Gli autori ringraziano il Prof. Thomas Reiner, il Dr. Jacob Houghton, e il Dr. Serge Lyaschenko per utili conversazioni.

Tutti gli esperimenti sugli animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e alle linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Coniugazione DFO-NCS a J591 <ol><li> In una provetta da microcentrifuga 1,7 ml, preparare una soluzione di 2-5 mg / ml di J591 in 1 ml di soluzione salina 1x tampone fosfato (pH 7,4) o 0,5 M tampone HEPES (pH 7,4). </li><li> Sciogliere DFO-NCS in DMSO secco in concentrazione compresa tra 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml). Sonicare o vortex la soluzione accuratamente per facilitare la completa dissoluzione. </li><li> Regolare il pH della soluzione a 8,8-9,0 J591 aggiungendo piccole aliquote (&lt;10 microlitri) di 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Una volta che la soluzione di anticorpo è alla giusta pH, aggiungere un volume della soluzione DFO-NCS corrispondente a 3-4 volte eccesso molare del chelante bifunzionale. <ol><li> Per l&#39;esamepio, aggiungere 4-5 ml di un 10 mm (7,6 mg / ml) soluzione di DFO-NCS (40,4 nmol DFO-NCS) a 1 ml di una / soluzione di anticorpi J591 ml 2 mg (13.3 nmol J591). La quantità di DMSO nella miscela di reazione acquosa finale non deve superare il 2% v / v. </li></ol></li><li> Incubare la reazione per 30 minuti a 37 ° C su un blocco di riscaldamento agitazione a 350 rpm. </li><li> Dopo 1 ora a 37 ° C, purificare il immunoconiugato risultante utilizzando una dimensione monouso colonna di esclusione desalificazione preconfezionata con un peso molecolare di 50.000 cut-off utilizzando 0,5 M tampone HEPES (pH 7,4) come eluente. Questo passaggio produrrà una soluzione del costrutto completato J591-DFO 2 ml. </li><li> Misurare la concentrazione del J591-DFO di costruire su uno spettrofotometro UV-Vis. </li><li> Se si desidera una maggiore concentrazione del costrutto, concentrare la soluzione J591-DFO utilizzando un&#39;unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off. </li><li> Conservare la soluzione del completamento immunoconiugato J591-DFO a -20 ° C al buio. </ol> 2. radiomarcatura J591-DFO con 89 Zr ATTENZIONE: Questo passaggio del protocollo comporta il trattamento e la manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questa procedura o esecuzione di qualsiasi altro lavoro con i ricercatori di radioattività dovrebbe consultare con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Tutte le possibili misure dovrebbero essere adottate per ridurre al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni ionizzanti. NOTA: Ai fini di una corretta radiochimica nota-keeping, la quantità di radioattività nel campione deve essere misurata con un calibratore di dosi e registrato prima e dopo passaggi 2,2-2,13 nel protocollo di seguito. Ciò contribuirà con la determinazione precisa dei rendimenti radiochimica e attività specifiche. <ol><li> Preparare una soluzione di 0,5-2,0 mg di J591-DFO in 200 ml di 0,5 M tampone HEPES, pH 7.5. </li><li> Pipettare un volume del &lt;sup&gt; 89 soluzione Zr 4+ magazzino (di solito fornita in 1.0 M acido ossalico), corrispondenti a 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) in un 2 ml di plastica provetta con tappo a vite. Regolare il volume di questa soluzione per un totale di 300 ml con acido ossalico 1,0 M. </li><li> Regolare il pH della soluzione 89 Zr 4+ a 6,8-7,5 usando 1,0 M Na 2 CO 3. Iniziare aggiungendo 250 ml di 1,0 M Na 2 CO 3 al 89 Zr 4+ soluzione e successivamente aggiungere più piccolo (&lt;10 microlitri) aliquote di base per ottenere il pH desiderato. </li><li> Aggiungere la quantità desiderata di soluzione pH aggiustato 89 Zr 4+ alla soluzione J591-DFO preparata al punto 2.1. </li><li> Controllare il pH della miscela di reazione radiomarcatura per garantire che rientra nell&#39;intervallo desiderato di 6,8-7,5. </li><li> Incubare la reazione radiomarcatura per 60 min a RT su un blocco di riscaldamento agitazione a 350 rpm. </li><li> Dopo 60 min di incubazione, misurare la radiolabeling resa della reazione con la radio-TLC. <ol><li> A tal fine, individuare 1 pCi della miscela di reazione radiomarcatura su TLC strip silice impregnata. Lasciare l&#39;aliquota da asciugare, eseguire il TLC con un eluente di 50 DTPA mM (pH 5.5) e analizzare la striscia TLC utilizzando uno scanner radio TLC. 89 Zr 4+ legato al costrutto J591-DFO apparirà all&#39;origine (R f &lt;0.1), mentre i cationi liberi 89 Zr 4+ saranno chelato con DTPA e si eluire con il fronte del solvente (R f&gt; 0.9). </li><li> Calcolare