Gli autori sono grati per l&#39;impianto nucleo di imaging INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) e al personale dell&#39;unità IERP (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) per la cura degli animali e le strutture. Vorremmo anche ringraziare IH Mather, MC Neville e S. Tooze per averci fornito antibodie molto utile.

Topi CD1 sono stati allevati presso l&#39;INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Francia). Tutti gli aspetti etici della cura degli animali conformi alle relative linee guida ei requisiti di licenza stabiliti dal Ministero dell&#39;Agricoltura francese. Le procedure utilizzate sono state approvate dal comitato locale di etica (accordo 12/097 dal Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. ghiandola mammaria preparazione del campione <ol><li> Mouse ghiandola mammaria dissezione <ol><li> Euthanize topi al giorno 10 di lattazione per dislocazione cervicale e appuntare l&#39;animale verso il basso con l&#39;addome rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Bagnare la zona ventrale con etanolo e asciugare con un tovagliolo di carta. </li><li> Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale tra le due zampe posteriori e fare un&#39;incisione (solo attraverso la pelle) di circa 1 cm con le forbici affilate. A partire da questa prima incisione, quindi utilizzare le forbici per tagliare la pelle fino al collo sul mouse. Tirare la pelle lontano dal peritoneo e pin lungo un lato della pelle alla volta, allungandolo insegnato. </li><li> Raccogliere il addominale e le inguinali ghiandole mammarie spingendole dalla pelle con un tampone e infine tirando o tagliando via dal peritoneo. Nota: In questo passaggio Carmine colorazione può essere eseguita per visualizzare l&#39;epitelio mammario entro tutta la ghiandola 43. Questo approccio può essere utile per analizzare la morfologia globale della ghiandola mammaria in varie condizioni fisiologiche (stadi di sviluppo, le malattie, in vivo trattamenti). </li><li> Togliere il linfonodo si trova all&#39;incrocio tra la addominale e le ghiandole inguinali 44. </li></ol></li><li> Fissaggio tessuto mammario <ol><li> Tagliare il tessuto mammario in 3 mm 3 frammenti con un bisturi e sciacquare immediatamente questi frammenti in una soluzione salina tampone fosfato (PBS), pH 7,4, al fine di eliminare il più possibile il latte. </li><li> Asciugare rapidamente i frammenti su una cartaasciugamano e metterli in una soluzione di PBS freddo contenente 4% paraformaldeide (PFA, HCHO, 32% soluzione di formaldeide, ATTENZIONE) per 10 a 15 minuti in ghiaccio. Nota: Questo è il tempo sufficiente per consentire la successiva analisi su sezioni di tessuto mammario da IIF36 e / o ibridazione in situ 45. Tuttavia, come fissativi aldeidi penetrano piuttosto lentamente a pezzi di tessuto (~ 1-3 mm per ora), questo può essere prorogato per garantire una fissazione ottimale del campione di tessuto. In alternativa, riparare i tessuti in vivo mediante perfusione un animale anestetizzato con una soluzione fissativa (non specificato nel presente studio). </li></ol></li><li> Infusione di saccarosio <ol><li> Sciacquare rapidamente i frammenti mammari in PBS freddo e immergerli in una soluzione PBS freddo contenente 40% di saccarosio (D-saccarosio, C12H22O11, Mr 342,3 g / mol) per 16 a 48 ore a 4 ° C sotto leggero scuotimento. </li></ol></li><li> Tissue incorporamento Nota: In questo passaggio, frammenti mammaria può essere ri-tagliata per rendere frammenti più piccoli (2-3 mm 3) O per regolare la loro forma. <ol><li> Correttamente etichettare gli stampi di plastica e riempire un terzo del volume dello stampo con OCT, mantenuta a RT. Mettere un frammento (2-3 mm 3) di tessuto mammario per stampo e coprire con mescola ottobre </li><li> Mettere gli stampi sulla superficie del azoto liquido (su un foglio di alluminio o usando un setaccio metallico) e lasciare il prodotto di congelare. Nota: Deve diventare solido e bianco prima di immergere lo stampo in azoto liquido. </li></ol></li><li> Conservare i campioni congelati a -80 ° C fino a quando vengono eseguite sezioni di tessuto. </li></ol> 2. congelato sezionamento dei tessuti Nota: Un criostato, che è essenzialmente un microtomo in freezer, è necessario fare sezioni di tessuto congelato. Una temperatura più bassa è spesso richiesto per i tessuti grassi o ricchi di lipidi, come ghiandola mammaria vergine. <ol><li> Regolare la temperatura del criostato a -26 ° C e attendere che si ha stabizato. Mantenere il blocco di tessuto congelato a -26 ° C durante l&#39;intera procedura di sezionamento. Evitare assolutamente scongelamento del tessuto in qualsiasi momento durante la procedura. </li><li> Raffreddare la lametta, supporto di taglio, il dispositivo anti-rollio ed il pennello a -26 ° C mettendoli in criostato per almeno 10 min. Anche mettere una casella scorrevole all&#39;interno del criostato per essere in grado di memorizzare vetrini delle sezioni sono fatti. </li><li> Correttamente etichettare i vetrini che verranno utilizzati per raccogliere le sezioni di tessuto e mantenerle a temperatura ambiente; altrimenti sezioni di tessuto non aderirvi. Togliere il campione dalla muffa all&#39;interno del criostato. Nota: Utilizzando vetrini con carica positiva notevolmente favorire l&#39;adesione delle sezioni di tessuto congelato fresche a causa della maggiore attrazione elettrostatica. </li><li> Coprire la superficie di un disco di tessuto metallico con OCT (mantenuta a RT) e spingere il campione congelato su di esso. Posizionare il bagnato montare all&#39;interno del criostato e lasciarlo coolo per almeno 15 minuti. </li><li> Posizionare il supporto bagnato nel supporto del disco del criostato. Regolare lo spessore del taglio di 5-6 micron e, se possibile, utilizzare un nuovo lama affilata o almeno modificare l&#39;area sulla lama utilizzata per tagliare ogni campione, poiché alcuni tessuti sarà rapidamente noioso. </li><li> Regolare la posizione del dispositivo anti-rollio sulla lama di rasoio mediante tagli del mezzo di montaggio fino a quando le fette sono formate in modo uniforme e corretto. Idealmente, il dispositivo anti-rollio si scavalcare la lama di rasoio di circa 1 mm. </li><li> Una volta che le impostazioni siano corrette, eseguire sezioni di tessuto girando la ruota in un movimento continuo uniforme. A meno che la temperatura è ideale, una sezione di tessuto sarà, per sua natura, cerca di rannicchiarsi. <ol><li> Utilizzare un pennello per afferrare e manovrare la sezione attraverso il palco in modo da mettere come desiderato sul vetrino. Utilizzare la spazzola per pulire i resti eventualmente presenti sul blocco tessuti congelati e / o la lama di rasoio. </li></ol></li><li> Tirarela sezione di tessuto verso l&#39;utente ed evitare premendolo sul palco criostato. Evitare di premere la sezione di tessuto sulla scena criostato in quanto può portare alla adesione della fetta del tessuto sulla scena, e quindi l&#39;impossibilità di recuperare con il vetrino. </li><li> Recupero sezioni di tessuto uno per uno prendendoli alla superficie di un vetrino, tenendolo sopra la sezione e inclinare fino a toccare la sezione di tessuto. Nota: Le sezioni di tessuto aderiscano rapidamente al vetro caldo a causa di attrazione statica. Se più sezioni di tessuto sono posti sullo stesso vetrino, fare attenzione a non sovrapporre loro e con lo spazio abbastanza per essere in grado di racchiuderli singolarmente in un cerchio idrofoba (vedi paragrafo 3.1.1.). </li></ol> 3. immunofluorescenza indiretta <ol><li> Individuazione sezioni <ol><li> Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio intorno al tessuto idrofobico montato-slide. Lasciate che il cerchio asciugare per circa 1 minuti a temperatura ambiente. Tracciare una linea intorno alla temissione sezioni con un pennarello indelebile nero fine così, ma sul lato del vetrino opposto a quello in cui le sezioni di tessuto sono. Nota: Questo cerchio è idrorepellente e acetone- e alcool-solubile. Si prevede quindi una barriera alle soluzioni acquose