Name: indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland
Uploaded: 2015-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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Gli autori sono grati per l&#39;impianto nucleo di imaging INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) e al personale dell&#39;unità IERP (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) per la cura degli animali e le strutture. Vorremmo anche ringraziare IH Mather, MC Neville e S. Tooze per averci fornito antibodie molto utile.

Topi CD1 sono stati allevati presso l&#39;INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Francia). Tutti gli aspetti etici della cura degli animali conformi alle relative linee guida ei requisiti di licenza stabiliti dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese. Le procedure utilizzate sono state approvate dal comitato locale di etica (accordo 12/097 dal Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. ghiandola mammaria preparazione del campione <ol><li> Mouse ghiandola mammaria dissezione <ol><li> Euthanize topi al giorno 10 di lattazione per dislocazione cervicale e appuntare l&#39;animale verso il basso con l&#39;addome rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Bagnare la zona ventrale con etanolo e asciugare con un tovagliolo di carta. </li><li> Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale tra le due zampe posteriori e fare un&#39;incisione (solo attraverso la pelle) di circa 1 cm con le forbici affilate. A partire da questa prima incisione, quindi utilizzare le forbici per tagliare la pelle fino al collo sul mouse. Tirare la pelle lontano dal peritoneo e pin lungo un lato della pelle alla volta, allungandolo insegnato. </li><li> Raccogliere il addominale e le inguinali ghiandole mammarie spingendole dalla pelle con un tampone e infine tirando o tagliando via dal peritoneo. Nota: In questo passaggio Carmine colorazione può essere eseguita per visualizzare l&#39;epitelio mammario entro tutta la ghiandola 43. Questo approccio può essere utile per analizzare la morfologia globale della ghiandola mammaria in varie condizioni fisiologiche (stadi di sviluppo, le malattie, in vivo trattamenti). </li><li> Togliere il linfonodo si trova all&#39;incrocio tra la addominale e le ghiandole inguinali 44. </li></ol></li><li> Fissaggio tessuto mammario <ol><li> Tagliare il tessuto mammario in 3 mm 3 frammenti con un bisturi e sciacquare immediatamente questi frammenti in una soluzione salina tampone fosfato (PBS), pH 7,4, al fine di eliminare il più possibile il latte. </li><li> Asciugare rapidamente i frammenti su una cartaasciugamano e metterli in una soluzione di PBS freddo contenente 4% paraformaldeide (PFA, HCHO, 32% soluzione di formaldeide, ATTENZIONE) per 10 a 15 minuti in ghiaccio. Nota: Questo è il tempo sufficiente per consentire la successiva analisi su sezioni di tessuto mammario da IIF36 e / o ibridazione in situ 45. Tuttavia, come fissativi aldeidi penetrano piuttosto lentamente a pezzi di tessuto (~ 1-3 mm per ora), questo può essere prorogato per garantire una fissazione ottimale del campione di tessuto. In alternativa, riparare i tessuti in vivo mediante perfusione un animale anestetizzato con una soluzione fissativa (non specificato nel presente studio). </li></ol></li><li> Infusione di saccarosio <ol><li> Sciacquare rapidamente i frammenti mammari in PBS freddo e immergerli in una soluzione PBS freddo contenente 40% di saccarosio (D-saccarosio, C12H22O11, Mr 342,3 g / mol) per 16 a 48 ore a 4 ° C sotto leggero scuotimento. </li></ol></li><li> Tissue incorporamento Nota: In questo passaggio, frammenti mammaria può essere ri-tagliata per rendere frammenti più piccoli (2-3 mm 3) O per regolare la loro forma. <ol><li> Correttamente etichettare gli stampi di plastica e riempire un terzo del volume dello stampo con OCT, mantenuta a RT. Mettere un frammento (2-3 mm 3) di tessuto mammario per stampo e coprire con mescola ottobre </li><li> Mettere gli stampi sulla superficie del azoto liquido (su un foglio di alluminio o usando un setaccio metallico) e lasciare il prodotto di congelare. Nota: Deve diventare solido e bianco prima di immergere lo stampo in azoto liquido. </li></ol></li><li> Conservare i campioni congelati a -80 ° C fino a quando vengono eseguite sezioni di tessuto. </li></ol> 2. congelato sezionamento dei tessuti Nota: Un criostato, che è essenzialmente un microtomo in freezer, è necessario fare sezioni di tessuto congelato. Una temperatura più bassa è spesso richiesto per i tessuti