. وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا كيم جيلبرت يحمل studentship من فون للبحوث كيبيك - سانتيه.

يتم التعامل مع الحيوانات في الامتثال للوائح لجنة رعاية الحيوان المحلية، وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان. ويعيش الفئران بشكل فردي تحت ظروف ثابتة (درجة حرارة 21-22 درجة مئوية والرطوبة من 40-50٪)، بما في ذلك دورة الظلام ضوء 12 ساعة، ابتداء من الساعة 08:00. الكريات تشاو وماء الصنبور هي بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية المتاحة في كل مراحل الدراسة. يسمح فترة التأقلم من 3 أيام بعد الولادة من قبل المورد قبل التجربة. ذكور فئران سبراج داولي يتراوح وزنها بين 300-800 جم وقد استخدمت بشكل روتيني مع هذا البروتوكول. 1. MI جراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث التخدير مع الحقن داخل الصفاق الكيتامين 60 ملغ / كغ وزيلازين 10 ملغ / كغ. تأكيد التخدير المناسبة التي كتبها غياب رد الفعل عندما يتم مقروص الكفوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلق موقع الجراحية. أنبوبا الفئران مع القصبة الهوائية أنابيب: القسطرة (16G 1.77 بوصة) ووضع الحيوان في موقف استلقاء الجانبي. وضع الحيوانات على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة حوالي 37 درجة مئوية. توصيل أنابيب القصبة الهوائية لالأيزوفلورين 2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد موقع الجراحية مع غلوكونات الكلورهيكسيدين وايزوبروبيل. أثناء الجراحة، واستخدام قفازات معقمة وأدوات معقمة. تطبيق مرهم للعين لكلتا العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. وضع حقل معقمة على الحيوان والصكوك في مجال معقم آخر المقبل للحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الجلد مع شفرة مشرط رقم 10. تقشر الأنسجة العضلية مع المشبك لوقف نزيف الدم. وضع الحيوان في موقف استلقاء بطني. فتح جدار الصدر مع المشبك وموقف لوقف نزيف الدم في الصدر ضام. فتح التامور مع المشبك لوقف نزيف الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتاج التاجية الانسداد، حلقة 360 مم مدى 4-0 خياطة الحرير حول الشريان التاجي تنازلي، مرورا نسيج عضلة القلب متجاورة. إدراج كلا طرفي الخيط الحرير إلى 14G، 1.25 سم أنبوب بلاستيكي طويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب طرفي الخيط الحرير والقيحح أنبوب انخفض مقابل الشريان لتسد به، لمدة 40 دقيقة. انسداد آمن من خلال تحامل على أنبوب بلاستيكي مع المشبك لوقف نزيف الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 40 دقيقة، والإفراج عن انسداد طريق الإفراج عن المشبك لوقف نزيف الدم، تليها إزالة الأنبوب والحرير مرنة خياطة. ملاحظة: الفئران السيطرة الشام الخضوع لنفس الإجراء الجراحي ناقص انسداد الشريان التاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن يغلق جدار الصدر، ووضع قسطرة مرنة (18G، 4.5 سم) من خلال التجويف الصدري لسحب الهواء من الصدر مع حقنة 5 مل لمنع استرواح الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار الصدر تجويف مع 2-0 خياطة، غرزة العضلات مع 4-0 خياطة الحرير والجلد مع 3-0 خياطة الحرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن يغلق عند نقطة الجلد الماضية، رسم مرة أخرى الهواء من الصدر مع 5 مل حقنة عن طريق القسطرة وضعت سابقا في تجويف الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة آخر نقطة الجلد. توقف التهوية الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الصحوة الفئران. لا تترك حيوان غير المراقب حتى أنها ريجيند الوعي الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الفئران كل ساعة 8 لمدة 24 ساعة مع مسكن (البوبرينورفين، 0.05 ملغ / كغ الملكية الفكرية) ومع مضاد حيوي (جرعة واحدة من duplocillin، 0.2 ملغم / كغم IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجراحة، الفئران منزل على حدة حتى وقت التضحية، أي 3 أيام بعد MI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التعبير عن حجم احتشاء، وذلك أساسا نخر، حيث أن نسبة الأنسجة محتشية في المنطقة للخطر من البطين الأيسر. هذا يمكن قياسها باستخدام triphenyltetrazolium تلوين 11. </li></ol> 2. اللوزة عزل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رئيس الحيوان لأول مرة في حقيبة على شكل مخروط، مع أنفها جاحظ من نهاية فتحة ضيقة. الفئران آمن لتجنب أي حركة. وضع رأسه على نحو ملائم على المقصلة، بين شفرات مقص. قطع رأس الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أبقى مكان رئيس فأر في طبق على الثلج المجروش. تنفيذ كافة الإجراءات لعزل الأنسجة على الثلج المجروش (4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كورونا مفتوحةULL مع مقص، وفصل بعناية الأغماد العظام مع رينجرز العظام عن طريق سحب وتجنب تشويه الأنسجة تحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شفرة مسطحة من ملعقة بين الجزء السفلي من الجمجمة والسطح البطني الخلفي من الدماغ وفصل بعناية الدماغ من الجمجمة عن طريق دفع بلطف نصل إلى الأمام على طول الجزء السفلي من الجمجمة حتى الدماغ يمكن رفع ببطء للخروج من الجمجمة. تجاهل الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ على السطح الظهري لها. تحديد ما تحت المهاد (هيكل أمام المخيخ) وقطع الدماغ coronally أمام نهايته الأمامية والخلفية وراء نهاية لها. تجاهل الأمامي والخلفي أجزاء من الدماغ إن لم يكن هناك حاجة لاستخدامات أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور amygdalas شكل كرات صغيرة تحت الفص الصدغي، على المستوى الثنائي، بجوار منطقة ما تحت المهاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه شقة في المخ في نهاية الأمامية لها، السطح الظهري بعيدا عن المجرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع الجانب الأيسر أو الأيمن من الدماغ. فصل نصفيالمجالات وثم القشرة من اللوزة متجاورة. قطع الطريق حوالي 8 ملم من هذه القشرة فضفاضة للسماح عزل اللوزة. قطع اللوزة مع مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل جزء من basolateral اللوزة من جانبها centromedial عن طريق قطع على طول الدرز المظلمة التي تدير عبرها، نصف ونصف تقريبا. هذا الهيكل ليس دائما يسهل التعرف عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع subparts اللوزة في قارورة حددت منفصلة والحفاظ على الثلج المجروش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تشريح تكرار مع نصف الكرة الأرضية الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج قارورة في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة. الحفاظ على قارورة في الثلاجة -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. </li></ol> 3. كاسباس 3 النشاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحلل مع 0.32 M من السكروز، 1٪ تريتون-X-100، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، 5 ملي من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل، 2 ملم من dithiothreitol، 1 ملم من phenylmethylsulfonyl الفلورايد، 10 ميكروغرام / ميكرولتر من leupeptin ، 10 ميكروغرام / ميكرولتر من pepstatin A و 10 ميكروغرام / ميكرولتر من أبروتينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إضافة 150 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل عينة (5-10 ملغ). الحفاظ على الجليد. يصوتن كل عينة على الجليد لمدة 5 ثانية في كثافة القصوى (40 W). احتضان الأنسجة في تحلل العازلة على الجليد لمدة 30 دقيقة. دوامة كل عينة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء دورات 3 تجميد / الذوبان بوضع عينات بالتناوب في النيتروجين السائل وعلى لوحة التدفئة حراريا التي تسيطر عليها وضعت في 37 ° C. الأنسجة أجهزة الطرد المركزي في 13000 ز (4 ° C) لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف ونضع في أنبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تركيزات البروتين القياسية بين 0 و 10 ميكروغرام / مل مع ألبومين المصل البقري. إعداد الفراغات مع العازلة فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من برادفورد كاشف لكل معيار. قراءة مستوى في 595 نانومتر. لمستويات البروتين، إضافة 5 ميكرولتر من عينة طاف إلى 795 ميكرولتر من الماء المقطر و 200 ميكرولتر من برادفورد كاشف. قراءة كل عينة في 595 نانومتر وقياس البروتين مع منحنى القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رد فعل العازلة مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7، 5 ملم من MgCl 2 &lt;/ دون&gt;، 1 ملم من جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic، 0.1٪ من 3 cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate و1 ملم من dithiothreitol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكروغرام من البروتين لرد فعل العازلة وكاسباس 3 ركائز للحصول على عينات رد الفعل الإيجابية والسلبية. للحصول على عينات سلبية، إضافة العازلة رد فعل، 25 ميكروغرام من البروتين، 0.4 ميكرولتر من ايه سي DEVD-CHO 800 ميكرومتر و 0.8 ميكرولتر من ايه سي DEVD-AMC 10 ملم. للحصول على عينات إيجابية، إضافة 25 ميكروغرام من البروتين لرد فعل العازلة و 0.8 ميكرولتر من ايه سي DEVD-AMC 10 ملم. معالجة جميع العينات سلبية وإيجابية في ثلاث نسخ. أكمل الحجم النهائي من كل عينة تصل إلى 200 ميكرولتر بإضافة رد فعل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج ضوابط السلبية بإضافة 188.7 ميكرولتر من رد فعل العازلة إلى 0.5 ميكرولتر من ايه سي DEVD-CHO 800 ميكرومتر، 0.8 ميكرولتر ايه سي DEVD-AMC 10 ملم و 10 ميكرولتر من تحلل العازلة. لالضوابط الإيجابية، إضافة 189.2 ميكرولتر من رد فعل العازلة، 0.8 ميكرولتر من ايه سي DEVD-AMC 10 ملم و 10 ميكرولتر من تحلل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات والتحكم في الظلام لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد فعل مع 600 الجلايسين ميكرولتر 0.4 M وهيدروكسيد الصوديوم 0.4 M (الرقم الهيدروجيني 10) في كل عينة والسيطرة عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مضان من قبل spectrofluorometry في الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 465 نانومتر. إضافة 2 مل من الماء المقطر إلى رد فعل في الزجاج كفيت. قراءة الضوابط وعينات لمدة 10 ثانية مع 1 نقطة في كل ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نشاط معين في كل عينة: ((الإسفار العينات السلبية ناقص مضان من العينات الإيجابية) س حجم 2.8 مل) مقسوما على (الوقت من الحضانة 3 ساعة س كمية من البروتين 25 ملغ). </li></ol>