la resa della reazione radiomarcatura integrando il cromotogramma radioattivo, dividendo l&#39;area sotto la curva da R f 0.0-0.1 per l&#39;area totale sotto la curva, e moltiplicando per 100. </li></ol></li><li> Se la resa radiomarcatura è sufficiente (tipicamente una attività specifica teorica&gt; 2 mCi / mg), spegnere la reazione con 5 ml di 50 DTPA mM, pH 5,5. </li><li> Purificare la risultante immunoconiugato using dimensioni getta colonna esclusione dissalazione pre-compresso con un peso molecolare di 50.000 cut-off con un eluente del 0,9% soluzione salina sterile con 5 mg / acido gentisico ml o 0,25 M di acetato di sodio (pH 5.5) con 5 mg / acido gentisico ml . Questo passaggio produrrà una soluzione del completamento radioimmunoconjugate 89 Zr-DFO-J591 2 ml. </li><li> Dopo la purificazione, di verificare la purezza radiochimica del 89 Zr-DFO-J591 utilizzando radio-TLC come descritto al punto 2.7. </li><li> Calcolare la resa complessiva radiomarcatura della reazione dividendo la quantità di attività inizialmente aggiunto alla soluzione di anticorpi per la quantità di radioattività isolato con il purificato 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate. </li><li> Calcolare l&#39;attività specifica finale dividendo la quantità di attività isolato con il purificato 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate dalla massa iniziale di DFO-J591 nella reazione radiomarcatura. </li><li> Se una concentrazione maggiore si desidera, concentrarsi the 89 soluzione Zr-DFO-J591 utilizzando un&#39;unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off. NOTA: L&#39;acido gentisico usato nella fase di purificazione finale è una radio-protettivo impiegato per minimizzare la degradazione dell&#39;anticorpo causa radiolisi 46 Mentre la memorizzazione del 89 Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate fino a 48 ore a 4 ° C. è possibile, non è consigliabile. Se il radioimmunoconjugate deve essere memorizzato, utilizzare 0,25 M di acetato di sodio (pH 5,5) con 5 mg / ml di acido gentisico come tampone di stoccaggio per minimizzare il rischio di radiolisi ipoclorito-mediata. 47 </li></ol> 3. In Vivo PET Imaging con 89 Zr-DFO-J591 ATTENZIONE: I Sezione protocollo 2, questa fase del protocollo comporta la gestione e la manipolazione della radioattività. Prima di effettuare questa procedura i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Tutti possibLe misure dovrebbero essere prese per ridurre al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni ionizzanti. <ol><li> In maschi topi nudi atimici, impianto sottocute 5 x 10 6 LNCaP cellule tumorali della prostata e permettere a questi di crescere a un xenotrapianto 100-150 mm 3 (3-4 settimane dopo l&#39;inoculazione). 44 </li><li> Diluire il radioimmunoconjugate 89 Zr-DFO-J591 ad una concentrazione di 1,0 mCi / ml in 0,9% soluzione salina sterile. </li><li> Iniettare 200 ml di soluzione di 89 Zr-DFO-J591 (200 uCi; 7,4 MBq). Nella vena della coda laterale dei topi xenotrapianto portanti 48 </li><li> Al punto di tempo di imaging desiderato (ad esempio, 12, 24, 48, 72, 96, o 120 hr post-iniezione), anestetizzare il mouse con isoflurano 2%: miscela di gas ossigeno. </li><li> Posizionare il mouse sul letto del piccolo scanner PET animali, e mantenere l&#39;anestesia durante la scansione utilizzando una isoflurane 1%: miscela di ossigeno. Prima di mettere l&#39;animale sul piatto dello scanner, verificare l&#39;anestesia con il metodo punta pinch e apply pomata oftalmica agli occhi del mouse per evitare l&#39;essiccazione durante l&#39;anestesia. 49 </li><li> Acquisire i dati PET per il mouse tramite una scansione statico con un minimo di 40 milioni di eventi coincidenti utilizzando una finestra di energia di 350-700 keV ed una finestra di temporizzazione coincidenza di 6 nsec. 50 </li><li> Dopo aver completato l&#39;acquisizione delle immagini, non lasciare incustodito il mouse e non metterlo in una gabbia con altri topi fino a quando non ha ripreso conoscenza. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre la costruzione, radioimmunoconjugates radiomarcatura, e l&#39;imaging di 89 Zr-DFO-etichettati è generalmente una procedura piuttosto semplice, è importante mantenere un paio di considerazioni fondamentali in mente durante ogni fase del processo. Per esempio, forse la causa più probabile di preoccupazione durante la fase coniugazione del procedimento è l&#39;aggregazione dell&#39;anticorpo durante la reazione di coniugazione. Questo problema è spesso un prodotto di scarsa miscelazione della reazio...