utilizzati durante la procedura IHC e riduce il volume dei reagenti richiesti. </li><li> Reidratare sezioni di tessuto coprendoli con una goccia di ~ 250 microlitri di PBS per alcuni minuti a temperatura ambiente. Fissare sezioni di tessuto coprendoli con ~ 250 ml di una soluzione PFA 3% appena preparato in PBS per 10 a 15 minuti. Nota: Facoltativamente in questo caso, utilizzare una soluzione di aldeide quenching (cloruro di ammonio 50 mM (NH 4 Cl, Mr 53,5 g / mol) in PBS 0,1 M glicina o (C 2 H 5 NO 2, Mr 75,07 g / mol) in PBS ) per arrestare la reazione di fissazione. Semplice e abbondante lavaggio PBS è generalmente sufficiente per eliminare l&#39;aldeide reagito. </li></ol></li><li> Recupero antigene (opzionale) <br/&gt; Nota: Mentre la maggior parte degli antigeni possono essere rilevati senza recupero dell&#39;antigene (AR), gli altri saranno osservati solo se viene eseguito questo passaggio. In alcuni casi, AR consente inoltre il potenziamento del segnale osservato. <ol><li> Posizionare la soluzione AR (Tris 100 mm (C 4 H 11 NO 3, il sig 121.14) 5% di urea (NH 2 CONH 2, il sig 60.06) pH 9.6) in un bicchiere. Il volume di soluzione AR deve essere sufficiente a coprire completamente i vetrini collocato in un supporto di vetro. </li><li> Preriscaldare la soluzione AR a 95 ° C controllando la temperatura con un termometro e quindi posizionare i vetrini in un rack adatto, immergere la cremagliera nel buffer caldo, copertura per limitare l&#39;evaporazione e incubare per 10 min a 95 ° C. </li><li> Rimuovere il becher dal bagnomaria e lasciare i vetrini per altri 10 min nel buffer. </li></ol></li><li> Immunolocalizzazione <ol><li> Risciacquare sezioni di tessuto con PBS (~ 250 microlitri / sezione) e saturare con una soluzione3% di albumina di siero bovino (BSA, ~ 250 microlitri / sezione) in PBS per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mettere 30-50 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS contenente 2% BSA in ogni sezione di tessuto. Nota: Questo volume è sufficiente per formare una goccia che copre completamente la sezione di tessuto. </li><li> Posizionare lo stesso volume di diluente (2% BSA in PBS) da solo su una sezione di tessuto per eseguire un controllo negativo senza anticorpo primario. <ol><li> Includere sistematicamente questo controllo negativo in ogni esperimento IHC ed eseguire per ciascun anticorpo secondario utilizzato per stimare lo sfondo dell&#39;esperimento (etichettatura non specifica dovuta alla anticorpo secondario e / o il tessuto auto-fluorescenza). Altri tipi di controlli positivi o negativi possono essere eseguite anche per garantire la specificità del etichettatura (vedi la discussione). </li></ol></li><li> Porre i vetrini in una scatola umidificata O / N a 4 ° C. Nota: Gli anticorpi primari utilizzati sono stati topo monoclonale anti-citocheratina8 (CK8, diluizione 1:50), mouse monoclonale anti-citocheratina 14 (CK14, diluizione 1:50), policlonale di coniglio caseina anti-topo (# 7781, 1:50 diluizione, generosamente fornito da MC Neville, dell&#39;Università del Colorado Salute Sciences Center, CO, USA), policlonale di coniglio anti-BTN1 (1: 300 di diluizione, generosamente fornito da IH Mather, Dipartimento di Scienze Animali e aviaria, University of Maryland, College Park, MD, USA), policlonale di coniglio anti-Stx6 ( 01:50 diluizione, generosamente fornito da S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, Londra, Regno Unito) e policlonale di coniglio anti-VAMP4 (diluizione 1:50). </li><li> Lavare accuratamente sezioni di tessuto con PBS almeno quattro volte per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario appropriata (IgG anti-coniglio di capra coniugato con rodamina (H + L), 1: 300 diluizione) in PBS contenente 2% BSA, posizionare 30-50 ml di questa soluzione in tutte le sezioni di tessuto, e incubare per 1,5 ore a RT. <ol><li> Poiché fluorocromi sono molecole sensibili alla luce, non lo fannoesporre sezioni di tessuto alla luce fino alla loro analisi. Per IFI su sezioni di tessuto, favorire