<ol>
	<li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+keys+in+the+ignition+of+cell+death.">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li><li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors:+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway.">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala.">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li><li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li><li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model.">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li><li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression.">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li><li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Killing+the+blues':+a+role+for+cellular+suicide+(apoptosis)+in+depression+and+the+antidepressant+response.">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways:+paper+wraps+stone+blunts+scissors.">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تجربتنا مع هذا البروتوكول على مدى السنوات ال 10 الماضية أدت إلى تحديد القضايا المنهجية حرجة. أولا، تشريح الدماغ السريع في طبق بيتري على الثلج المجروش مهم للحفاظ على جودة الإعداد. ثانيا، يجب أن تتحقق أن صوتنة الأنسجة أقصر لاللوزة الدماغية مقارنة مع أنواع أخرى من الأنسجة، مثل القلب (10 ثانية) أو الكلى (20 ثانية). ثالثا، يجب توخي الحذر الشديد لخلط بعناية الركيزة قبل إضافتها إلى العينات. واجهنا إشارات متباينة عندما كان تسلسل خلط غير كافية. رابعا، ينبغي أن يكون هناك فقاعات موجودة في الخلية الكوارتز عند قراءة العينات. خلاف ذلك، يمكن أن تتغير الإشارة. نحن إجراء تغيير في السنوات القليلة الماضية لزيادة استنساخ النتائج: زيادة حجم الركيزة لتجنب حجم أقل من 1 ميكرولتر. ومع ذلك، قد تحدث اختلافات صغيرة بين المقايسات المتعاقبة، وينبغي أن تستخدم ما لا يقل عن 3 عينات التحكم لتحكم عن الاختلافات. وبلغ متوسط ​​التدابير مضان من هذه الضوابط ويتم تعيين الوسيط عند 100٪. يتم تحويل التدابير مضان في عينات تجريبية في المئة من العينات السيطرة. قيود آخر من التقنية هو وأنه ليس هناك سوى جزء من نسيج يستخدم، وبالتالي، يمكن الاستهانة كاسباس 3 النشاط. في الواقع، النافذة وقت موت الخلايا المبرمج قصيرة في أي خلية معينة، ويمكن أن تضيع على الرغم من أنه يحدث في المناطق المجاورة في وقت أخذ العينات 1،4،15. العكس هو الممكن أيضا: الخلايا يمكن أن تكون مكثفة وخاصة في أجزاء من الأنسجة، مما أدى إلى المبالغة في تقدير كاسباس 3 النشاط. من المستحسن استخدام الأنسجة المتبقية (اللوزة) لتقنيات تكميلية، مثل فحوصات TUNEL أو نسبة باكس / Bcl2 (انظر المقدمة). Spectrofluorometry اثنين على الأقل من المزايا أكثر من النشاف الغربي. أولا، فإنه يقوم مباشرة البيانات الكمية. ثانيا، أنه يقيس الأنزيمية لctivity نفسها بدلا من البروتين أو RNA التعبير، والتي قد تكون غير ذات صلة، وأنه من المعروف أن بروتين تعبير يمكن زيادة دون أي تغيير في النشاط الأنزيمي. وعلاوة على ذلك، spectrofluorometry لا يمكن أن يؤديها على الأنسجة الأخرى أو مع مختلف أنواع الحيوانات ويمكن تعديلها لفرعية كاسباس أخرى، مع ركائز مختلفة، بحيث مقارنات آمنة ويمكن إجراء. في الختام، يوضح هذا المستند استخدام spectrofluorometry لقياس كاسباس 3 النشاط في اللوزة، وتوفير الأدلة يحدث أن موت الخلايا المبرمج في هذه المنطقة من الجهاز الحوفي بعد 3 أيام MI.