A causa della loro notevole sensibilità, affinità e selettività, anticorpi sono stati a lungo considerati vettori promettenti per la fornitura di radioisotopi a cellule tumorali. Tuttavia, la loro applicazione in tomografia a emissione di positroni (PET) è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato radioisotopi ad emissione di positroni per la loro etichettatura. 1-3 Una delle considerazioni più critici nella progettazione di radioimmunoconjugates è corrispondente al decadimento fisico mezza vita del radioisotopo alla farmacocinetica in vivo dell&#39;anticorpo. Più in particolare, gli anticorpi hanno spesso relativamente lunghi, più giorni di dimezzamento biologico e quindi devono essere etichettati con radioisotopi con emivita fisiche comparabili. Per le applicazioni di imaging PET, gli anticorpi sono stati tradizionalmente radiomarcato con 64 Cu (t 1/2 = 12,7 ore), 86 Y (t 1/2 = 14,7 ore), o 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4, 5 Tuttavia, ciascuno diquesti radioisotopi possiede significative limitazioni che ostacolano la loro idoneità per l&#39;imaging clinico. Mentre radioimmunoconjugates etichettati con 86 Y e 64 Cu sono dimostrati promettenti in studi preclinici, entrambi isotopi possedere emivite fisiche che sono troppo breve per essere efficace per l&#39;imaging nell&#39;uomo. 124 I, invece, ha una emivita fisica quasi ideale per l&#39;imaging con anticorpi, ma è costoso e presenta caratteristiche di decadimento subottimali che portano alla risoluzione relativamente bassa immagini cliniche. Inoltre, 124 radioimmunoconjugates I marcati possono essere soggetti a dealogenazione in vivo, un processo che può abbassare rapporti attività tumorale-a-background. 6,7 La spinta a trovare un radioisotopo che emette positroni-a soppiantare 64 Cu, 86 Y, e 124 sono in radioimmunoconjugates ha alimentato il recente aumento di ricerche sulla 89 anticorpi Zr-etichettati. 8-12 Tha ragione per l&#39;avvento di 89 Zr è semplice: il radiometalli possiede caratteristiche chimico-fisiche quasi ideale e per l&#39;uso in radioimmunoconjugates PET diagnostici 13 89 Zr viene prodotto tramite l&#39;89 Y (p, n) 89 reazione Zr su un ciclotrone con un. commercialmente disponibili e il 100% naturalmente abbondante 89 porta Y. 14,15 Il radiometalli ha un rendimento del 23% di positroni, decade con un&#39;emivita di 78,4 ore, ed emette positroni con relativamente bassa energia di 395,5 keV (Figura 1). 13,16,17 E &#39;importante notare che Zr 89 emette anche un alta energia, 909 keV γ-ray con efficienza del 99%. Mentre questa emissione non interferisce energicamente con le emessi 511 fotoni keV, richiede considerazione in più per quanto riguarda i trasporti, la gestione, e dosimetria. Nonostante questo avvertimento, queste caratteristiche di decadimento in ultima analisi significa che 89 Zr non solo ha un h più favorevolealf-vita per l&#39;imaging con anticorpi di 86 Y e 64 Cu, ma può anche produrre immagini ad alta risoluzione di 124 I, che emette positroni con energie superiori di 687 e 975 keV, nonché un numero di fotoni con energie dentro 100-150 keV di i fotoni positroni creati 511 keV. 13 Inoltre, Zr 89 è anche più sicuro da maneggiare, meno costosi da produrre, e residualizes nei tumori più efficacemente rispetto al suo omologo iodio radioattivo. 18,19 Una potenziale limitazione di 89 Zr è che non ha un isotopologue terapeutica, ad esempio, 86 Y (PET) vs. 90 Y (terapia). Ciò preclude la costruzione di chimicamente identici, agenti di imaging surrogati che possono essere impiegati come esploratori dosimetrici per i loro omologhi terapeutici. Detto questo, le indagini indicano che 89 anticorpi Zr-marcati hanno potenziale come surrogati di imaging per 90 Y e 177 immunoconiugati Lu-etichettati.20,21 Dal punto di vista chimico, come un metallo del gruppo IV, 89 Zr +4 esiste come cationi in soluzione acquosa. Ion Il Zr 4+ è altamente caricata, relativamente grande (efficace raggio ionico = 0,84 Å), e può essere classificato come un catione &quot;hard&quot;. Come tale, essa presenta una preferenza per ligandi recanti fino a otto dure, donatori di ossigeno anionici. Facilmente il chelante più comune utilizzato in 89 radioimmunoconjugates Zr-etichettati è deferoxamina (DFO), un sideroforo-derivato, chelante aciclico recanti tre gruppi idrossammato. Il legante coordina stabilmente il catione Zr 4+ rapido e pulito a RT a livelli di pH biologicamente rilevanti, e il risultante complesso Zr-DFO rimane stabile nel corso di diversi giorni in soluzione salina, siero di sangue, e sangue intero. 