anticorpi secondari accoppiati a un fluoroforo rosso da membrane cellulari tendono a generare un auto-fluorescenza verde che possono interferire con basso etichettatura. Inoltre, la scelta di un anticorpo secondario fluoroforo accoppiati rosso permette l&#39;etichettatura concomitante di lipidi neutri (vedi sotto). </li></ol></li><li> Lavare accuratamente le sezioni di tessuto con PBS almeno quattro volte per 10 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Post-fissaggio (opzionale) <ol><li> Per alcuni esperimenti, eseguire post-fissazione incubando i campioni con 2% PFA diluito in PBS per 10 minuti a RT per stabilizzare i ponteggi antigene / anticorpo. Tuttavia, questo passo può essere soppressa in molti casi. </li></ol></li><li> Lipidi neutri e di contrasto del DNA <ol><li> Per visualizzare CLD e MFGs, colore lipidi neutri incubando sezioni di tessuto in 30-50 ml di una soluzione PBS contenente 3 mg / ml di BODIPY 493/ 503 per 10 minuti a RT. Rapidamente sciacquare sezioni di tessuto due volte con PBS. </li><li> Controcolorare DNA nucleare con 30-50 ml di una soluzione di PBS contenente 3 mM di DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, 5 mg / ml soluzione madre) per 10 minuti a RT. Lavare le sezioni di tessuto due volte con PBS prima del montaggio dei vetrini per l&#39;osservazione. </li></ol></li><li> Montaggio Sezione <ol><li> Rimuovere PBS e una goccia di mezzo di montaggio per ogni sezione di tessuto. </li><li> Collocare un lato del vetrino ad un angolo contro la slitta, il contatto con il bordo esterno della goccia liquido e abbassare il coperchio lentamente, evitare bolle d&#39;aria. Lasciare che il liquido per diffondere tra il vetrino e vetrino per alcuni minuti e poi rimuovere l&#39;eccesso di mezzo di montaggio con un tovagliolo di carta. </li><li> Sigillare la polizza di copertura al vetrino con le sezioni smalto e del tessuto conservare a 4 ° C per impedire la loro esposizione alla luce fino osservazione. </li></ol></li></ol>4. Fluorescenza Osservazione e Image Acquisition Nota: Un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera controllato dal software di acquisizione immagini è tenuto ad osservare i risultati IHC. <ol><li> Prima di acquisire immagini, controllare l&#39;intensità della etichettatura e valutare il fondo dell&#39;esperimento, cercando in controlli negativi. Acquisire le immagini di ciascuna etichetta fluorescente (canale di colore) individualmente. </li><li> Acquisire tutte le immagini, compresi quelli dei controlli corrispondenti, nelle stesse condizioni (esposizione e le impostazioni generali) per ogni canale di colore. </li><li> Microscopia convenzionale <ol><li> Eseguire epifluorescenza con un microscopio dotato di filtri standard per isotiocianato di fluorescina (FITC, verde), rodamina (rosso) e DAPI (blu) emissioni, × 20 × 63 (-immersione in olio, NA 1.3) obiettivi e una telecamera ad DP50. </li></ol></li><li> Microscopia confocale </li><li> Eseguire la microscopia confocale con un micropiviale equipaggiata con il software ZEN, utilizzando × 20 × 63 a (-immersione in olio, NA 1.4) gli obiettivi e le 488- e 568 nm di eccitazione lunghezze d&#39;onda del laser. </li></ol> Trattamento 5. Immagine Nota: Tutte le immagini post-trattamenti vengono eseguiti utilizzando il software gratuito ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Sovrapporre immagine (merge) <ol><li> Aprire le immagini acquisite in ogni canale che verrà combinato (File / Apri). Se si lavora con 8 bit in scala di grigi, attribuire colore artificiale per ciascun canale utilizzando la tabella di ricerca (tabelle di immagine / di ricerca). </li><li> Generare il quadro composito da immagini in scala di grigi o colorati utilizzando il comando &quot;Unisci i canali&quot; (Immagine / colori / Merge Canali) e poi attribuire un colore per ogni canale. </li><li> Eseguire immagine pile sovrapposizione nello stesso modo, aprendo pile acquisite in ogni canale che verrà combinato (File / Apri) e utilizzando il comando &quot;Unisci