grassi o ricchi di lipidi, come ghiandola mammaria vergine. <ol><li> Regolare la temperatura del criostato a -26 ° C e attendere che si ha stabizato. Mantenere il blocco di tessuto congelato a -26 ° C durante l&#39;intera procedura di sezionamento. Evitare assolutamente scongelamento del tessuto in qualsiasi momento durante la procedura. </li><li> Raffreddare la lametta, supporto di taglio, il dispositivo anti-rollio ed il pennello a -26 ° C mettendoli in criostato per almeno 10 min. Anche mettere una casella scorrevole all&#39;interno del criostato per essere in grado di memorizzare vetrini delle sezioni sono fatti. </li><li> Correttamente etichettare i vetrini che verranno utilizzati per raccogliere le sezioni di tessuto e mantenerle a temperatura ambiente; altrimenti sezioni di tessuto non aderirvi. Togliere il campione dalla muffa all&#39;interno del criostato. Nota: Utilizzando vetrini con carica positiva notevolmente favorire l&#39;adesione delle sezioni di tessuto congelato fresche a causa della maggiore attrazione elettrostatica. </li><li> Coprire la superficie di un disco di tessuto metallico con OCT (mantenuta a RT) e spingere il campione congelato su di esso. Posizionare il bagnato montare all&#39;interno del criostato e lasciarlo coolo per almeno 15 minuti. </li><li> Posizionare il supporto bagnato nel supporto del disco del criostato. Regolare lo spessore del taglio di 5-6 micron e, se possibile, utilizzare un nuovo lama affilata o almeno modificare l&#39;area sulla lama utilizzata per tagliare ogni campione, poiché alcuni tessuti sarà rapidamente noioso. </li><li> Regolare la posizione del dispositivo anti-rollio sulla lama di rasoio mediante tagli del mezzo di montaggio fino a quando le fette sono formate in modo uniforme e corretto. Idealmente, il dispositivo anti-rollio si scavalcare la lama di rasoio di circa 1 mm. </li><li> Una volta che le impostazioni siano corrette, eseguire sezioni di tessuto girando la ruota in un movimento continuo uniforme. A meno che la temperatura è ideale, una sezione di tessuto sarà, per sua natura, cerca di rannicchiarsi. <ol><li> Utilizzare un pennello per afferrare e manovrare la sezione attraverso il palco in modo da mettere come desiderato sul vetrino. Utilizzare la spazzola per pulire i resti eventualmente presenti sul blocco tessuti congelati e / o la lama di rasoio. </li></ol></li><li> Tirarela sezione di tessuto verso l&#39;utente ed evitare premendolo sul palco criostato. Evitare di premere la sezione di tessuto sulla scena criostato in quanto può portare alla adesione della fetta del tessuto sulla scena, e quindi l&#39;impossibilità di recuperare con il vetrino. </li><li> Recupero sezioni di tessuto uno per uno prendendoli alla superficie di un vetrino, tenendolo sopra la sezione e inclinare fino a toccare la sezione di tessuto. Nota: Le sezioni di tessuto aderiscano rapidamente al vetro caldo a causa di attrazione statica. Se più sezioni di tessuto sono posti sullo stesso vetrino, fare attenzione a non sovrapporre loro e con lo spazio abbastanza per essere in grado di racchiuderli singolarmente in un cerchio idrofoba (vedi paragrafo 3.1.1.). </li></ol> 3. immunofluorescenza indiretta <ol><li> Individuazione sezioni <ol><li> Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio intorno al tessuto idrofobico montato-slide. Lasciate che il cerchio asciugare per circa 1 minuti a temperatura ambiente. Tracciare una linea intorno alla temissione sezioni con un pennarello indelebile nero fine così, ma sul lato del vetrino opposto a quello in cui le sezioni di tessuto sono. Nota: Questo cerchio è idrorepellente e acetone- e alcool-solubile. Si prevede quindi una barriera alle soluzioni acquose utilizzati durante la procedura IHC e riduce il volume dei reagenti richiesti. </li><li> Reidratare sezioni di tessuto coprendoli con una goccia di ~ 250 microlitri di PBS per alcuni minuti a temperatura ambiente. Fissare sezioni di tessuto coprendoli con ~ 250 ml di una soluzione PFA 3% appena preparato in PBS per 10 a 15 minuti. Nota: Facoltativamente in questo caso, utilizzare una soluzione di aldeide quenching (cloruro di ammonio 50 mM (NH 4 Cl, Mr 53,5 g / mol) in PBS 0,1 M glicina o (C 2 H 5 NO 2, Mr 75,07 g / mol) in PBS ) per arrestare la reazione di fissazione. Semplice e abbondante lavaggio PBS è generalmente sufficiente per eliminare l&#39;aldeide reagito. </li></ol></li><li> Recupero antigene (opzionale) <br/&gt; Nota: Mentre la maggior parte degli antigeni possono essere rilevati senza recupero dell&#39;antigene (AR), gli altri saranno osservati solo se viene eseguito questo passaggio. In alcuni casi, AR consente inoltre il potenziamento del segnale osservato. <ol><li> Posizionare la soluzione AR (Tris 100 mm (C 4 H 11 NO 3, il sig 121.14) 5% di urea (NH 2 CONH 2, il sig 60.06) pH 9.6) in un bicchiere. Il volume di soluzione AR deve essere sufficiente a coprire completamente i vetrini collocato in un supporto di vetro. </li><li> Preriscaldare la soluzione AR a 95 ° C controllando la temperatura con un termometro e quindi posizionare i vetrini in un rack adatto, immergere la cremagliera nel buffer caldo, copertura per limitare l&#39;evaporazione e incubare per 10 min a 95 ° C. </li><li> Rimuovere il becher dal bagnomaria e lasciare i vetrini per altri 10 min nel buffer. </li></ol></li><li> Immunolocalizzazione <ol><li> Risciacquare sezioni di tessuto con PBS (~ 250 microlitri / sezione) e saturare con una soluzione3% di albumina di siero bovino (BSA, ~ 250 microlitri / sezione) in PBS per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mettere 30-50 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS contenente 2% BSA in ogni sezione di tessuto. Nota: Questo volume è sufficiente per formare una goccia che copre completamente la sezione di tessuto. </li><li> Posizionare lo stesso volume di diluente (2% BSA in PBS) da solo su una sezione di tessuto per eseguire un controllo negativo senza anticorpo primario. <ol><li> Includere sistematicamente questo controllo negativo in ogni esperimento IHC ed eseguire per ciascun anticorpo secondario utilizzato per stimare lo sfondo dell&#39;esperimento (etichettatura non specifica dovuta alla anticorpo secondario e / o il tessuto auto-fluorescenza). Altri tipi di controlli positivi o negativi possono essere eseguite anche per garantire la specificità del etichettatura (vedi la discussione). </li></ol></li><li> Porre i vetrini in una scatola umidificata O / N a 4 ° C. Nota: Gli anticorpi primari utilizzati sono stati topo monoclonale anti-citocheratina8 (CK8, diluizione 1:50), mouse monoclonale anti-citocheratina 14 (CK14, diluizione 1:50), policlonale di coniglio caseina anti-topo (# 7781, 1:50 diluizione, generosamente fornito da MC Neville, dell&#39;Università del Colorado Salute Sciences Center, CO, USA), policlonale di coniglio anti-BTN1 (1: 300 di diluizione, generosamente fornito da IH Mather, Dipartimento di Scienze Animali e aviaria, University of Maryland, College Park, MD, USA), policlonale di coniglio anti-Stx6 ( 01:50 diluizione, generosamente fornito da S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, Londra, Regno Unito) e policlonale di coniglio anti-VAMP4 (diluizione 1:50). </li><li> Lavare accuratamente sezioni di tessuto con PBS almeno quattro volte per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario appropriata (IgG anti-coniglio di capra coniugato con rodamina (H + L), 1: 300 diluizione) in PBS contenente 2% BSA, posizionare 30-50 ml di questa soluzione in tutte le sezioni di tessuto, e incubare per 1,5 ore a RT. <ol><li> Poiché fluorocromi sono molecole sensibili alla luce, non lo fannoesporre sezioni di tessuto alla luce fino alla loro analisi. Per IFI su sezioni di tessuto, favorire anticorpi secondari accoppiati a un fluoroforo rosso da membrane cellulari tendono a generare un auto-fluorescenza verde che possono interferire con basso etichettatura. Inoltre, la scelta di un anticorpo secondario fluoroforo accoppiati rosso permette l&#39;etichettatura concomitante di lipidi neutri (vedi sotto). </li></ol></li><li> Lavare accuratamente le sezioni di tessuto con PBS almeno quattro volte per 10 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Post-fissaggio (opzionale) <ol><li> Per alcuni esperimenti, eseguire post-fissazione incubando i campioni con 2% PFA diluito in PBS per 10 minuti a RT per stabilizzare i ponteggi antigene / anticorpo. Tuttavia, questo passo può essere soppressa in molti casi. </li></ol></li><li> Lipidi neutri e di contrasto del DNA <ol><li> Per visualizzare CLD e MFGs, colore lipidi neutri incubando sezioni di tessuto in 30-50 ml di una soluzione PBS contenente 3 mg / ml di BODIPY 493/ 503 per 10 minuti a RT. Rapidamente sciacquare sezioni di tessuto due volte con PBS. </li><li> Controcolorare DNA nucleare con 30-50 ml di una soluzione di PBS contenente 3 mM di DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, 5 mg / ml soluzione madre) per 10 minuti a RT. Lavare le sezioni di tessuto due volte con PBS prima del montaggio dei vetrini per l&#39;osservazione. </li></ol></li><li> Montaggio