconjugate должен быть сохранен, использовать 0,25 М ацетата натрия (рН 5,5) с 5 мг / мл гентизиновой кислоты в качестве буфера для хранения для того, чтобы свести к минимуму риск гипохлорита-опосредованной радиолиза. 47 </li></ol> 3. В Vivo ПЭТ с 89 Zr-ДФО-J591 ВНИМАНИЕ: Как и в разделе 2 протокола, этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих шагов исследователи должны консультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Все possibле шаги должны быть предприняты для минимизации воздействия ионизирующего излучения. <ol><li> У самцов бестимусных голых мышей подкожно имплантата 5 х 10 6 LNCaP клеток рака простаты и позволить им расти до 100-150 мм 3 ксенотрансплантате (через 3-4 недели после прививки). 44 </li><li> Развести 89 Zr-ДФО-J591 radioimmunoconjugate до концентрации 1,0 мКи / мл в 0,9% стерильного солевого раствора. </li><li> Вводят 200 мкл 89 Zr-ДФО-J591 раствора (200 мкКи; 7,4 МБк). В боковую хвостовую вену ксенотрансплантатов мышей, несущих 48 </li><li> В момент времени желательно изображений (например, 12, 24, 48, 72, 96, или 120 ч после инъекции), обезболить мышь с 2% в ИФ: газовой смеси кислорода. </li><li> Наведите на кровати маленькое животное ПЭТ сканера и поддержания анестезии во время сканирования с помощью 1% в ИФ: газовую смесь кислорода. Перед размещением животных на планшет сканера, убедитесь, анестезии по методу схождение шнура и Applу глазная мазь для глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии. 49 </li><li> Приобретать данные ПЭТ для мыши с помощью статического сканирования с минимальной 40000000 совпадающих событий, используя окно энергии 350-700 кэВ и окно совпадение синхронизации из 6 нс. 50 </li><li> После завершения сделки по приобретению изображения, не оставляйте мышь без присмотра и не кладите его в клетку с другими мышами, пока он не пришел в сознание. </li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

В то время как строительство, радиоактивной и визуализация 89 Zr-ДФО labled radioimmunoconjugates, как правило, довольно простая процедура, важно, чтобы держать несколько ключевых соображений на каждом этапе процесса. Например, возможно, наиболее вероятной причиной для беспокойства во время соп...