canali &amp;# 8221; (Immagine / colori / Merge Canali) per attribuire un colore per ogni canale. Salvare lo stack composita come una sequenza di immagini o come un film (vedi paragrafo 5.4). </li></ol></li><li> Immagine pila Z proiezione <ol><li> Utilizzare la funzione Z di proiezione (Immagine / Pila / Zproject, intensità massima) per fornire una visione a due dimensioni di tutte le immagini di una serie di immagini da proiettandole lungo l&#39;asse perpendicolare al piano dell&#39;immagine (asse z). L&#39;opzione &quot;Maximum Intensity&quot; crea un&#39;immagine in cui ogni pixel contiene il valore massimo su tutte le immagini della pila. Ciò genera una singola immagine che permette la visualizzazione di tutti i colorazione osservata attraverso l&#39;intera serie di immagini per un particolare canale o dopo la sovrapposizione di più canali. </li></ol></li><li> Immagine proiezione abbinata 3D <ol><li> Utilizzare il comando di proiezione 3D (progetto Immagine / Pila / 3D, più luminoso Point, asse y) per generare una sequenza di proiezioni di un volume rotante su un piano. La resa visiva di surfaces e le strutture interne dipende sia il metodo di proiezione (più vicino punto, punto più luminoso (usato qui), o valore medio-) ed i parametri di visualizzazione selezionati. Ogni frame della sequenza animata è il risultato di sbalzo da un diverso angolo di visualizzazione. </li><li> Ruotare l&#39;immagine creata in 3D intorno a ciascuno dei tre assi ortogonali (l&#39;asse y è stato qui selezionato). Salvare la sequenza di prodotto come una singola immagine o un filmato. </li></ol></li><li> Serie di immagini per la conversione di film <ol><li> Aprire una serie di immagini (File / Apri) e salvarlo come un film in formato .AVI utilizzando il comando &quot;AVI&quot; (File / Salva con nome / AVI). </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

IHC è un metodo relativamente semplice e diretto sperimentale di localizzare l&#39;antigene in sezioni di tessuto, che dipende principalmente sulle specifiche interazioni epitopi-anticorpo. Anche se un gran numero di protocolli sono utilizzati per localizzare una proteina IIF, il nucleo di queste procedure è quasi sempre la stessa. Tuttavia, vi sono alcuni aspetti critici che possono influenzare fortemente il risultato e deve quindi essere ottimizzati per ciascuno studio individuale IHC. L&#39;aspetto più impegnativo...

La ghiandola mammaria è un atipico organo esocrina mammiferi la cui principale funzione è quella di produrre latte per nutrire i neonati. Lo sviluppo del tessuto mammario si verifica soprattutto dopo la nascita ed è caratterizzata da un processo unico in cui l&#39;epitelio invade lo stroma circostante. Questo tessuto subisce molti cambiamenti (crescita, differenziazione e regressione), soprattutto durante la vita adulta, in concomitanza con variazioni di stato riproduttivo (Figura 1). Oltre alla morfologia generale del tessuto, le proporzioni dei vari tipi di cellule, nonché la loro disposizione all&#39;interno della ghiandola mammaria cambiare radicalmente durante lo sviluppo 1-5. Durante la vita embrionale, l&#39;epitelio mammario deriva da linee latte mammarie, che è definita da un lieve ispessimento e stratificazione della ectoderma, tra gli arti anteriori e posteriori su ciascun lato della linea mediana intorno al giorno embrionale 10.5 (E10.5) (Figura 1A ).Sulla E11.5, la linea del latte scompone in singoli placodi, simmetricamente posizionati lungo la linea di latte mammaria in posizioni riproducibili, e il mesenchima circostante inizia a condensare. I placodi cominciano ad affondare più in profondità nel derma e mesenchima mammaria organizza a strati concentrici intorno al bocciolo mammaria (E12.5-E14.5). A partire dal E15.5, dell&#39;epitelio mammario, comincia a proliferare e allungare a formare il germoglio principale che spinge attraverso il mesenchima mammaria verso il cuscinetto adiposo. Il germoglio primario sviluppa un lume cavo con un&#39;apertura per la pelle, contrassegnata dalla formazione