Sezione <ol><li> Rimuovere PBS e una goccia di mezzo di montaggio per ogni sezione di tessuto. </li><li> Collocare un lato del vetrino ad un angolo contro la slitta, il contatto con il bordo esterno della goccia liquido e abbassare il coperchio lentamente, evitare bolle d&#39;aria. Lasciare che il liquido per diffondere tra il vetrino e vetrino per alcuni minuti e poi rimuovere l&#39;eccesso di mezzo di montaggio con un tovagliolo di carta. </li><li> Sigillare la polizza di copertura al vetrino con le sezioni smalto e del tessuto conservare a 4 ° C per impedire la loro esposizione alla luce fino osservazione. </li></ol></li></ol>4. Fluorescenza Osservazione e Image Acquisition Nota: Un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera controllato dal software di acquisizione immagini è tenuto ad osservare i risultati IHC. <ol><li> Prima di acquisire immagini, controllare l&#39;intensità della etichettatura e valutare il fondo dell&#39;esperimento, cercando in controlli negativi. Acquisire le immagini di ciascuna etichetta fluorescente (canale di colore) individualmente. </li><li> Acquisire tutte le immagini, compresi quelli dei controlli corrispondenti, nelle stesse condizioni (esposizione e le impostazioni generali) per ogni canale di colore. </li><li> Microscopia convenzionale <ol><li> Eseguire epifluorescenza con un microscopio dotato di filtri standard per isotiocianato di fluorescina (FITC, verde), rodamina (rosso) e DAPI (blu) emissioni, × 20 × 63 (-immersione in olio, NA 1.3) obiettivi e una telecamera ad DP50. </li></ol></li><li> Microscopia confocale </li><li> Eseguire la microscopia confocale con un micropiviale equipaggiata con il software ZEN, utilizzando × 20 × 63 a (-immersione in olio, NA 1.4) gli obiettivi e le 488- e 568 nm di eccitazione lunghezze d&#39;onda del laser. </li></ol> Trattamento 5. Immagine Nota: Tutte le immagini post-trattamenti vengono eseguiti utilizzando il software gratuito ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Sovrapporre immagine (merge) <ol><li> Aprire le immagini acquisite in ogni canale che verrà combinato (File / Apri). Se si lavora con 8 bit in scala di grigi, attribuire colore artificiale per ciascun canale utilizzando la tabella di ricerca (tabelle di immagine / di ricerca). </li><li> Generare il quadro composito da immagini in scala di grigi o colorati utilizzando il comando &quot;Unisci i canali&quot; (Immagine / colori / Merge Canali) e poi attribuire un colore per ogni canale. </li><li> Eseguire immagine pile sovrapposizione nello stesso modo, aprendo pile acquisite in ogni canale che verrà combinato (File / Apri) e utilizzando il comando &quot;Unisci canali &amp;# 8221; (Immagine / colori / Merge Canali) per attribuire un colore per ogni canale. Salvare lo stack composita come una sequenza di immagini o come un film (vedi paragrafo 5.4). </li></ol></li><li> Immagine pila Z proiezione <ol><li> Utilizzare la funzione Z di proiezione (Immagine / Pila / Zproject, intensità massima) per fornire una visione a due dimensioni di tutte le immagini di una serie di immagini da proiettandole lungo l&#39;asse perpendicolare al piano dell&#39;immagine (asse z). L&#39;opzione &quot;Maximum Intensity&quot; crea un&#39;immagine in cui ogni pixel contiene il valore massimo su tutte le immagini della pila. Ciò genera una singola immagine che permette la visualizzazione di tutti i colorazione osservata attraverso l&#39;intera serie di immagini per un particolare canale o dopo la sovrapposizione di più canali. </li></ol></li><li> Immagine proiezione abbinata 3D <ol><li> Utilizzare il comando di proiezione 3D (progetto Immagine / Pila / 3D, più luminoso Point, asse y) per generare una sequenza di proiezioni di un volume rotante su un piano. La resa visiva di surfaces e le strutture interne dipende sia il metodo di proiezione (più vicino punto, punto più luminoso (usato qui), o valore medio-) ed i parametri di visualizzazione selezionati. Ogni frame della sequenza animata è il risultato di sbalzo da un diverso angolo di visualizzazione. </li><li> Ruotare l&#39;immagine creata in 3D intorno a ciascuno dei tre assi ortogonali (l&#39;asse y è stato qui selezionato). Salvare la sequenza di prodotto come una singola immagine o un filmato. </li></ol></li><li> Serie di immagini per la conversione di film <ol><li> Aprire una serie di immagini (File / Apri) e salvarlo come un film in formato .AVI utilizzando il comando &quot;AVI&quot; (File / Salva con nome / AVI). </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