22 studi computazionali suggeriscono fortemente che DFO forma un complesso con hexacoordinate Zr 4+ in cui il centro metallico è coordinata ai tre neutral e tre donatori di ossigeno anionici del ligando e due leganti acqua esogeni (Figura 2). 23,24 Il comportamento in vivo della radioimmunoconjugates impiegano la coniugazione scaffold 89 Zr-deferoxamina stata generalmente eccellenti. Tuttavia, in alcuni casi, imaging e studi di biodistribuzione acuti hanno rivelato elevati livelli di attività nelle ossa di topi iniettati con 89 Zr-anticorpi marcati, dati che suggeriscono che il osteophilic 89 Zr 4+ catione viene rilasciato dal chelante in vivo e successivamente mineralizza nell&#39;osso. 25 Di recente, una serie di indagini lo sviluppo di nuovi 89 Zr 4+ chelanti ligandi particolare con otto donatori di ossigeno sono apparsi in letteratura. 24,26,27 Tuttavia, allo stato attuale, DFO è il chelante più ampiamente impiegato in 89 radioimmunoconjugates Zr-etichettato con un ampio margine. Una varietà di differentistrategie bioconjugation sono stati impiegati per collegare DFO ad anticorpi, inclusi bioorthogonal click chemistry, la reazione di tiolo reattivo DFO costruisce con cisteine ​​in l&#39;anticorpo, e la reazione dell&#39;estere attivato fruttiferi DFO costruisce con lisine nella anticorpi. 4,28- 30 Facilmente la strategia più comune, tuttavia, è stato l&#39;uso di un derivato isotiocianato-cuscinetto di DFO, DFO-NCS (Figura 2). 22 Questo chelante bifunzionale disponibile in commercio robusto e affidabile forma stabile, legami covalenti tiourea con lisine della anticorpo (Figura 3). Negli ultimi anni, una grande varietà di 89 radioimmunoconjugates Zr-DFO-marcati sono stati riportati in letteratura. Indagini preclinici sono stati particolarmente abbondanti, con anticorpi che vanno dal più noto cetuximab, bevacizumab, trastuzumab e di anticorpi più esoteriche come il-CD105 di targeting TRC105 e fPSA-targeting 5A10. 30-36 Più recentemente, un piccolo numero di studi clinici di fase precoce con 89 anticorpi Zr-DFO-marcati sono emerse in letteratura. Trials particolare, i gruppi in Olanda hanno pubblicato impiegano 89 Zr-DFO-cmAb U36, 89 Zr-DFO-ibritumomab tiuxetano, e 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Inoltre, una serie di altri studi clinici con 89 radioimmunoconjugates Zr-marcati sono attualmente in corso, comprese le indagini qui al Memorial Sloan Kettering Cancer Center utilizzando la PSMA-targeting 89 Zr-DFO-J591 per l&#39;imaging del cancro alla prostata e il 89 Zr-DFO-trastuzumab-HER2 di targeting per l&#39;imaging del cancro al seno. 23, 30 Inoltre, mentre gli anticorpi radioattivi restano i più comuni 89 radiofarmaci Zr-etichettati, il radiometalli ha sempre stato impiegato con altri vettori, tra cui peptidi, proteine ​​e nanomateriali. 38-43 </sup&gt; La modularità di questo 89 Zr-DFO metodologia di etichettatura è una risorsa enorme. Il repertorio di anticorpi-biomarker di targeting è in continua espansione, e l&#39;interesse per l&#39;esecuzione in PET vivo utilizzando questi costrutti sta crescendo rapidamente. Di conseguenza, riteniamo che lo sviluppo di pratiche più standardizzate e protocolli potrebbe beneficiare il campo. Un protocollo sperimentale eccellente scritto per deferoxamina-NCS coniugazione e 89 Zr radiomarcatura è già stato pubblicato da Vosjan, et al. 22 Riteniamo che la dimostrazione visiva fornita da questo lavoro potrebbe aiutare ulteriormente gli investigatori nuovi a queste tecniche. Nel protocollo a mano, l&#39;antigene di membrana rivolti anticorpi J591 prostatico specifico sarà utilizzato come sistema modello per illustrare (1) la bioconjugation del chelante bifunzionale DFO-isotiocianato di un anticorpo, (2) la radiosintesi e purificazione del 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate,e (3) in vivo PET con 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in un modello murino di cancro. 23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