della guaina capezzolo. Sul E18.5, il condotto di allungamento è diventato il cuscinetto adiposo e si è ramificata in un piccolo sistema duttale arborized inglobato nel cuscinetto adiposo. Lo sviluppo è essenzialmente arrestato e la ghiandola mammaria rudimentale rimane morphogenetically quiescente fino alla pubertà. Nel embrione maschio, l&#39;attivazione dei recettori degli androgeni porta alla degenerazione dei germogli, che scompaionoda E15.5. Come di E18, sviluppo mammario cessa fino alla pubertà 6-9. Alla nascita, la ghiandola mammaria ospita un sistema duttale rudimentale che allunga e rami lentamente (una crescita isometrica). All&#39;inizio della pubertà, strutture sferiche situate alle estremità dei condotti chiamati gemme estremità terminale (TEBS), sono formate da uno strato esterno di cellule del cappuccio e un nucleo interno multistrato di cellule (cellule del corpo). Queste strutture sono altamente proliferative e infiltrano il tessuto stromale circostante in risposta a stimoli ormonali. La proliferazione all&#39;interno dei risultati TEBS in allungamento duttale, accoppiato con ramificazione morfogenesi. Questo processo porta alla creazione di una rete arborized epiteliale di base che emana dal capezzolo (Figura 1B, pubertà). A ~ 10-12 settimane dopo la nascita, quando l&#39;epitelio ha invaso tutto il cuscinetto di grasso, la sua espansione si arresta e il TEBS scomparire. Sviluppo duttale subisce quindi cambiamenti dinamici, vale a dire, successive la proliferazione e la regressione delle cellule epiteliali secondo cicli estrali 10 (Figura 1B, adulti). Dall&#39;inizio di gestazione, il tessuto mammario subisce importante crescita e cambiamenti morfologici per preparare l&#39;allattamento. L&#39;epitelio mammario ampiamente proliferano e differenziare, portando ad una ramificata rete altamente tubulo-alveolari. Allo stesso tempo, le cellule epiteliali mammarie (MECS) diventano polarizzata e in grado di sintetizzare e secernere prodotti lattiero-caseari. MECs organizzano in numerose strutture alveolari (acini), che sono circondati da cellule mioepiteliali contrattili e incorporati in uno stroma composta da tessuto connettivo e adiposo, vasi sanguigni e terminazioni nervose (Figura 1B, gravidanza). Inoltre, il lato basale MECs è in stretto contatto con la membrana basale (matrice extracellulare) e le interazioni tra queste due entità strettamente regolano sia la funzione morfogenesi e secretoria della mammellary epitelio 11-13. Tutti questi processi si basano sull&#39;azione di vari segnali ambientali, di cui i più importanti sono hormones14, fattori paracrini e la matrice extracellulare. Ad esempio, progesterone induce vasta ramificazione laterale 15 e alveologenesis che, in combinazione con prolattina (PRL) 16,17, promuove e mantiene la differenziazione degli alveoli. Oltre a steroidi e PRL18, citochine e vie di segnalazione associate allo sviluppo (Wnt e Notch vie di segnalazione) sono anche coinvolti nell&#39;impegno lignaggio mammaria e di sviluppo 19-21. Al termine della gravidanza, i MECs luminali iniziano a produrre un latte ricco di proteina nota come colostro nel lume degli alveoli. Inoltre, il progesterone agisce sulla permeabilità epiteliale e dato che le giunzioni strette sono ancora aperte, il colostro si trova anche nel sangue materno. Dopo il parto, il Mammary epitelio occupa quasi tutto il volume della ghiandola mammaria e è altamente organizzato (Figura 2, mammario). Unità latte produzione, ovvero alveoli (Figura 2, alveoli), sono formate da un monostrato di polarizzati mammarie epiteliali cellule secretorie (MESCs), con la loro membrana plasmatica apicale delimita il lume. Alveoli si dispongono in lobuli che sono raggruppati in lobi collegati a condotti che drenano il latte con l&#39;ambiente esterno (Figura 2, del lobo). Allattamento si verifica, ad esempio., MESCs iniziano a secernere abbondanti quantità di latte, innescato principalmente dal calo di ormoni della placenta (principalmente progesterone) (Figura 1B, allattamento). Geni