IHC è un metodo relativamente semplice e diretto sperimentale di localizzare l&#39;antigene in sezioni di tessuto, che dipende principalmente sulle specifiche interazioni epitopi-anticorpo. Anche se un gran numero di protocolli sono utilizzati per localizzare una proteina IIF, il nucleo di queste procedure è quasi sempre la stessa. Tuttavia, vi sono alcuni aspetti critici che possono influenzare fortemente il risultato e deve quindi essere ottimizzati per ciascuno studio individuale IHC. L&#39;aspetto più impegnativo...

La ghiandola mammaria è un atipico organo esocrina mammiferi la cui principale funzione è quella di produrre latte per nutrire i neonati. Lo sviluppo del tessuto mammario si verifica soprattutto dopo la nascita ed è caratterizzata da un processo unico in cui l&#39;epitelio invade lo stroma circostante. Questo tessuto subisce molti cambiamenti (crescita, differenziazione e regressione), soprattutto durante la vita adulta, in concomitanza con variazioni di stato riproduttivo (Figura 1). Oltre alla morfologia generale del tessuto, le proporzioni dei vari tipi di cellule, nonché la loro disposizione all&#39;interno della ghiandola mammaria cambiare radicalmente durante lo sviluppo 1-5. Durante la vita embrionale, l&#39;epitelio mammario deriva da linee latte mammarie, che è definita da un lieve ispessimento e stratificazione della ectoderma, tra gli arti anteriori e posteriori su ciascun lato della linea mediana intorno al giorno embrionale 10.5 (E10.5) (Figura 1A ).Sulla E11.5, la linea del latte scompone in singoli placodi, simmetricamente posizionati lungo la linea di latte mammaria in posizioni riproducibili, e il mesenchima circostante inizia a condensare. I placodi cominciano ad affondare più in profondità nel derma e mesenchima mammaria organizza a strati concentrici intorno al bocciolo mammaria (E12.5-E14.5). A partire dal E15.5, dell&#39;epitelio mammario, comincia a proliferare e allungare a formare il germoglio principale che spinge attraverso il mesenchima mammaria verso il cuscinetto adiposo. Il germoglio primario sviluppa un lume cavo con un&#39;apertura per la pelle, contrassegnata dalla formazione della guaina capezzolo. Sul E18.5, il condotto di allungamento è diventato il cuscinetto adiposo e si è ramificata in un piccolo sistema duttale arborized inglobato nel cuscinetto adiposo. Lo sviluppo è essenzialmente arrestato e la ghiandola mammaria rudimentale rimane morphogenetically quiescente fino alla pubertà. Nel embrione maschio, l&#39;attivazione dei recettori degli androgeni porta alla degenerazione dei germogli, che scompaionoda E15.5. Come di E18, sviluppo mammario cessa fino alla pubertà 6-9. Alla nascita, la ghiandola mammaria ospita un sistema duttale rudimentale che allunga e rami lentamente (una crescita isometrica). All&#39;inizio della pubertà, strutture sferiche situate alle estremità dei condotti chiamati gemme estremità terminale (TEBS), sono formate da uno strato esterno di cellule del cappuccio e un nucleo interno multistrato di cellule (cellule del corpo). Queste strutture sono altamente proliferative e infiltrano il tessuto stromale circostante in risposta a stimoli ormonali. La proliferazione all&#39;interno dei risultati TEBS in allungamento duttale, accoppiato con ramificazione morfogenesi. Questo processo porta alla creazione di una rete arborized epiteliale di base che emana dal capezzolo (Figura 1B, pubertà). A ~ 10-12 settimane dopo la nascita, quando l&#39;epitelio ha invaso tutto il cuscinetto di grasso, la sua espansione si arresta e il TEBS scomparire. Sviluppo duttale subisce quindi cambiamenti dinamici, vale a dire, successive la proliferazione e la regressione delle cellule epiteliali secondo cicli estrali 10 (Figura 1B, adulti). Dall&#39;inizio di gestazione, il tessuto mammario subisce importante crescita e cambiamenti morfologici per preparare l&#39;allattamento. L&#39;epitelio mammario ampiamente proliferano e differenziare, portando ad una ramificata rete altamente tubulo-alveolari. Allo stesso tempo, le cellule epiteliali mammarie (MECS) diventano polarizzata e in grado di sintetizzare e secernere prodotti lattiero-caseari. MECs organizzano in numerose strutture alveolari (acini), che sono circondati da cellule mioepiteliali contrattili e incorporati in uno stroma composta da tessuto connettivo e adiposo, vasi sanguigni e terminazioni nervose (Figura 1B, gravidanza). Inoltre, il lato basale MECs è in stretto contatto con la membrana basale (matrice extracellulare) e le interazioni tra queste due entità strettamente regolano sia la funzione morfogenesi e secretoria della mammellary epitelio 11-13. Tutti questi processi si basano sull&#39;azione di vari segnali ambientali, di cui i più importanti sono hormones14, fattori paracrini e la matrice extracellulare. Ad esempio, progesterone induce vasta ramificazione laterale 15 e alveologenesis che, in combinazione con prolattina (PRL) 16,17, promuove e mantiene la differenziazione degli alveoli. Oltre a steroidi e PRL18, citochine e vie di segnalazione associate allo sviluppo (Wnt e Notch vie di segnalazione) sono anche coinvolti nell&#39;impegno lignaggio mammaria e di sviluppo 19-21. Al termine della gravidanza, i MECs luminali iniziano a produrre un latte ricco di proteina nota come colostro nel lume degli alveoli. Inoltre, il progesterone agisce sulla permeabilità epiteliale e dato che le giunzioni strette sono ancora aperte, il colostro si trova anche nel sangue materno. Dopo il parto, il Mammary epitelio occupa quasi tutto il volume della ghiandola mammaria e è altamente organizzato (Figura 2, mammario). Unità latte produzione, ovvero alveoli (Figura 2, alveoli), sono formate da un monostrato di polarizzati mammarie epiteliali