L&#39;eccezionale affinità, specificità e selettività degli anticorpi li rendono vettori straordinariamente interessanti per i radiofarmaci PET tumorali mirati. Grazie alla loro più giorni biologica emivita, anticorpi devono essere etichettati con radionuclidi ad emissione di positroni con decadimento fisico emivita relativamente lunghi. Tradizionalmente, i-positroni emettitori isotopi 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 ore), e 64 Cu (t 1/2 = 12,7 ore) sono stati utilizzati per etichettare anticorpi per l&#39;imaging PET. Più recentemente, tuttavia, il campo è assistito ad un drammatico aumento dell&#39;uso della ad emissione di positroni radiometalli 89 Zr in agenti di imaging PET a base di anticorpi. 89 Zr è un radioisotopo quasi ideale per l&#39;imaging PET con immunoconiugati, in quanto possiede un mezzo fisico -Life (t 1/2 = 78,4 ore) che è compatibile con la farmacocinetica in vivo di anticorpi ed emette un relativamente basso enepositroni rgy che produce immagini ad alta risoluzione. Inoltre, gli anticorpi possono essere semplicemente etichettati con 89 Zr con il chelante deferoxamina sideroforo-derivato (DFO). In questo protocollo, l&#39;antigene di membrana rivolti anticorpi J591 prostatico specifico sarà utilizzato come sistema modello per illustrare (1) la bioconjugation del chelante bifunzionale DFO-isotiocianato di un anticorpo, (2) la radiosintesi e purificazione di un 89 ZR- DFO-mAb radioimmunoconjugate, e (3) in vivo di imaging PET con 89 Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in un modello murino di cancro.

Il primo passo in questo protocollo la coniugazione del DFO-NCS per l&#39;anticorpo è in genere abbastanza robusto e affidabile. Generalmente, purificato, immunoconiugato chelante modificato può essere ottenuta in&gt; 90% di resa, e con 3 equivalenti molari di DFO-NCS nella reazione iniziale coniugazione produrrà un gradi di etichettatura del chelante di circa 1,0-1,5 DFO / mAb. Le 89 Zr radiomarcatura e purificazione fasi della procedura sono altrettanto semplici. Alle concentrazioni indicate nel protocol...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Il bioconjugation e radiosintesi di<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpi Zr-DFO-etichettati

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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17.0K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Ispirato auto-assemblaggio di particelle Fantasia e riconfigurabile

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Ricerca

Chimica

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Una piattaforma basata FRET-compatibile ad alta-velocità per l&#39;identificazione e la caratterizzazione di neurotossina botulinica di luce modulatori catena

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-e-pool Sintesi e caratterizzazione di peptidi Terziario Ammide Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

Spettroscopia NMR come uno strumento robusto per la rapida valutazione del profilo lipidico di olio di pesce integratori

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...