Caspases أو البروتياز الموجه اسبارتاتي سيستين التي تعتمد هي عائلة من الإنزيمات التي تشارك في مختلف العمليات التي التوازن 1. Caspases يمكن تصنيفها وفقا لدورهم في موت الخلايا المبرمج أو التهاب. ويشارك كاسباس 1، -4، -5 و-12 في التهاب في حين أن أولئك الذين يعملون في الخلايا يمكن أن يكون شبه تصنف على أنها caspases البادئ (كاسباس 8 و -9) وcaspases الجلاد (كاسباس 3، -6 -7 و ). Caspases تلعب أدوارا مهمة في العديد من الأمراض، لا سيما في الاضطرابات التي موت الخلايا المبرمج يمكن أن يكون مبالغا فيه، كما لوحظ بعد احتشاء عضلة القلب (MI) أو نقص التروية الدماغية. في نموذج الفئران من متلازمة ما بعد MI المستخدمة في المختبر، وثبت أن يتم تنشيط كاسباس 3 ليس فقط في عضلة القلب 2 ولكن أيضا في الجهاز الحوفي الذي تورط في السيطرة على المزاج والعواطف 3-6. وينظر أيضا أن يتم تنشيط كاسباس 3 في مناطق مختلفةمن الجهاز الحوفي، مثل اللوزة وقرن آمون، وهذا التنشيط قمم حوالي 3 أيام بعد إهانة الدماغية 4. ومن المثير للاهتمام، يرتبط كاسباس 3 النشاط مع مرحلة ما بعد MI الإعاقات السلوكية، والتوهين من خلال التدخلات الدوائية والغذائية يقلل من هذه الإصابات، مما يشير إلى احتمال وجود صلة بين كاسباس 3 وبعد MI الاكتئاب 7-12. ويمكن قياس كاسباس 3 التنشيط من خلال تقنيات مختلفة. النشاف الغربي أيقن خصائص الأنزيمية للcaspases ويمكن الكشف عن الانزيمات النشطة فضلا عن أشكال المؤيدة للانزيم بهم. النشاف الغربي، ومع ذلك، هو شبه الكمي، ويمكن أن تضيع الاختلافات الصغيرة من خلال إشارة ضعيفة إلى الضوضاء نسب 13. ويستند أسلوب أفضل على الانقسام ركيزة (DEVD-AMC) من خلال كاسباس 3 التي تطلق مجمع الفلورة ويمكن أن يقاس spectrofluorometry. كاسباس 3 التنشيط هو علامة موثوقة من موت الخلايا المبرمج. قياس موت الخلايا المبرمج كاليفورنيان يكون غير مستقر بسبب النافذة وقت حدوثها قصير، والخلايا المجاورة يمكن أن phagocytize الهيئات أفكارك أو خلايا 14. موت الخلايا المبرمج يمكن تأكيد مزيدا من التقنيات الأخرى، مثل محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز وسم نهاية dUTP نيك (النفق) مقايسة، الذي يكشف تجزئة DNA الناتجة من أجهزة الطرد المركزي أفكارك الإشارات 6، أو نسبة من البروتينات الموالية / المضادة للأفكارك، مثل باكس / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