cellule secretorie (MESCs), con la loro membrana plasmatica apicale delimita il lume. Alveoli si dispongono in lobuli che sono raggruppati in lobi collegati a condotti che drenano il latte con l&#39;ambiente esterno (Figura 2, del lobo). Allattamento si verifica, ad esempio., MESCs iniziano a secernere abbondanti quantità di latte, innescato principalmente dal calo di ormoni della placenta (principalmente progesterone) (Figura 1B, allattamento). Geni delle proteine ​​del latte sono attivati ​​in un corso a tempo temporale definito che va dalla gravidanza al allattamento 9,22,23, soprattutto in risposta a ipofisaria PRL rilasciato al momento dell&#39;allattamento. Allo stesso tempo, i contatti tra MESCs e la matrice extracellulare, sia stimolano proteine ​​del latte syntESI attraverso i segnali che sono mediati attraverso le interazioni tra integrine e laminina 24,25 cellulari, e sopprimono l&#39;apoptosi in MESCs 26,27. Queste vie di segnalazione provocano l&#39;attivazione di proteine ​​del latte gene promoters 28 attraverso l&#39;attivazione della trascrizione specifici fattori di 29. Contatti cellula-cellula sono importanti anche per alcuni aspetti della differenziazione tra cui l&#39;istituzione della polarità apicale e la secrezione vettoriale di prodotti lattiero-caseari. Giunzioni strette rapidamente stretti dopo l&#39;inizio della lattazione e MESCs finemente orchestrano l&#39;assorbimento di molecole dal sangue così come la sintesi, il trasporto e la secrezione di componenti del latte, in risposta alle esigenze nutrizionali dei neonati. Al momento della suzione, la contrazione delle cellule mioepiteliali circondano gli alveoli si verifica in risposta a ossitocina e porta alla emissione del latte attraverso i condotti e nel capezzolo. Il latte è un liquido che contiene proteine ​​complessa (principalmentecaseine), zuccheri (principalmente lattosio), lipidi e minerali, come pure molecole bioattive come immunoglobuline A (IgA), fattori di crescita e ormoni. Sono sintetizzati caseine, assemblati in strutture supramolecolari, ossia micelle di caseina, trasportate lungo la via secretoria, e poi rilasciato per esocitosi, cioè, la fusione delle vescicole secretorie-caseina contenente (SV) con la membrana plasmatica apicale di MESC (Figura 2). Traffico intracellulare si basa su scambi materiali tra compartimenti membranose e coinvolge solubile N-ethylmaleimide sensibile Fusion (NSF) Allegato Protein (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. La famiglia delle proteine ​​SNARE è suddivisa in SNAREs vescicolari (v-lacci), presenti nella membrana della vescicola e SNAREs bersaglio (t-lacci), localizzati sulle membrane di destinazione. Con sfreccia tra loro domini coiled-coil, V e t-SNARE assemblare per formare un complesso altamente stabile fascio quattro elica, indicati come thcomplesso SNARE e. Questo complesso promuove la fusione di due doppi strati lipidici opposti gradualmente portarli in prossimità 30,32. In seguito, i complessi SNARE sono dissociate dalla adenosina trifosfatasi NSF e le sue proteine ​​adattatore Snap e SNARE proteine ​​sono riciclati di nuovo al loro compartimento di origine 33. È interessante notare che, ogni proteina SNARE risiede prevalentemente in compartimenti cellulari distinti e rullante accoppiamento possono contribuire alla specificità degli eventi di fusione intracellulari 34. Precedenti studi suggeriscono che almeno Protein 23 (SNAP23) e vescicole associata a membrana di proteine ​​8 (VAMP8), e sintaxine (Stx) sinaptosomiali associata -7 e -12 svolgono un ruolo nella caseina esocitosi 35,36. Queste proteine ​​sono state trovate anche in associazione con la frazione lipidica del latte, vale a dire, di grasso del latte (globuli MFGs) 37. Il modello prevalente corrente postula che gocce lipidiche citoplasmatici (CLD) sono formati dall&#39;accumulo di l neutroipids (soprattutto trigliceridi ed esteri di steroli) e colesterolo deriva dalla dieta materna tra i due volantini del reticolo endoplasmatico (ER) membrane 38-41. Grandi CLD si formano, almeno in parte, dalla fusione di CLD piccole mentre viene trasportato al lato apicale MESCs dove vengono rilasciati come MFGs (1-10 micron di diametro) per gemmazione, essendo avvolto dalla membrana plasmatica apicale MESC 40-42. Allattamento cessa dopo cuccioli sono svezzati e le MESCs progressivamente muoiono per apoptosi, che porta alla regressione del tessuto mammario a uno stato puberale (Figura 1B, involuzione). Immunofluorescenza (IF) è un metodo di laboratorio di analisi comune usato in quasi tutti gli aspetti della biologia, sia nella ricerca e nella diagnostica clinica. SE tecniche possono essere eseguite su sezioni di tessuto (immunoistochimica, IHC) o cellulari (immunocitochimica, ICC) campioni. Questo approccio potente si basa sull&#39;utilizzo di fluorescente-anticorpi marcati che specificamente si legano (direttamente o indirettamente) all&#39;antigene di interesse, permettendo così la visualizzazione della sua distribuzione tissutale tramite microscopia a fluorescenza. Segnali di fluorescenza per lo più dipendono dalla qualità e la concentrazione degli anticorpi e corretta manipolazione del campione. Un protocollo semplice immunofluorescenza indiretta (IIF) viene presentato per rilevare prodotti lattiero-caseari (caseine e MFGs) e proteine ​​coinvolte nella secrezione di prodotti lattiero-caseari (butirofilina (BTN1), rullante proteine) su sezioni congelate di tessuto mammario del mouse (Figura 3). Anche se questo protocollo offre una panoramica completa IHC, che vanno dalla raccolta di tessuto per l&#39;immagine dopo il trattamento, critica e passaggi facoltativi, nonché alcune raccomandazioni tecniche vengono anche presentati e discussi.