Из-за их замечательной чувствительностью, близость, и селективности, антитела уже давно считаются перспективными векторы для доставки радиоизотопов для раковых клеток. Тем не менее, их применение в позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) была затруднена из-за отсутствия подходящего позитронно-эмиссионной радиоактивного изотопа их маркировки. 1-3 Один из наиболее важных аспектов при проектировании radioimmunoconjugates является соответствие физического распада наполовину Жизнь радиоизотопа к виво фармакокинетики в антитела. Более конкретно, антитела часто имеют относительно длинные, многодневные биологический период полураспада и, следовательно, должны быть помечены радиоактивными изотопами с сопоставимыми физическими полураспада. Для приложений, ПЭТ, антитела традиционно радиоактивным 64 Cu (T 1/2 = 12,7 ч), 86 Y (T 1/2 = 14,7 ч), или 124 (Г 1/2 = 4,18 D). 4, 5 Однако каждый изЭти изотопы обладает значительными ограничениями, которые препятствуют их пригодности для клинической визуализации. В то время как radioimmunoconjugates с маркировкой 86 Y и 64 Cu доказали перспективным в доклинических исследованиях, как изотопы обладают физическими полураспада, которые являются слишком коротка, чтобы быть эффективным для визуализации в организме человека. 124 Я, напротив, имеет почти идеальную физическую полураспада изображений с антителами, но это дорого и имеет субоптимальные характеристики распада, которые приводят к относительно низким разрешением клинических изображений. Кроме того, 124 radioimmunoconjugates I-меченого может быть предметом Дегалогенирование в естественных условиях, процесс, который может привести к снижению опухоли к фону отношения активности. 6,7 Привод, чтобы найти позитронно-эмиссионной радиоактивного изотопа вытеснить 64 Cu, 86 Y и 124 я в radioimmunoconjugates вызвал недавний всплеск исследований по 89 Zr-меченых антител. 8-12 Tон причиной появления 89 Zr прост: радиоактивный обладает почти идеальной химические и физические свойства для использования в диагностических ПЭТ radioimmunoconjugates 13 89 Zr производится через 89 Y (P, N) 89 Zr реакции на циклотроне с использованием. коммерчески доступны и 100% естественно обильные 89 Y цель. 14,15 радиоактивный имеет позитронов выход 23%, распадается с периодом полураспада 78,4 ч и излучает позитроны с относительно низкой энергией 395,5 кэВ (рис 1). 13,16,17 Важно отметить, что 89 Zr и излучает высокую энергию, 909 кэВ γ-луча с эффективностью 99%. В то время как это излучение не мешает энергично испускаемых 511 кэВ фотонов, это требует дополнительных рассмотрение в связи с транспортировки, погрузки и дозиметрии. Несмотря на это предостережение, эти характеристики распада, в конечном счете означает, что 89 Zr не только имеет более благоприятный часУкороченный жизнь для работы с изображениями с антителами, чем 86 Y и 64 Cu, но также может производить изображения более высокого разрешения, чем 124 I, который испускает позитроны с более высокими энергиями 687 и 975 кэВ, а также числа фотонов с энергиями в 100-150 кэВ на 511 кэВ позитрон-создано фотоны. 13 Кроме того, 89 Zr также более безопасным в обращении, дешевле в производстве, и в residualizes опухолей более эффективно, чем его аналог радиоактивного йода. 18,19 Одним из потенциальных ограничений на 89 Zr является то, что он не имеет Терапевтический изотополога, например, 86 Y (ПЭТ) по сравнению с 90 Y (терапия). Это исключает строительство химически идентичных суррогатных средств визуализации, которые могут быть использованы в качестве дозиметрических разведчиков для своих терапевтических аналогов. Это сказало, исследования показывают, что 89 Zr-меченые антитела имеют потенциал в качестве изображений суррогатов 90 Y- и 177 Lu-меченых иммуноконъюгатов.20,21 С химической точки зрения, в качестве металла группы IV, 89 Zr существует в виде 4 катиона в водном растворе. Ион ZR 4+ весьма напряженной, относительно большой (вступает в силу ионный радиус = 0,84 Å), и может быть классифицирован как «жесткого» катиона. Таким образом, он обладает предпочтение лигандов, имеющих до восьми жестких, анионных доноров кислорода. Легко наиболее распространенным хелатор используется в 89 Zr-меченых radioimmunoconjugates является десферриоксамин (ДФО), сидерофор происхождения, ациклические хелатор подшипник три гидроксаматные группы. Лиганд стабильно координирует катионы Zr 4+ быстро и чисто при комнатной температуре в биологически соответствующих значениях рН, и полученную Zr-ДФО комплекс остается стабильным в течение нескольких дней в физиологическом растворе, сыворотке крови, и цельной крови. 22 Вычислительные исследования убедительно свидетельствуют что ДФО образует hexacoordinate комплекс с Zr 4+, в котором металл центр координируется с тремя NEUTRAL и три анионные доноры кислорода лиганда, а также два экзогенных лигандов воды (Рисунок 2). 23,24 поведение в естественных условиях radioimmunoconjugates, использующих сопряжения эшафот 89 Zr-ДФО в целом был превосходным. Тем не менее, в некоторых случаях, изображений и острые исследования показали, биораспределени повышенные уровни активности в кости мышей, которым вводили 89 Zr-меченых антител, данные, которые показывают, что osteophilic 89 Zr 4+ катион выходит из хелатообразующего агента в естественных условиях, а затем минерализуется в кости. 25 В последнее время ряд исследований в разработке новых 89 Zr 4+ энтеросорбенты, особенно лигандов с восемью кислородные доноры появились в литературе. 24,26,27 Тем не менее, в настоящее время, ДФО является наиболее широко используется хелатор в 89 Zr-меченых radioimmunoconjugates с большим отрывом. Множество различныхСтратегии биоконъюгации были использованы для присоединения к антителам ДФО, в том числе Биоортогональные реакции щелчком, реакцию тиол-реактивного ДФО строит с цистеинов в антителе, и реакцию активированного эфира несущих конструкций с ДФО лизина в антителе. 4,28- 30 Легко наиболее распространенная стратегия, однако, было использование изотиоцианатом несущей производной ДФО ДФО-NCS (Рисунок 2). 22 Это коммерчески доступны бифункциональное хелатор решительно и надежно образует устойчивые ковалентные тиомочевины связи с лизинов антитела (фиг.3). За последние несколько лет, широкий спектр 89 Zr-ДФО-меченых radioimmunoconjugates были описаны в литературе. Доклинические исследования были особенно многочисленны, показывая антител, начиная от более известной цетуксимаб, бевацизумаб, и трастузумаб более эзотерических антитела, такие как CD105 таргетирования TRC105 и свободного ПСА таргетирования 5À10. 30-36 Совсем недавно, небольшое количество ранней фазе клинических испытаний с использованием 89 Zr-ДФО меченых антител появились в литературе. В частности, группы в Нидерландах опубликованных исследований, использующих 89 Zr-ДФО cmAb U36, 89 Zr-ДФО Ibritumomab Tiuxetan и 89 Zr-ДФО трастузумаб. 21,32,37 Кроме того, целый ряд других клинических испытаниях с 89 Zr меченные radioimmunoconjugates являются в настоящее время, в том числе исследований здесь, в Memorial Sloan Kettering онкологический центр с использованием ПСМА-таргетинга 89 ZR-ДФО J591 для работы с изображениями рака простаты и HER2-таргетинга 89 ZR-ДФО трастузумаб для визуализации рака молочной железы. 23, 30 Кроме того, в то время как радиоактивно меченные антитела остаются наиболее распространенные 89 Zr-меченых радиофармацевтических препаратов, радиоактивного металла также чаще используют с другими векторами, в том числе пептидов, белков и наноматериалов. 38-43 </sup&gt; Модульность этого 89 Zr-ДФО методологии маркировка огромным активом. Репертуар биомаркеров таргетирования антител постоянно расширяется, и интерес в выполнении в естественных условиях ПЭТ с использованием этих конструкций растет быстрыми темпами. В результате, мы считаем, что развитие более стандартизированной практики и протоколов может принести пользу на поле. Отличные письменные экспериментальный протокол для ДФО NCS сопряжения и 89 Zr радиомечения уже были опубликованы Vosjan и др. 22 Мы считаем, что наглядная демонстрация, предусмотренных настоящим работы могли бы еще помочь следователям, новые для этих методов. В протоколе в стороны, простата-специфический мембранный антиген ориентации J591 антитела будут использованы в качестве модельной системы для иллюстрации (1) биоконъюгации бифункционального хелатообразующего агента ДФО-изотиоцианат с антителом, (2) radiosynthesis и очистка 89 Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate,и (3) в естественных ПЭТ с 89 Zr-ДФО монАТ radioimmunoconjugate в мышиной модели рака. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