احتشاء عضلة القلب (MI) لديه مثيرة متوسطة وطويلة الأجل عواقب على الصعيدين الفسيولوجية والسلوكية، ولكن الآليات التي تشارك لا تزال غير واضحة. وقد وضعت لدينا مختبر نموذج الفئران من متلازمة ما بعد-MI التي تعرض وظائف ضعف القلب، وفقدان الخلايا العصبية في الجهاز الحوفي، العجز المعرفي والسلوكي علامات الاكتئاب. على مستوى الخلايا العصبية، كاسباس 3 تفعيل يتوسط بعد MI موت الخلايا المبرمج في المناطق الحوفي مختلفة، مثل اللوزة - وتبلغ ذروتها في 3 أيام بعد MI. العاهات المعرفية والسلوكية تظهر 2-3 أسابيع بعد MI وهذه ترتبط إحصائيا مع تدابير كاسباس 3 النشاط. يستخدم بروتوكول صفها هنا للحث MI، جمع الأنسجة اللوزة وقياس كاسباس 3 النشاط باستخدام spectrofluorometry. للحث على MI، والمغطي الشريان التاجي تنازلي لمدة 40 دقيقة. بروتوكول لتقييم كاسباس 3 تفعيل يبدأ بعد 3 أيام MI: يتم التضحية الفئران واللوزة معزولة RAPIDLY من الدماغ. يتم تجميد العينات بسرعة في النيتروجين السائل والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى التحليل الفعلي. وتستند هذه التقنية القيام بها لتقييم كاسباس 3 التنشيط على الانقسام ركيزة (DEVD-AMC) من خلال كاسباس 3، التي تصدر مجمع الفلورة التي يمكن أن تقاس spectrofluorometry. المنهجية الكمية واستنساخه ولكن المعدات المطلوبة مكلفة وإجراءات لقياس العينات هو مضيعة للوقت. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى الأنسجة الأخرى، مثل القلب والكلى. DEVD-AMC يمكن الاستعاضة عن ركائز أخرى لقياس نشاط caspases أخرى.