<table><tbody><tr><td>Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel and adapted blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Towel paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue sample preparation</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td></tr><tr><td>OCT compound/Tissue Tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (D-saccharose)</td><td>VWR</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Plastic molds</td><td>Dominique Dutscher</td><td>39910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat/sample support</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades (SEC35)</td><td>Thermo Scientific</td><td>152200</td><td></td></tr><tr><td>Slide box</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143560W90/1014356190</td><td></td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IHC</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Permanent marker (black)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl in PBS</td><td>Sigma</td><td>A-0171</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M glycine in PBS</td><td>VWR</td><td>24403.367</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater (up to 100&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000/H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td><td>VWR</td><td>CORN2980-225</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td><td>generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences&lt;br/&gt; Center, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td><td>Biolegend (Covance)</td><td>MMS-162P</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-115-P0/P1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td><td>generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td><td>generously gifted S. Tooze&lt;br/&gt; (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td><td>Abcam</td><td>ab3348</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-025-003</td><td></td></tr><tr><td>Counterstains</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Life Technologies (Molecular Probes)</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Observation/Image capture</td><td>&lt;span style=&quot;line-height: 20.8px;&quot;&gt;Company&lt;/span&gt;</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>conventional fluorescence microscope</td><td>Leica Leitz DMRB&lt;br/&gt; microscope</td><td></td><td>Standard filters for FITC, Rhodamine&lt;br/&gt; and DAPI emissions,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&amp;circ;F software (Olympus)</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td><td>Zeiss LSM&lt;br/&gt; 510 microscope</td><td></td><td>Plan-Apochromat &amp;times;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CLSM 510 software,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td></tr><tr><td>Image treatment</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>ImageJ 1.49k software</td><td></td><td></td><td>Free software</td></tr></tbody></table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