delle proteine ​​del latte sono attivati ​​in un corso a tempo temporale definito che va dalla gravidanza al allattamento 9,22,23, soprattutto in risposta a ipofisaria PRL rilasciato al momento dell&#39;allattamento. Allo stesso tempo, i contatti tra MESCs e la matrice extracellulare, sia stimolano proteine ​​del latte syntESI attraverso i segnali che sono mediati attraverso le interazioni tra integrine e laminina 24,25 cellulari, e sopprimono l&#39;apoptosi in MESCs 26,27. Queste vie di segnalazione provocano l&#39;attivazione di proteine ​​del latte gene promoters 28 attraverso l&#39;attivazione della trascrizione specifici fattori di 29. Contatti cellula-cellula sono importanti anche per alcuni aspetti della differenziazione tra cui l&#39;istituzione della polarità apicale e la secrezione vettoriale di prodotti lattiero-caseari. Giunzioni strette rapidamente stretti dopo l&#39;inizio della lattazione e MESCs finemente orchestrano l&#39;assorbimento di molecole dal sangue così come la sintesi, il trasporto e la secrezione di componenti del latte, in risposta alle esigenze nutrizionali dei neonati. Al momento della suzione, la contrazione delle cellule mioepiteliali circondano gli alveoli si verifica in risposta a ossitocina e porta alla emissione del latte attraverso i condotti e nel capezzolo. Il latte è un liquido che contiene proteine ​​complessa (principalmentecaseine), zuccheri (principalmente lattosio), lipidi e minerali, come pure molecole bioattive come immunoglobuline A (IgA), fattori di crescita e ormoni. Sono sintetizzati caseine, assemblati in strutture supramolecolari, ossia micelle di caseina, trasportate lungo la via secretoria, e poi rilasciato per esocitosi, cioè, la fusione delle vescicole secretorie-caseina contenente (SV) con la membrana plasmatica apicale di MESC (Figura 2). Traffico intracellulare si basa su scambi materiali tra compartimenti membranose e coinvolge solubile N-ethylmaleimide sensibile Fusion (NSF) Allegato Protein (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. La famiglia delle proteine ​​SNARE è suddivisa in SNAREs vescicolari (v-lacci), presenti nella membrana della vescicola e SNAREs bersaglio (t-lacci), localizzati sulle membrane di destinazione. Con sfreccia tra loro domini coiled-coil, V e t-SNARE assemblare per formare un complesso altamente stabile fascio quattro elica, indicati come thcomplesso SNARE e. Questo complesso promuove la fusione di due doppi strati lipidici opposti gradualmente portarli in prossimità 30,32. In seguito, i complessi SNARE sono dissociate dalla adenosina trifosfatasi NSF e le sue proteine ​​adattatore Snap e SNARE proteine ​​sono riciclati di nuovo al loro compartimento di origine 33. È interessante notare che, ogni proteina SNARE risiede prevalentemente in compartimenti cellulari distinti e rullante accoppiamento possono contribuire alla specificità degli eventi di fusione intracellulari 34. Precedenti studi suggeriscono che almeno Protein 23 (SNAP23) e vescicole associata a membrana di proteine ​​8 (VAMP8), e sintaxine (Stx) sinaptosomiali associata -7 e -12 svolgono un ruolo nella caseina esocitosi 35,36. Queste proteine ​​sono state trovate anche in associazione con la frazione lipidica del latte, vale a dire, di grasso del latte (globuli MFGs) 37. Il modello prevalente corrente postula che gocce lipidiche citoplasmatici (CLD) sono formati dall&#39;accumulo di l neutroipids (soprattutto trigliceridi ed esteri di steroli) e colesterolo deriva dalla dieta materna tra i due volantini del reticolo endoplasmatico (ER) membrane 38-41. Grandi CLD si formano, almeno in parte, dalla fusione di CLD piccole mentre viene trasportato al lato apicale MESCs dove vengono rilasciati come MFGs (1-10 micron di diametro) per gemmazione, essendo avvolto dalla membrana plasmatica apicale MESC 40-42. Allattamento cessa dopo cuccioli sono svezzati e le MESCs progressivamente muoiono per apoptosi, che porta alla regressione del tessuto mammario a uno stato puberale (Figura 1B, involuzione). Immunofluorescenza (IF) è un metodo di laboratorio di analisi comune usato in quasi tutti gli aspetti della biologia, sia nella ricerca e nella diagnostica clinica. SE tecniche possono essere eseguite su sezioni di tessuto (immunoistochimica, IHC) o cellulari (immunocitochimica, ICC) campioni. Questo approccio potente si basa sull&#39;utilizzo di fluorescente-anticorpi marcati che specificamente si legano (direttamente o indirettamente) all&#39;antigene di interesse, permettendo così la visualizzazione della sua distribuzione tissutale tramite microscopia a fluorescenza. Segnali di fluorescenza per lo più dipendono dalla qualità e la concentrazione degli anticorpi e corretta manipolazione del campione. Un protocollo semplice immunofluorescenza indiretta (IIF) viene presentato per rilevare prodotti lattiero-caseari (caseine e MFGs) e proteine ​​coinvolte nella secrezione di prodotti lattiero-caseari (butirofilina (BTN1), rullante proteine) su sezioni congelate di tessuto mammario del mouse (Figura 3). Anche se questo protocollo offre una panoramica completa IHC, che vanno dalla raccolta di tessuto per l&#39;immagine dopo il trattamento, critica e passaggi facoltativi, nonché alcune raccomandazioni tecniche vengono anche presentati e discussi.

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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

L&#39;immunofluorescenza indiretta è utilizzato per rilevare e localizzare le proteine ​​di interesse in un tessuto. Il protocollo qui presentato descrive un metodo semplice e completo per la rilevazione di proteine ​​immunitario, mouse allattamento ghiandola mammaria essere preso come esempio. Un protocollo per la preparazione dei campioni di tessuto, soprattutto per quanto riguarda la dissezione del mouse di ghiandola mammaria, la fissazione dei tessuti e sezionamento tessuti congelati, sono dettagliati. Un protocollo standard per eseguire immunofluorescenza indiretta, tra cui un passo di recupero dell&#39;antigene opzionale, è anche presentato. L&#39;osservazione delle sezioni di tessuto etichettati così come l&#39;acquisizione di immagini e post-trattamenti sono anche indicati. Questa procedura fornisce una panoramica completa, dalla raccolta di tessuto animale per la localizzazione cellulare di una proteina. Anche se questo metodo generale può essere applicato ad altri campioni di tessuto, deve essere adattato ad ogni coppia anticorpo tessuto / primary studiato.

La ghiandola mammaria è una ghiandola sottocutanea situato lungo la struttura ventrale sia del torace e dell&#39;addome nei roditori. La posizione dei cinque coppie di ghiandole del mouse durante la gestazione è mostrata in Figura 4. La morfologia della ghiandola mammaria cambia drasticamente durante il suo sviluppo, riflettendo modifiche funzionali richieste per prepararsi alla piena lattazione (Figura 1B). Negli animali vergini o nullipare, la ghiandola...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l&#39;immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.6K Views.  INRA.  Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini. 

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Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Ricerca

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Topo cellule epiteliali mammarie forma Mammospheres durante la differenziazione lattogenica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Iniezione intraduttale per Localizzato Drug Delivery per il mouse ghiandola mammaria

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Ricostruzione di 3-Dimensional Volume Istologia e la sua applicazione per studiare mouse ghiandole mammarie

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effetto di Male Accessory Gland prodotti in deposizione delle uova in gasteropodi

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Utilizzando il mouse cellule tumorali mammarie per insegnare concetti di biologia di base: un modulo di laboratorio semplice

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...