تم عزل اللوزة في 8 صورية (السيطرة) و 8 الفئران MI بعد ثلاثة أيام من تحريض على بروتوكول نقص التروية / ضخه. وقد تم قياس كاسباس 3 النشاط في هذا النسيج باستخدام تألقي التي يمكن المشقوق من قبل كاسباس 3 النشطة والكشف عنها من قبل spectrofluorometry. أجريت القياسات الإيجابية والسلبية (انظر الخطوات 3.11، 3.12 و 3.16) في ثلاث نسخ وقياسها خلال 10 ثانية، مع 1 نقطة في كل ثانية. تم حساب الفروق بين الضوابط الإيجابية والسلبية وتم تعيين متوسط ​​الفروق لجميع الأنسجة صورية المنجزة خلال هذه التجربة على 100٪. تم تحجيمها النتائج من الفئران MI وفقا لهذا المرجع ويوضح الشكل 1 النتائج النهائية: أنه يدل على أعلى نشاط ملحوظ في الفئران MI مقارنة صورية (P &lt;0.05). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> الشكل 1. كاسباس 3النشاط في اللوزة الفئران MI، كنسبة مئوية من متوسط ​​النشاط في الضوابط صورية، لتعيين 100٪ (8 فئران لكل مجموعة). * تشير كبيرا الاختلاف بين المجموعات (p &lt;0.05). يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM.

Watch this Scientific Journal Video about Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction at JoVE.com

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

كاسباس 3 النشاط في الفئران اللوزة تقاس Spectrofluorometry بعد احتشاء عضلة القلب

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Views.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Video: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

احتشاء عضلة القلب الحاد في الفئران

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Medicine

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochemistry

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

الكمي النسيجي المزمن عضلة القلب عائق في الجرذان

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

نموذج احتشاء عضلة القلب Murine باستخدام الربط الدائم للشريان التاجي الأمامي الأيسر

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج جديد لفشل القلب بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

نموذج جديد لفشل القلب بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

نموذج القوارض الإقفارية التامور سليمة

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>مقايسة مضان لتقييم نفاذية الحاجز البطاني القلبي الوعائي الدقيق في نموذج الفئران لنقص التروية / إعادة التروية

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

مقايسة مضان لتقييم نفاذية الحاجز البطاني القلبي الوعائي الدقيق في نموذج الفئران لنقص التروية / إعادة التروية

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج تجريبي لاحتشاء عضلة القلب لدراسة إصلاح القلب وإعادة تشكيله في الفئران بالضربة القاضية

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

نموذج تجريبي لاحتشاء عضلة القلب لدراسة إصلاح القلب وإعادة تشكيله في الفئران بالضربة القاضية

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

كاسباس 3 النشاط في الفئران اللوزة تقاس Spectrofluorometry بعد احتشاء عضلة القلب

Summary

Explore More Videos

احتشاء عضلة القلب الحاد في الفئران

قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي

الكمي النسيجي المزمن عضلة القلب عائق في الجرذان

نموذج احتشاء عضلة القلب Murine باستخدام الربط الدائم للشريان التاجي الأمامي الأيسر

نموذج جديد لفشل القلب بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران

نموذج جديد لفشل القلب بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران

نموذج القوارض الإقفارية التامور سليمة

مقايسة مضان لتقييم نفاذية الحاجز البطاني القلبي الوعائي الدقيق في نموذج الفئران لنقص التروية / إعادة التروية

مقايسة مضان لتقييم نفاذية الحاجز البطاني القلبي الوعائي الدقيق في نموذج الفئران لنقص التروية / إعادة التروية

نموذج تجريبي لاحتشاء عضلة القلب لدراسة إصلاح القلب وإعادة تشكيله في الفئران بالضربة القاضية