L&#39;immunofluorescenza indiretta è utilizzato per rilevare e localizzare le proteine ​​di interesse in un tessuto. Il protocollo qui presentato descrive un metodo semplice e completo per la rilevazione di proteine ​​immunitario, mouse allattamento ghiandola mammaria essere preso come esempio. Un protocollo per la preparazione dei campioni di tessuto, soprattutto per quanto riguarda la dissezione del mouse di ghiandola mammaria, la fissazione dei tessuti e sezionamento tessuti congelati, sono dettagliati. Un protocollo standard per eseguire immunofluorescenza indiretta, tra cui un passo di recupero dell&#39;antigene opzionale, è anche presentato. L&#39;osservazione delle sezioni di tessuto etichettati così come l&#39;acquisizione di immagini e post-trattamenti sono anche indicati. Questa procedura fornisce una panoramica completa, dalla raccolta di tessuto animale per la localizzazione cellulare di una proteina. Anche se questo metodo generale può essere applicato ad altri campioni di tessuto, deve essere adattato ad ogni coppia anticorpo tessuto / primary studiato.

La ghiandola mammaria è una ghiandola sottocutanea situato lungo la struttura ventrale sia del torace e dell&#39;addome nei roditori. La posizione dei cinque coppie di ghiandole del mouse durante la gestazione è mostrata in Figura 4. La morfologia della ghiandola mammaria cambia drasticamente durante il suo sviluppo, riflettendo modifiche funzionali richieste per prepararsi alla piena lattazione (Figura 1B). Negli animali vergini o nullipare, la ghiandola...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l&#39;immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  INRA.  Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini. 

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Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Biologia

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Analisi delle interazioni proteine-proteine ​​e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Biologia dello sviluppo

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play a major role in mammary gland function and are the origin of most mammary tumors. Introducing genes of interest into mouse mammary epithelial cells is a critical step in evaluating gene function in epithelial cells and generating mouse mammary tumor models. This goal can be accomplished through the intraductal injection of a viral vector carrying the genes of interest into the mouse mammary ductal tree. The injected virus subsequently infects mammary epithelial cells, bringing in the genes of interest. The viral vector can be lentiviral, retroviral, adenoviral, or adenovirus-associated viral (AAV). This study demonstrates how a gene of interest is delivered into mammary epithelial cells through mouse mammary intraductal injection of a viral vector. A lentivirus carrying GFP is used to show stable expression of a delivered gene, and a retrovirus carrying Erbb2 (HER2/Neu) is used to demonstrate oncogene-induced atypical hyperplastic lesions and mammary tumors.

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

The present protocol describes intraductal injection of viral vectors via the teat to deliver genes of interest into the mammary epithelial cells.

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Immunologia e infezioni

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

Analisi delle interazioni proteine-proteine e co-localizzazione tra i componenti di giunzione, stretti e giunti aderenti in ghiandole mammarie murine

In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

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Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

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