Исключительная близость, специфичность и селективность антител делает их чрезвычайно привлекательными векторы для опухолевых ориентированных ПЭТ радиофармпрепаратов. Из-за их многодневных биологического полураспада антитела должны быть помечены позитронных-излучающих радионуклидов с относительно длинными физической полураспада. Традиционно, позитрон-излучающих изотопов 124 (Т 1/2 = 4,18 г), 86 Y (т 1/2 = 14,7 ч) и 64 Cu (т 1/2 = 12,7 ч) были использованы для обозначения антитела по ПЭТ. Совсем недавно, однако, поле стало свидетелем резкого увеличения использования позитронно-эмиссионной радиоактивный 89 Zr в основе антител ПЭТ агентов визуализации. 89 Zr является почти идеальным радиоизотопные для ПЭТ с иммуноконъюгатов, так как обладает физической половину -Life (т 1/2 = 78,4 ч), который совместим с в естественных фармакокинетики антител и излучает относительно низкую енRGY позитронно, который производит изображения с высоким разрешением. Кроме того, антитела могут быть непосредственно помечены 89 Zr помощью сидерофора, полученных хелатообразующего агента десферриоксамин (ДФО). В этом протоколе, простата-специфический мембранный антиген ориентации J591 антитела будут использованы в качестве модельной системы для иллюстрации (1) биоконъюгации бифункционального хелатообразующего агента ДФО-изотиоцианат с антителом, (2) radiosynthesis и очистки 89 Zr- ДФО МАБ radioimmunoconjugate, и (3) естественных ПЭТ в с 89 Zr-ДФО МАБ radioimmunoconjugate в мышиной модели рака.

Первым шагом в этом протоколе сопряжения ДФО-NCS с антителом, как правило, довольно прочными и надежными. Как правило, очищенный, хелатообразующий агент, модифицированный иммуноконъюгат может быть получено с выходом&gt; 90%, и с помощью 3 молярных эквивалентов ДФО-NCS в начальной реакции конъ...

Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Биоконъюгации и Radiosynthesis из<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-ДФО меченых антител

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Chemistry

Unit 1

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

16.9K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Video: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Вдохновленные оригами самосборки Узорчатое и Reconfigurable Частицы

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Формирование упорядоченных биомолекулярных структур по самосборки коротких пептидов

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Сплит-и-бассейн Синтез и свойства пептида третичный амид библиотеки

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Исследования в взаимодействий аминокислот и пептидов с использованием неорганических материалов с использованием одномолекулярной силовой микроскопии

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

Спектроскопия ЯМР как надежный инструмент для быстрой оценки липидного профиля рыбьего жира добавки

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...